Nuestro protocolo permite la diseminación bacteriana y el seguimiento de la carga en un modelo experimental de sepsis neonatal en tiempo real, y la capacidad de correlacionar otros marcadores de enfermedad con la carga de patógenos. Este protocolo nos permite analizar longitudinalmente la sepsis en ratones neonatales individuales, proporcionando la oportunidad de observar y comparar la dinámica de infecciones y la diseminación bacteriana en tiempo real. Las pruebas preclínicas de las intervenciones para la sepsis neonatal se pueden realizar con este método, permitiendo el seguimiento de los efectos del control del huésped de las bacterias.
Comience colocando cachorros a medida en grupos de camada de dosis alta o baja dentro de un gabinete de nivel dos de bioseguridad. En el tercer o cuatro días posnatales, registre los pesos de todos los cachorros antes de la inoculación. Cargue jeringas de insulina con PBS o el inóculo E.coli lux de dosis alta o baja en el gabinete de bioseguridad y coloque las jeringas cargadas en hielo.
Coloque el neonato que se va a inyectar sobre una superficie limpia dentro del gabinete de bioseguridad y levante la piel en la nuca como para escabar al cachorro. Inserte el bisel de la aguja justo debajo de la piel en el espacio creado entre la piel y el músculo. Cuando la aguja se pueda sentir debajo de la piel, inyecte 50 microlitros del inoculante mientras libera simultáneamente la parte pellizcada de la piel para evitar el flujo de espaldas, luego retire la aguja lentamente y con cuidado.
Cuando todos los cachorros hayan sido inyectados de la misma manera, devuelva a los cachorros a sus presas. Inmediatamente después de la inyección y en los puntos de tiempo experimentales apropiados a partir de entonces, coloque la jaula con ratones neonatales infectados por E.coli lux y la presa en una campana de flujo laminar de nivel de bioseguridad dos y abra el software en el ordenador micro CT. Después de inicializar el sistema y esperar a que la temperatura del escenario se bloquee a 37 grados centígrados y la temperatura del CCD para bloquear a 90 grados Celsius negativos, coloque hasta cuatro cachorros anestesiados en la caja de imágenes en la cámara de imágenes en la posición propensa.
Cierre la puerta de la cámara de imágenes y seleccione la opción de imágenes de luminiscencia. Seleccione el filtro abierto y el siguiente y configure el filtro de excitación para bloquear y el filtro de emisión para que se abra. Seleccione 500, 520, 560, 580, 600 y 620 nanómetros.
A continuación, imagine a los cachorros antes de devolverlos a la jaula con la presa con monitoreo hasta la recuperación de la anestesia. En el punto final experimental adecuado, en un gabinete de bioseguridad, douse el neonato eutanizado con 70% de etanol para evitar la contaminación y colocar al animal en su lado derecho. Usa fórceps para agarrar la piel entre el abdomen y la pierna izquierda trasera y usa tijeras quirúrgicas de punta fina para hacer una incisión cutánea.
Luego continúe la incisión hacia la parte posterior del animal hasta que todo el bazo esté expuesto. Utilice los fórceps y tijeras para eliminar el bazo del abdomen y colocarlo en la solución adecuada para su aplicación aguas abajo. Para obtener los pulmones, pelar la piel del pecho por completo y entrar en la base del esternón con las tijeras sujetas verticalmente, cortar hacia arriba hasta que la caja torácica se divide.
Usa fórceps para agarrar los pulmones derecho e izquierdo individualmente y eliminar los pulmones de la cavidad torácica. Retire el corazón del tejido pulmonar con tijeras. A continuación, coloque el pulmón en la solución adecuada para su aplicación posterior.
Para realizar un ensayo de matanza bacteriana in vitro, coloque el bazo no infectado en un colador de nylon de 40 micrómetros dentro de un plato estéril de 60 milímetros de Petri que contenga cinco mililitros de PBS complementados con un suero bovino 10%fetal y utilice un émbolo estéril de tres mililitros para desagregar el tejido en una suspensión de una sola célula. Transfiera las células a un tubo centrífugo de 15 mililitros y recógelas por centrifugación. Resuspender el pellet en un mililitro de tampón de lysis de glóbulos rojos de tres a cuatro bazos.
Después de cinco minutos a temperatura ambiente, lave el bazo en PBS y resuspendir el pellet en 250 microlitros de PBS complementados con albúmina sérica bovina y dos EDTA milimolares para el conteo. A continuación, aísle las células positivas Ly6 B2 con las cuentas inmunomagnéticas adecuadas de acuerdo con el protocolo del fabricante y sembrar las células positivas Ly6 B2 enriquecidas a una vez 10 a las cinco células por cada 100 microlitros de media completa por densidad de pozo en una placa negra o blanca de 96 pozos. Preparar el inóculo bacteriano en la multiplicidad deseada de infección en un volumen final de 100 microlitros por pozo y añadir 100 microlitros de inóculo bacteriano o medio solo a cada pozo para una incubación de una hora en la incubadora de cultivo celular.
Al final de la incubación, reemplace el medio por 200 microlitros de medio fresco completo complementados con 100 microgramos por mililitro de gentamicina para eliminar cualquier bacteria extracelular restante y devolver las células a la incubadora de cultivo celular durante dos horas adicionales. Al final de la incubación y en cada punto de tiempo experimental a partir de entonces, utilice un lector de placas para medir la luminiscencia en cada pocólite de la placa de cultivo tapada antes de devolver la placa a la incubadora de cultivo celular hasta la siguiente lectura. Mientras que la mayoría de los animales exhiben altos niveles de bacterias en la sangre a las 24 horas después de la infección, algunos cachorros tienen bacterias bajas o indetectables en la sangre, lo que sugiere el aclaramiento de la infección en este momento.
Además, las células esplénicas positivas Ly6 B2 neonatales infectadas con E.coli bioluminiscente durante una hora antes de la eliminación de bacterias extracelulares y el posterior tratamiento con gentamicina expresaron un alto nivel de luminiscencia a las tres horas que disminuye con el tiempo indicativa del aclaramiento bacteriano. Las imágenes animales vivos de las bacterias luminiscentes confirman aún más el aumento de la diseminación y el crecimiento de bacterias en los cachorros neonatales a lo largo del tiempo a las 10 y 24 horas después de la infección. La toma de imágenes intravitales junto con la micro TC facilita la identificación de focos de infección en el cerebro, los pulmones y otros tejidos periféricos.
Los pulmones de algunos ratones altamente infectados demuestran regiones opacas consistentes con la consolidación inflamatoria que co-localizado a señales bacterianas luminiscentes. Estas regiones de presunto exudado inflamatorio no se observan en los pulmones de control no infectados. También se observa un aumento significativo en la expresión inflamatoria de citoquinas en relación con los controles en grupos de inóculos bajos y altos, correlacionando con un notable engrosamiento de la pared alveolar, aumento de la hemorragia alveolar e infiltración inflamatoria en estos animales.
Lo más importante a recordar es ejecutar la técnica adecuada al realizar las inyecciones y prestar estricta atención a los neonatos al administrar la anestesia. Usando esta técnica, podemos visualizar la sepsis neonatal en tiempo real para estudiar intervenciones y organizar terapias dirigidas a mejorar la respuesta inmune.
