La transformación mediada por agrobacterium es un método fácil para producir plantas de papa modificadas genéticamente. Con el fin de entender las funciones genéticas específicas y su contribución a la fisiología de los órganos. La transformación por agrobacterium rhizogenes es una herramienta robusta para evaluar rápidamente las raíces que funcionan con genes, ya que la transformación de agrobacterium tumefaciens puede obtener resultados similares.
Demostrando este procedimiento estarán Sandra Fernandez-Pinan, una post-doc, y Jennifer Lopez, una estudiante de maste5r de nuestro laboratorio. Comience por cultivar una sola colonia de agrobacterium durante la noche en cinco mililitros de caldo de extracto de levadura, o medio YEB, complementado con antibióticos en un tubo centrífugo de 50 mililitros a 28 grados centígrados, a 200 rotaciones por minuto. Para la transformación de a-tumefaciens, mida la densidad óptica a la mañana siguiente.
Cuando la densidad óptica a 600 nanómetros, o OD 600 alcanza 0,6 a uno, centrifuga un mililitro del cultivo de agrobacteria y resuspend el pellet en un mililitro de medio YEB fresco sin antibióticos. Después del segundo lavado, resuspender el pellet en medio YEB fresco sin antibióticos, a la concentración adecuada para obtener un OD final 600 de 0.8, y colocar las células bacterianas en hielo. Para la transformación de la planta utilizando A.rhizogenes, transfiera cuidadosamente una planta donante de un cultivo medio de 2MS a una placa cuadrada de 120 por 120 milímetros, y utilice una aguja quirúrgica para inyectar tres microlitros de un cultivo de A.rhyzogenes a diferentes internodos de tallo como sea posible.
A continuación, transfiera inmediatamente toda la planta a una nueva placa cuadrada que contenga un medio sólido de la NIEBLA, complementada con 0,1 mililosiones de acetosyringona. Después de colocar una segunda planta en la misma placa, transformada de la misma manera, sellar la placa con cinta quirúrgica, y colocar la placa verticalmente dentro de un gabinete de crecimiento durante cuatro días. Transferir la planta a una placa cuadrada con medio de NIEBLA complementado con cefotaxime sódico para matar a los A.rhizogenes y colocar la placa sellada verticalmente dentro de un armario de crecimiento durante cuatro días.
Después de 10 a 12 días, aparecerán nuevas raíces peludas. Su transformación puede ser confirmada por un microscopio estéreo fluorescente. En este momento, extirpar las raíces nativas de cada planta, y transferir las plantas a una nueva placa cuadrada con medio de LAMAS, complementado con cefotaxime sódico para matar a los A.rhizogenes.
Para obtener una planta compuesta, dejar crecer las raíces peludas transgénicas durante otras tres a cuatro semanas en el medio de la MS, complementado con cefotaxime sódico. Para la transformación de plantas utilizando A.tumefaciens. Cortar y colocar una hoja de una planta de tres a cuatro semanas de edad en un plato de petri, y utilizar un bisturí para hacer de uno a tres cortes transversales desde el centro de la hoja a los bordes sin cortar las piezas de la hoja.
y excluir el pecíolo. Coloque inmediatamente la hoja en un plato de petri que contenga 10 mililitros de medio líquido 2MS fresco, lado abaxial hacia arriba, y cubra la placa. Agregue rápidamente 80 microlitros del cultivo A.tumefaciens al medio líquido y revuelva suavemente el medio durante un minuto para distribuir homogéneamente la solución bacteriana.
A continuación, selle cuidadosamente y cubra la placa con papel de aluminio para una incubación de dos días en una cámara Celsius de 24 grados. Al final del período de transformación, transfiera las hojas del lado abaxial hacia arriba, al medio inductor insensible, raspado con pinzas para una incubación de una semana en el gabinete de crecimiento. Al final de la incubación, transferir las hojas, lado abaxial hacia arriba, en el medio inductor de brotes raspados de pinza, e incubar las hojas en un gabinete de crecimiento.
Cuando los conductos emergidos miten alrededor de dos centímetros de altura, corte tres conductos emergentes de cada insensible. Coloque hasta cinco eventos de transformación de conductos diferentes en frascos de cultivo individuales que contengan un medio MG complementado con cefotaxima sódico para permitir el enraizamiento, y etiquete el subconjunto como apropiado para una incubación de tres a cuatro semanas en el gabinete de crecimiento hasta que los conductos sean vigorosos. Al final de la incubación, seleccionar la planta más vigorosa de cada evento, y cortar los segmentos apicales del conducto con tres a cuatro internodos de cada planta.
Colocar los segmentos en un matraz de cultivo que contenga 2MS medio complementado con cefotaxima sódico y cultivar las plantas hasta que desarrollen conductos y raíces vigorosas. Para realizar un ensayo genético de reportero histoquímico beta-glucuronidasa o GUS, fije las raíces de un cultivo vegetal in vitro de dos a tres semanas con acetona 90% refrigerada durante 20 minutos en hielo. Al final de la fijación, lave las raíces dos veces en agua destilada y trate las raíces con una solución fresca de tinción de GUS al vacío durante 20 minutos.
Al final del tratamiento al vacío, coloque las raíces en 37 grados celsius en la oscuridad durante unas cuatro horas. Cuando un color azul es visible, lave las raíces dos veces con 70% de etanol, y visualice la tinción bajo un microscopio de campo brillante. Las raíces peludas transformadas exhiben una florescencia roja cuando se ilumina con luz verde, mientras que el agrobacterium no transformado de control negativo no demuestra tal florescencia, lo que indica la idoneidad del marcador de transformación rojo DS para identificar raíces peludas transgénicas.
Aquí, se muestran manchas GUS en raíces de plantas transgénicas obtenidas por A.tumefaciens y raíces peludas transgénicas obtenidas por A.rhizogenes. Como se observa, las raíces transformadas con A, tumefaciens y cultivadas in vitro, demuestran manchas azules en la endodermis, una capa celular entre la corteza y la estela. En raíces más desarrolladas, el etiquetado azul es irregular en la capa externa, correspondiente a la exodermis.
En raíces peludas transformadas obtenidas por A.rhizogenes, y cultivadas en hidroponía, el marcador GUS se encuentra específicamente dentro de la endodermis en la aparición de raíces laterales en las zonas heridas y en la exodermis. Además de ser un método rápido, las raíces transgénicas obtenidas con agrobacterium rhizogenes también llevaron el ADN del plásmido inductor de raíces, que puede desregular algunos procesos directamente controlados. Las raíces peludas transgénicas obtenidas con agrobacterium rhizogenes se pueden mantener mientras disparan, pero alternativamente pueden estar en el lugar hasta que se propaguen in vitro para la producción masiva de tránsito.
La transformación de la patata proporciona una buena herramienta para comprobar la función genética y la activación del promotor, y también para producir reglas metodológicas en una especie de alto interés agronómico. El organismo modificado genéticamente debe desecharse de forma segura después de su uso para evitar la contaminación ambiental. Además, la solución de gas contiene derivados tóxicos de cianuro, por lo que la protección contra el desgaste y deseche la solución de forma segura.
