Este trabajo fue apoyado por el BMBF Forschungsinitiative &quot;BioEnergie 2021 - Forschung für die Nutzung von Biomasse&quot; y el Cluster de Excelencia &quot;combustibles hechos a medida a partir de biomasa&quot;, que se financian a través de la Iniciativa de Excelencia por los gobiernos federal y estatales alemanas para promover la ciencia y la investigación en las universidades alemanas.

1. Crecimiento de tipo salvaje de N. tabacum plantas <ol><li> Para crecer N. tabacum L. cv. Plantas Petit Havana SR1 en suelo, coloque las semillas de tabaco en macetas llenas de tierra apropiadas para macetas normales para la germinación. Después de 2 semanas, la transferencia de las plantas de semillero a macetas individuales. Incubar las plantas en un invernadero con constante de 22 ° C (periodo de oscuridad) o 25 ° C (punto de luz) y 70% de humedad relativa del aire. Proporcionar iluminación en un 16/8 horas de luz / oscuridad ciclo (por ejemplo, Philips IP65 400 W lámparas; 180 mmol · s-1 · m-2; λ = 400-700 nm) y agua todos los días. </li></ol> 2. Expresión transitoria de TrCel5A y TrCel5A-mCherry Proteínas <ol><li> En condiciones estériles, recoger colonias individuales de Agrobacterium Agarobacterium (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RIFR) que contenían pTRAkc-ER-TrCel5A o pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry y traslado a un matraz Erlenmeyer que contiene 10 ml de extracto de levaduracaldo (YEB, preparado según las especificaciones del fabricante) medio y kanamicina (50 mg / ml), rifampicina (50 mg / ml), y carbenicilina (100 mg / ml) para la selección. Incubar durante 36-40 horas a 26 ° C y 180 rpm. Nota: El diseño de las construcciones apropiadas para la expresión de la proteína se encuentra fuera del alcance de este documento, pero para la orientación, los métodos de Maclean et al 13 y Munro y Pellham 14 se puede seguir para el diseño de construcción.. </li><li> Tomar 200 l de cada cultivo para inocular 20 ml de YEB con las concentraciones de antibióticos mencionados anteriormente e incubar en las mismas condiciones que antes. </li><li> Después de 36-40 horas, preinduce las culturas mediante la adición de 2 l acetosyringon (200 mM concentración final), 100 l 40% (w / v) de solución de glucosa y 200 l de 1 M de tampón MES pH 5,6. Incubar toda la noche. </li><li> Preparar 100 ml de un tampón de infiltración 2x ​​(sales basales 100 g / L de sacarosa, 3,6 g / L de glucosa, 8,6 g / l de Murashige y Skoog, Ajustar el pH a 5,6 utilizando hidróxido de potasio). </li><li> Mida OD 600 de las culturas con diluciones 1:5 hasta alcanzar una DO600 de 5-6. Cálculo de volumen de cultivo necesario para 30 ml de medio de infiltración a una DO de 600. Añadir 15 ml de tampón de infiltración 2x, a continuación, añadir H2O desionizada para hacer el buffer hasta 30 ml. </li><li> Tome las plantas de invernadero y utilizar una punta de pipeta de nick el lado abaxial de la 3 ª a la 5 ª hoja de la parte superior para facilitar la infiltración. </li><li> Utilice una punta de pipeta para nick el lado abaxial de las hojas para facilitar la infiltración. </li><li> Llene una jeringa con medio de infiltración y ponerlo (sin aguja) en una de las muescas hechas previamente. Apoyar jeringa con un dedo en el lado adaxial de la hoja. Presione el medio con cuidado en el tejido de las zonas de la hoja intervenales. Nota: Después de la infiltración, cultivar plantas en un invernadero bajo las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Además, mantener una proporción igual de untreated, las plantas no transitoria de expresión (NTEPs) como controles, en las mismas condiciones que las plantas se infiltró. </li></ol> 3. Evaluación de TrCel5A-mCherry Expresión en las hojas de las plantas <ol><li> Después de 4-6 días, tome las plantas se infiltró con A. tumefaciens que contienen pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry del invernadero y colocarlos en un cuarto oscuro para el análisis de fluorescencia. </li><li> Para visualizar la fluorescencia en secciones de hojas que expresan TrCel5A-mCherry, plantas de luz utilizando una fuente de luz portátil que emite luz verde a 515 nm con un filtro rojo (620-750 nm). Nota: En profundidad caracterización de expresión de la proteína en las hojas de las plantas se puede lograr por las hojas delgadas de seccionamiento con un vibrátomo y el examen bajo luz y microscopía de fluorescencia. Para ello siga los siguientes pasos: <ol><li> Cortar secciones pequeñas de aproximadamente 5 x 5 mm de tamaño de una hoja de infiltrado e incrustarlos en 4% de agarosa disuelta en 50 mM de tampón de fosfato (pH 5,7). </li><li> Cortadasección de 80-90 micras de tamaño de las hojas integrados utilizando un vibratomo. Colóquelos en un portaobjetos, cubra con un tampón o una hoja de cubierta y examinarlas con un microscopio a 10 aumentos con un detector de fluorescencia, usando la misma longitud de onda y el filtro se ha dicho. </li></ol></li></ol> 4. TrCel5A extracción de hojas de tabaco <ol><li> Corte los pedazos de hojas de tabaco para un peso aproximado de 1 g de plantas infectadas con A. tumefaciens que contienen pTRAkc-ER-TrCel5A y colocar en un mortero previamente enfriado con nitrógeno líquido. Añadir una cantidad apropiada de nitrógeno líquido para las muestras. Grind deja a polvo usando un mortero enfriado previamente. </li><li> Añadir 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM a la cuestión de la hoja del suelo y mezclar hasta que la mayoría de la materia de la hoja está en suspensión. Extracto de centrifugar a 15.000 xg durante 20 min a 4 ° C y tomar sobrenadante que contiene proteína. </li><li> CentriFuge el extracto a 15.000 xg durante 20 min a 4 ° C y tomar sobrenadante que contiene proteína-teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Deseche el sedimento. </li><li> Purificar parcialmente TrCel5A incubando el sobrenadante que contiene proteína a 55 º C durante 10 min. Dejar reposar a temperatura ambiente durante otros 10 min, a continuación se centrifuga a 15.000 xg durante 10 min a TA. Repita el proceso de purificación parcial para las plantas no infiltradas para obtener muestras de control. Utilice estas muestras para todos los siguientes experimentos. Nota: Las soluciones de proteínas pueden ser almacenadas a 4 ° C durante un máximo de 1 semana o a -20 ° C durante un máximo de 3 meses. </li><li> Repita el proceso de purificación parcial para las plantas no infiltradas para obtener muestras de control. Utilice estas muestras para todos los siguientes experimentos. Nota: Las soluciones de proteínas pueden ser almacenadas a 4 ° C durante un máximo de 1 semana o a -20 ° C durante un máximo de 3 meses. </li></ol> 5. SDS-PAGE, Western Blot, y azo-CMC Zymography de TrCel5A-mCherry &lt;/ P&gt; <ol><li> Compra o preparar un 12% (p / v) SDS-PAGE geles como por los métodos establecidos 15. </li><li> Disolver CMC en agua para obtener una (w / v) solución de 1,5%. Para hacer geles de CMC-SDS-PAGE, sustituir 1 ml de 1,5% de CMC de 1 ml de agua en una solución de 10 ml de mezcla de gel de SDS-PAGE, lo que resulta en un 0,1% (w / v) de CMC + 12% (w / v ) de la mezcla en gel de SDS-PAGE. Verter en gel normalmente. Nota: Asegúrese de que la CMC en la solución original se haya disuelto completamente por una combinación de agitación y calentamiento a 40 ° C (repetir directamente antes de preparar la solución de gel). </li><li> Desnaturalizar muestras por ebullición en presencia de SDS, según métodos establecidos 12. Como control positivo, utilizar una dilución 1:500 de una mezcla de celulasa disponibles comercialmente a partir de T. reesei, tales como T. reesei ATCC 26921. Como control negativo utilizar una solución de proteína preparada de manera similar a partir de hojas no infiltrados (NTEPs). </li><li> Llevar a cabo la electroforesis según los protocolos normales de 15,por ejemplo, uso 200 V durante ~ 50 min con la electroforesis se detuvo una vez que el frente de colorante alcanzó el fondo del gel. </li><li> Teñir uno en gel de SDS-PAGE utilizando 0,1% (w / v) azul brillante de Coomassie y destain utilizando una mezcla de ácido acético metanol / glacial. Nota: Tinción rápida y decoloración se puede realizar calentando suavemente la tinción y la decoloración se deben soluciones, es decir, mediante el uso de un horno de microondas durante ~ 15 segundos para calentar (pero no hervir) primero la tinción y luego las soluciones destaining, cambiando la solución de decoloración después de 10 min , o cuando se enfría, y repita con la nueva solución decolorante. </li><li> Realizar la transferencia Western de uno en gel de SDS-PAGE utilizando protocolos establecidos 16,17. Utilice los siguientes anticuerpos: un anticuerpo policlonal de conejo contra un anticuerpo anti-conejo región Fc etiqueta de His (primaria) y una cabra policlonal que ha sido conjugado con una fosfatasa alcalina (secundaria). Nota: anticuerpos secundarios se deben seleccionar para permitir la visualización utilizando nitroazul de tetrazolio chloride/5-bromo-4-chloro-3 &#39;-indolyphosphate sal p-toluidina (NBT / BCIP), tal como se describe 18. </li><li> Realizar la proteína en gel de replegamiento en el 0,15% (w / v) en gel de SDS-PAGE CMC incubando el gel en 1,5% (w / v) de β-ciclodextrina, tampón citrato-fosfato 20 mM, pH 6,5, a temperatura ambiente con agitación suave durante 15 min 19. </li><li> Deseche la solución de β-ciclodextrina y lavar brevemente el gel con H 2 O. Incubar a temperatura ambiente en 50 mM de tampón de acetato de sodio (pH 4,8) durante 15 min. Realizar CMC zimografía usando el 0,15% de CMC en gel de SDS-PAGE replegada incubando el gel en acetato de sodio 30 mM de tampón de pH 4,8 durante 20 min a 50 ° C. </li><li> Realizar CMC zimografía usando el replegada 0,15% (w / v) en gel de SDS-PAGE CMC incubando el gel en 30 mM de tampón de acetato de sodio (pH 4,8) durante 20 min a 50 ° C. </li><li> Teñir el gel durante 10 min utilizando un 0,1% w / v de solución de rojo Congo y destain durante 30 min o hasta que las bandas claras se observaron utilizando 1 M de NaCl. Se lava el gel con 0,3% (v / v) de ácido acético para obtener imágenes más clara. </li></ol> 6. 4-MUC Ensayo de actividad de TrCel5A <ol><li> Preparar una solución madre de 10 mM de 4 MUC en 50% (v / v) de metanol, y almacenarlo en la oscuridad a temperatura ambiente </li><li> Inmediatamente antes del ensayo, preparar una solución de trabajo 4-MUC 2x, compuesto de 1 mM de 4-MUC y 60 mM de acetato de sodio, pH 4,8. </li><li> Realice esta prueba sobre muestras que contienen 100 l de proteína de la hoja (con o sin TrCel5A inducible expresado), 100 l de una mezcla de celulasa disponibles comercialmente a partir de T. 1:1.000 reesei y H 2 O puro, respectivamente. Ejecutar cada muestra por triplicado. </li><li> Pipetear 100 l de la solución de trabajo 4-MUC en pocillos separados de una placa de 96 pocillos, a continuación, añadir 100 l de cada muestra. </li><li> Determinar 0 min punto de tiempo de 4-MU de fluorescencia a través de la espectroscopia de fluorescencia, usando una longitud de onda de excitación de 360 ​​nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm. </li><li> Incubar las placas durante 20min a 50 ° C, cubierto con tapas adhesivas para evitar la evaporación. Detenga la reacción de congelación (o mediante la combinación de 100 l 0,15 M de glicina, pH 10,0, y 100 l de muestra en una placa separada). </li><li> Determinar el punto final de 4-MU de fluorescencia a través de la espectroscopia de fluorescencia, usando una longitud de onda de excitación de 360 ​​nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm. Reste 0 min del final del estudio (20 min) punto de tiempo para obtener el cambio en los valores de fluorescencia. </li></ol> 7. Azo-carboximetil celulosa Ensayo de actividad de TrCel5A <ol><li> Preparar un stock de 1,5% (w / v) azo-CMC que se almacena a temperatura ambiente, y una solución de precipitación que contiene acetato 18 mM de zinc, 0,5 M de acetato de sodio, pH 5 y etanol 80% (v / v), en la sala de la tienda temperatura. </li><li> Inmediatamente antes del ensayo, preparar una solución de azo-CMC 2x de trabajo, compuesta de 1% (w / v) azo-CMC (en H2O) y 60 mM de acetato de sodio, pH 4,8. </li><li> Combine 50 l de muestra y 50 l de la obraing solución en tubos de 1,5 ml. </li><li> Las muestras de ensayo que contienen 50 l de proteína de la hoja (con o sin TrCel5A expresado transitoriamente); 100 l de una mezcla de celulasa disponibles comercialmente a partir de T. reesei diluido 1:1.000; y pura H 2 O. Muestras y los estándares manejados por triplicado. </li><li> Incubar las muestras durante 20 min a 50 ° C. Detener la reacción añadiendo 250 l de solución de precipitación. Vortex cada muestra vigorosamente durante 10 segundos para asegurar soluciones fueron completamente combinados. </li><li> Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 min y luego vórtice de nuevo. Centrifugar las muestras a 1000 xg durante 10 min. Tomar 200 l de cada sobrenadante de la muestra a una placa de 96 pocillos, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. </li><li> Ensayo usando espectroscopia de absorbancia a una longitud de onda de 590 nm. </li></ol> 8. Ensayo PAHBAH de TrCel5A <ol><li> Use una perforadora para cortar un círculo (~ 5,5 mm de diámetro) de papel de filtro. Añadir 100 l de NaAc 60 mM, pH 4,8, y 100 l de muestras, o bien que contienen proteína de la hoja (con o sin TrCel5A inducible expresado) o un T. comercial mezcla de celulasa reesei, diluido 1:1.000, y se incuba con círculos de papel de filtro durante 20 horas a 50 ° C con 300 rpm de temblar. Para cada muestra se incuba con papel de filtro, también se incuba una solución duplicado sin papel de filtro como se muestra-controles individuales. </li><li> Preparar un 330 mM p-hidroxi benzoico hidrazida (PAHBAH) Una solución disolviendo PAHBAH en H 2 O con la adición de 5 ml de HCl concentrado para un total de 100 ml de solución, y almacenarlos a temperatura ambiente. Nota: Los mejores resultados se consiguen mediante la adición de HCl a un volumen más pequeño de suspensión PAHBAH, es decir, 30 ml, que se agita bajo condiciones de temperatura para ayudar a la disolución antes de hacer el volumen a 100 ml con H 2 O. </li><li> Preparar PAHBAH solución B, que contiene citrato de sodio 50 mM, cloruro de calcio 10 mM y NaOH 500 mM y se almacena a temperatura ambiente. </li><li> Immediately antes del ensayo, preparar una solución de trabajo de 1,5 x de reactivo PAHBAH 1 ml a 9 ml de solución tampón, almacenar en hielo hasta su uso (para ser utilizado dentro de 4 horas). </li><li> Preparar muestras en termoestables 0,2 o 0,5 ml tubos. Combine 5 l de cada solución incubadas con papel de filtro (paso 8.1) 45 l de H 2 O y 100 l de solución de trabajo PAHBAH. Controles de muestra (muestras incubadas sin papel de filtro) deben utilizarse en las mismas concentraciones (5 l de la muestra, 45 2 O, la solución de trabajo 100 l PAHBAH l H). También prueba 5 normas (5 l) que contienen entre 0 y 0,2 g / l de glucosa, y H pura 2 O. Muestras y los estándares manejados por triplicado. </li><li> Incubar las muestras durante exactamente 10 min a 100 ° C, a continuación, enfriar a temperatura ambiente durante exactamente 10 min. Soluciones de la pipeta en una placa de 96 pocillos y ensayo espectroscópicamente a una longitud de onda de 410 nm. Reste la muestra-controles individuales (incubadas sin papel de filtro) a partir de muestras para obtener definitivavalores. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

La expresión recombinante de celulasas es un campo de gran interés, debido al deseo de los sistemas de producción de biocombustibles más eficientes 1. Las plantas ofrecen muchas posibilidades para la producción de celulasas éxito, con características tales como las técnicas de aprovechamiento económico y métodos autohidrólisis son propiedades muy deseables para la producción de biocombustibles a gran escala. Además, el uso de diferentes localizaciones para la producción de proteínas permite, en...

<html> La degradación de la biomasa lignocelulósica y su conversión en combustible líquido ha sido concebido como un método para reducir la dependencia de los combustibles fósiles. Un obstáculo importante en el establecimiento de sistemas de procesamiento de biomasa económicamente viables es en la degradación enzimática de la celulosa y la hemicelulosa 1. Sistemas de expresión de la planta muestran un gran potencial para la producción de enzimas a escala industrial. Los sistemas agrícolas a las plantas de cosecha económica y en el volumen ya están establecidos, como lo han sido durante miles de años. La producción de celulasas en las plantas es deseable debido a factores como la facilidad de autohidrólisis 2, y el potencial para maximizar el uso de niveles más bajos de la enzima mediante el aumento de la digestibilidad de paredes celulares de las plantas 1. Finalmente, los sistemas de la planta permiten la focalización de proteínas recombinantes a áreas específicas de las células vegetales y son capaces de modificar posttranslationally enzimas cuando sea necesario 3. ve_content &quot;&gt; Nicotiana tabacum (tabaco) es muy utilizado como organismo modelo para estudios de expresión de proteínas heterólogas en las plantas, debido a sus características de crecimiento y biomasa rápida acumulación 4. La expresión transitoria de las proteínas recombinantes es una técnica que permite la producción de proteínas en períodos de tiempo cortos 5, manteniendo al mismo tiempo la flexibilidad en cuanto a la localización y por lo tanto las modificaciones postraduccionales de las proteínas seleccionadas, es decir, celulasas. Esto permite la producción de la celulasa (s) para el análisis básico, y al mismo tiempo sentar las bases de nuevas estrategias de expresión en plantas. Usando una estrategia de expresión transitoria tal, una endoglucanasa de la familia de glicosil hidrolasa 5, Cel5A, derivado de la fúngica huésped de Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 se produce (en lo sucesivo referido como TrCel5A). TrCel5A es una proteína de 42 kDa que está glicosilado de forma nativa y es altamente activo en HYDroylzing cadenas de celulosa 7. La técnica de la expresión transitoria descrito aquí se basa en un sistema relativamente utilizado comúnmente, infiltrándose en las hojas de plantas con Agrobacteria lleva el gen de interés en un vector de expresión apropiado. Para permitir un análisis rápido de éxito la expresión in planta, TrCel5A también se puede expresar como una proteína de fusión con mCherry, una proteína fluorescente monomérico derivado originalmente de Discosoma sp. Proteína DsRed 8, con un adicional de seis residuos de histidina (His-tag) fusionado a el C-terminal (TrCel5A-mCherry). La expresión de la proteína de fusión heteróloga, TrCel5A-mCherry, por tanto, se puede controlar en el cultivo de plantas mediante el uso de la luz verde para examinar mCherry dispersión. Si se desea, las secciones delgadas de material de la planta pueden ser examinados bajo luz verde al microscopio para determinar la localización específica de la proteína. Para este trabajo, la señal y la transentarse péptidos fueron incorporados en la construcción, para localizar la exportación de proteínas heterólogas a la retículo endoplásmico 9. Para analizar la actividad de celulasas expresadas de plantas, incluyendo TrCel5A, una serie de pruebas de actividad de celulasa se puede ejecutar. Después de la extracción de las proteínas solubles totales de la planta, TrCel5A puede purificarse parcialmente usando una técnica de incubación térmica. El tamaño de la proteína se estableció utilizando SDS-PAGE seguido por transferencia Western. La zimografía puede ser utilizado para analizar la actividad contra los sustratos, por ejemplo, de celulosa que ha sido carboxi-metilado (haciendo carboximetilcelulosa: CMC) para la solubilidad 10. Actividad de la celulasa y glucosidasa se puede controlar utilizando el fluoróforo 4-metilumbeliferil (4-MU) asociado con β-D-celobiósido (combinado: 4-MUC). Otro método para evaluar la actividad endoglucanasa implica el análisis de espectrometría de CMC que se ha asociado con un azo-dye (Remazolbrilliant Blue R) 11. Además, la actividad de proteína de ambos endoglucanasas y una gama de celulasas se puede controlar por el uso de una prueba de análisis de azúcares, tales como la hidrazida p-hidroxi benzoico (PAHBAH) de ensayo 12. Estas técnicas se pueden utilizar para elucidar y cuantificar la actividad de la celulasa de interés expresada.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:308px;">4-methylumbelliferyl &#946;-D-cellobioside</td>
			<td style="width:127px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:156px;">M6018</td>
			<td style="width:232px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringon (concentrated)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - kanamycin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - rifampicin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - carbenicillin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibody - rabbit anti His(6) pAb</td>
			<td>ROCKLAND</td>
			<td>600-401-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb</td>
			<td>DIANOVA</td>
			<td>111-055-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Azo-carboxymethyl cellulose</td>
			<td>MEGAZYME</td>
			<td>S-ACMC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C4805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carboxymethyl cellulose</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3333.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C2730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Congo red</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>75768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coomasie brilliant blue G 250</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>9598.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D(+)-glucose</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>K928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter paper - Rotilabo blotting paper</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>CL67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NBT/BCIP</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>72091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES buffer</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium citrate</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>20765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Soil, Einheitserde classic&#160;</td>
			<td>PATZER GMBH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrometer - Infinite M200</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S-5390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Hydroxy benzhydrazide&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H9882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV light source - BLAK RAY</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibratome - VT1000S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of recombinant cellulase cel5a from trichoderma reesei in tobacco plants

Enzimas degradantes de celulosa, celulasas, son objeto de la investigación y los intereses industriales. La preponderancia de estas enzimas en los organismos difíciles-a la cultura, como los hongos de fomento de hifas y bacterias anaerobias, ha acelerado el uso de tecnologías recombinantes en este campo. Métodos de expresión vegetales son un sistema conveniente para la producción a gran escala de enzimas y otras proteínas industrialmente útiles. En la presente memoria, se demuestran los métodos para la expresión transitoria de una endoglucanasa fúngica, Trichoderma reesei Cel5A, en Nicotiana tabacum. El éxito de expresión de la proteína se muestra, supervisado por fluorescencia utilizando una proteína de fusión mCherry-enzima. Además, una serie de pruebas básicas se utilizan para examinar la actividad de T. transitoriamente expresó reesei Cel5A, incluyendo SDS-PAGE, transferencia Western, zimografía, así como la fluorescencia y ensayos de degradación del sustrato con base de tinte. El sistema aquí descrito se puede utilizar para producir una célula activaULASE en un corto período de tiempo, a fin de evaluar el potencial de la producción en plantas a través de sistemas de expresión constitutivos o inducibles.

TrCel5A y TrCel5A-mCherry se expresaron con éxito en plantas de tabaco usando el sistema de expresión transitoria (Figuras 1A y 1B). El examen del patrón de expresión de la proteína de fusión TrCel5A-mCherry reveló hojas sanas (Figura 1C), que mostró que la expresión de proteínas generalizada con luz verde (Figura 1D). La extracción de las proteínas solubles totales se realizó en plantas de tabaco que tenían ho...

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Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Las plantas de tabaco se usaron para producir una celulasa fúngica, TrCel5A, a través de un sistema de expresión transitorio. La expresión podría ser monitoreado usando una proteína de fusión fluorescente, y la actividad de la proteína se caracterizó después de la expresión.

Expresión recombinante de celulasa de Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; En plantas de tabaco

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

expression-recombinant-cellulase-cel5a-from-trichoderma-reesei

Research

JoVE Journal

Environment

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

12.8K vistas.  RWTH Aachen University.  Las plantas de tabaco se usaron para producir una celulasa fúngica, TrCel5A, a través de un sistema de expresión transitorio. La expresión podría ser monitoreado usando una proteína de fusión fluorescente, y la actividad de la proteína se caracterizó después de la expresión. 

Video: Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Expresión génica transitoria en tabaco utilizando Asamblea Gibson y la pistola de genes

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Investigación

Medio ambiente

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

Transcripción y metabolito de perfiles para la Evaluación de árbol Tabaco y Poplar como materia prima para la industria basada en Bio

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Flujos de nutrientes minerales y sustancias tóxicas de medición en plantas con Trazadores Radiactivos

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

El uso de alta resolución Termografía Infrarroja (HRIT) para el Estudio de Hielo La nucleación y Hielo Propagación de Plantas

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That represents 100 million tons of food being destroyed or diverted to non-human consumption each year. Aflatoxins are powerful carcinogens normally accumulated by the fungi Aspergillus flavus and A. parasiticus in cereals, nuts, root crops and other agricultural products. Silencing of five aflatoxin-synthesis genes by RNA interference (RNAi) in peanut plants was used to control aflatoxin accumulation following inoculation with A. flavus. Previously, no method existed to analyze the effectiveness of RNAi in individual peanut transgenic events, as these usually produce few seeds, and traditional methods of large field experiments under aflatoxin-conducive conditions were not an option. In the field, the probability of finding naturally contaminated seeds is often 1/100 to 1/1,000. In addition, aflatoxin contamination is not uniformly distributed. Our method uses few seeds per transgenic event, with small pieces processed for real-time PCR (RT-PCR) or small RNA sequencing, and for analysis of aflatoxin accumulation by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). RNAi-expressing peanut lines 288-72 and 288-74, showed up to 100% reduction (p&#8804;0.01) in aflatoxin B1 and B2 compared to the control that accumulated up to 14,000 ng.g-1 of aflatoxin B1 when inoculated with aflatoxigenic A. flavus. As reference, the maximum total of aflatoxins allowable for human consumption in the United States is 20 ng.g-1. This protocol describes the application of RNAi-mediated control of aflatoxins in transgenic peanut seeds and methods for its evaluation. We believe that its application in breeding of peanut and other crops will bring rapid advancement in this important area of science, medicine and human nutrition, and will significantly contribute to the international effort to control aflatoxins, and potentially other mycotoxins in major food crops.

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

We demonstrate a method for the analysis of aflatoxins and transgene expression in peanut seeds that contain RNA-interference signals for silencing aflatoxin-synthesis genes in the fungus Aspergillus flavus. RNAi-mediated control of mycotoxins in plants has not been reported previously.

Control de RNAi mediada por aflatoxinas en Maní: método para analizar la producción de micotoxinas y expresión transgénica en el cacahuete /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Patosistema

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

Enhancement of the Initial Growth Rate of Agricultural Plants by Using Static Magnetic Fields

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing seeds of Garden Balsam (Impatiens balsamina), Mizuna (Brassica rapa var. japonica), Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis), and Mescluns (Lepidium sativum). We applied magnets under the culture dish. During the 4 days of application, we observed that the stem and root length increased. The group subjected to magnetic field treatment (n = 10) showed a 1.4 times faster rate of growth compared with the control group (n = 11) in a total of 8 days (p &#60;0.0005). This rate is 20% higher than that reported in previous studies. The tubulin complex lines did not have connecting points, but connecting points occur upon the application of magnets. This shows complete difference from the control, which means abnormal arrangements. However, the exact cause remains unclear. These results of growth enhancement of applying magnets suggest that it is possible to enhance the growth rate, increase productivity, or control the speed of germination of plants by applying static magnetic fields. Also, magnetic fields can cause physiological changes in plant cells and can induce growth. Therefore, stimulation with a magnetic field can have possible effects that are similar to those of chemical fertilizers, which means that the use of fertilizers can be avoided.

The goal of this protocol is to demonstrate the acceleration of the initial growth rate of plants by applying static magnetic fields with no external energy.

Mejora de la tasa de crecimiento inicial de las plantas agrícolas mediante el uso de campos magnéticos estáticos

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing ...

Assessment of Methane and Nitrous Oxide Fluxes from Paddy Field by Means of Static Closed Chambers Maintaining Plants Within Headspace

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based on the diffusion theory. A known volume of air overlaying a defined soil area is enclosed within a parallelepiped cover (named &#34;chamber&#34;), for a defined period of time. During this enclosure period, gases (methane (CH4) and nitrous oxide (N2O)) move from soil pore air near their microbial source (i.e., methanogens, nitrifiers, denitrifiers) to the chamber headspace, following a natural concentration gradient. Fluxes are then estimated from chamber headspace concentration variations sampled at regular intervals throughout the enclosure and then analyzed with gas chromatography. Among the techniques available for GHG measurement, the static closed chamber method is suitable for plot experiments, as it does not require large homogenously treated soil areas. Furthermore, it is manageable with limited resources and can identify relationships among ecosystem properties, processes, and fluxes, especially when combined with GHG driving force measurements. Nevertheless, with respect to the micrometeorological method, it causes a minimal but still unavoidable soil disturbance, and allows a minor temporal resolution. Several phases are key to the method implementation: i) chamber design and deployment, ii) sample handling and analyses, and iii) flux estimation. Technique implementation success in paddy fields demands adjustments for field flooding during much of the cropping cycle, and for rice plant maintenance within the chamber headspace during measurements. Therefore, the additional elements to be considered with respect to the usual application of non-flooded agricultural soils consist of devices for: i) avoiding any unintended water disturbance that could overestimate fluxes, and ii) including rice plants within the chamber headspace to fully consider gases emitted through aerenchyma transportation.

The overall goal of this protocol is to measure greenhouse gas emissions from paddy fields using the static closed chamber technique. The measurement system needs specific adjustments due to the presence of both a permanent water layer in the field and of the plants within the chamber headspace.

Evaluación de metano y óxido nitroso flujos de arrozal mediante estática cerrado cámaras de mantenimiento de plantas en espacios vacíos

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based ...

Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast make 2-dimensions (2D) infrared images somewhat difficult to interpret. Viewing an IR image or the video of plants freezing in 3 dimensions (3D) would allow a more accurate identification of sites for ice nucleation as well as the progression of freezing. In this paper, we demonstrate a relatively simple means to produce a 3D infrared video of a strawberry plant freezing. Strawberry is an economically important crop that is subjected to unexpected spring freeze events in many areas of the world. An accurate understanding of the freezing in strawberry will provide both breeders and growers with more economical ways to prevent any damage to plants during freezing conditions.
The technique involves a positioning of two IR cameras at slightly different angles to film the strawberry freezing. The two video streams will be precisely synchronized using a screen capture software that records both cameras simultaneously. The recordings will then be imported into the imaging software and processed using an anaglyph technique. Using red-blue glasses, the 3D video will make it easier to determine the precise site of ice nucleation on leaf surfaces.

Here, we present a protocol to image a strawberry plant freezing in 3 dimensions. Two infrared cameras positioned at slightly different angles are used to produce a red-blue anaglyph video to observe the freezing of the plant in 3 dimensions.

Protocolo para la producción de Video infrarroja tridimensional de congelación en las plantas

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many countries around the world. Severe yield losses are caused by direct feeding, and even more importantly, also by the transmission of more than 100 harmful plant pathogenic viruses. As for other invasive pests, increased international trade facilitates the dispersal of B. tabaci to areas beyond its native range. Inspections of plant import products at points of entry such as seaports and airports are, therefore, seen as an important prevention measure. However, this last line of defense against pest invasions is only effective if rapid identification methods for suspicious insect specimens are readily available. Because the morphological differentiation between the regulated B. tabaci and close relatives without quarantine status is difficult for non-taxonomists, a rapid molecular identification assay based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology has been developed. This publication reports the detailed protocol of the novel assay describing rapid DNA extraction, set-up of the LAMP reaction, as well as interpretation of its read-out, which allows identifying B. tabaci specimens within one hour. Compared to existing protocols for the detection of specific B. tabaci biotypes, the developed method targets the whole B. tabaci species complex in one assay. Moreover the assay is designed to be applied on-site by plant health inspectors with minimal laboratory training directly at points of entry. Thorough validation performed under laboratory and on-site conditions demonstrates that the reported LAMP assay is a rapid and reliable identification tool, improving the management of B. tabaci.

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

This paper reports the protocol for a rapid identification assay for Bemisia tabaci based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology. The protocol requires minimal laboratory training and can, therefore, be implemented on-site at points of entry for plant imports such as seaports and airports.

Un ensayo de amplificación isotérmica (lámpara) mediada por el lazo para identificación rápida de Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water distribution in plant tissues in combination with freeze fixation techniques using liquid nitrogen (LN2). For woody species, however, preparations for observing the xylem transverse-cut surface involve some difficulties due to the orientation of wood fibers. Additionally, higher tension in the water column in xylem conduits can occasionally cause artifactual changes in water distribution, especially during sample fixation and collection. In this study, we demonstrate an efficient procedure to observe the water distribution within the xylem of woody plants in situ&#160;by using a cryostat and cryo-SEM. At first, during sample collection, measuring the xylem water potential should determine whether high tension is present in the xylem conduits. When the xylem water potential is low (&#60; ca. &#8722;0.5 MPa), a tension relaxation procedure is needed to facilitate better preservation of the water status in xylem conduits during sample freeze fixation. Next, a watertight collar is attached around the tree stem and filled with LN2&#160;for freeze fixation of the water status of xylem. After harvesting, care should be taken to ensure that the sample is preserved frozen while completing the procedures of sample preparation for observation. A cryostat is employed to clearly expose the xylem transverse-cut surface. In cryo-SEM observations, time adjustment for freeze-etching is required to remove frost dust and accentuate the edge of the cell walls on the viewing surface. Our results demonstrate the applicability of cryo-SEM techniques for the observation of water distribution within xylem at cellular and subcellular levels. The combination of cryo-SEM with non-destructive in situ observation techniques will profoundly improve the exploration of woody plant water flow dynamics.

Observing the water distribution within the xylem provides significant information regarding water flow dynamics in woody plants. In this study, we demonstrate the practical approach to observe xylem water distribution in situ&#160;by using a cryostat and cryo-SEM, which eliminates artifactual changes in the water status during sample preparation.

Distribución de agua de Xylem en plantas leñosas visualizada con un microscopio electrónico de barrido crio-

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...