Las construcciones optogenéticas entregadas viralmente permiten una caracterización electrofisiológica detallada de la fisiología y plasticidad de sinapsis específicas en cortes cerebrales agudos. Las principales ventajas de activar las sinapsis optogenéticamente es la capacidad de estudiar vías de largo alcance y la estimulación selectiva de axones que no están separados anatómicamente. Lisa Kinnavane, investigadora asociada de nuestro laboratorio, demostrará el procedimiento.
Para empezar, cargue una jeringa Hamilton en una bomba de jeringa de microinyección conectada a un brazo móvil montado en un marco estereotáxico. Luego coloque una alícuota de cinco microlitros del virus en una microcentrífuga. Gire el tubo durante unos segundos y pipete dos microlitros de la preparación viral en la tapa del tubo.
Para llenar la jeringa con la preparación viral, vea la punta de la aguja con un microscopio quirúrgico. Luego coloque manualmente el bolo del virus en la punta de la aguja y retire el émbolo de la jeringa usando los controles de la bomba. Ajuste el volumen de inyección de la bomba a 300 nanolitros y el caudal a 100 nanolitros por minuto.
Haga funcionar la bomba y confirme el flujo adecuado observando la gota del virus en la punta de la aguja. Absorba el virus en un bastoncillo de algodón y limpie la aguja con etanol al 70%. A continuación, usando los tornillos del ajustador en el marco estereotáxico, navegue por la punta de la aguja hasta el bregma y tome nota de las mediciones estereotáxicas observadas en las tres escalas vernier del marco.
Sume o reste estas distancias de las coordenadas bregma. Haga un orificio de rebabas en la superficie del cráneo usando un microtaladro montado en el brazo estereotáxico. Inserte la aguja en el cerebro en la coordenada dorsoventral predeterminada e infunda un volumen predeterminado de la preparación viral.
Después de la infusión, dejar la aguja in situ durante 10 minutos para permitir la difusión del bolo. Luego retire la aguja y haga funcionar la bomba para asegurarse de que la aguja no esté bloqueada. Dos semanas después de la inyección viral, eutanasia a la rata, diseccionar rápidamente todo el cerebro y transferirlo a la solución de corte de sacarosa.
Con una cucharadita de metal, levante el cerebro, deseche el exceso de solución y colóquelo en un papel de filtro. Con un bisturí, retire el cerebelo y corte el cerebro en el plano coronal aproximadamente a la mitad de su longitud. La mitad posterior es el bloque de tejido LEC.
Devuelva el bloque de tejido y el cerebro restante a la solución de corte de sacarosa. A continuación, coloque una gota de pegamento de cianoacrilato en una plataforma de vibratomo y extiéndala en una capa delgada. Luego, con una cucharadita, elija el bloque de tejido LEC y transfiéralo al parche de pegamento, de modo que el corte coronal anterior se haya adherido.
Instale la etapa en la cámara de tejido del vibratomo y vierta rápidamente suficiente solución de corte de sacarosa para sumergir el tejido. Después de orientar la superficie ventral del bloque de tejido hacia la cuchilla, corte cortes de 350 micrómetros de espesor de ventral a dorsal usando una velocidad lenta de avance de la cuchilla. Por lo general, se pueden obtener siete rebanadas por hemisferio.
Transfiera las rodajas a la cámara de recolección de rebanadas. Luego coloque la cámara de recolección en un baño de agua de 34 grados centígrados durante una hora antes de volver a la temperatura ambiente. Coloque el resto del cerebro en paraformaldehído durante 48 horas.
Para la identificación de la célula objetivo, coloque el corte en la cámara de grabación e inmovilícelo con un anclaje de corte. Bajo bajo aumento, usando iluminación infrarroja, navegue hasta la capa LEC cinco. Luego cambie al objetivo de inmersión en agua de alto aumento e identifique las neuronas piramidales.
Marque la posición de la celda en el monitor con cinta adhesiva. A continuación, para formar una abrazadera de parche de células completas, fabrique una micropipeta de vidrio de borosilicato y llénela con una solución de registro intracelular. Coloque la micropipeta llena en el soporte del electrodo y aplique presión positiva soplando con fuerza en una boquilla conectada al puerto lateral del soporte del electrodo.
Eleve el objetivo del microscopio de tal manera que se forme un menisco e inserte el electrodo en el menisco hasta que se pueda ver en el microscopio. Abra la ventana Prueba de sellado y determine si la resistencia de la pipeta es de tres a cinco megaohmios. Luego toque la celda identificada con una punta de pipeta, lo que resulta en una hendidura en la membrana celular.
A continuación, aplique presión negativa por succión en la boquilla, aumentando la resistencia de la pipeta. Continúe aplicando presión negativa gradualmente hasta que la membrana celular se rompa, lo que resulta en transitorios de capacitancia de células completas. Para ingresar a la configuración actual de la abrazadera, use un LED montado dirigido a la trayectoria de luz del microscopio con cubos de filtro y óptica apropiada, y aplique pulsos de luz a la rebanada a través del objetivo 40X.
Entregar trenes de múltiples pulsos de luz a cinco hercios, 10 hercios y 20 hercios para investigar las propiedades de liberación presináptica. Para permitir que la biocitina llene la neurona, espere al menos 15 minutos después de ingresar a toda la configuración celular. En la abrazadera de voltaje, monitoree la capacitancia de la membrana y la resistencia de entrada.
Luego, retire lentamente la pipeta a lo largo del ángulo de aproximación lejos del soma de la célula, observando la lenta desaparición de los transitorios de capacitancia y la corriente de membrana, lo que indica el resellado de la membrana celular y la formación de un parche de afuera hacia afuera en la punta de la pipeta. Coloque la rebanada en paraformaldehído en una placa de 24 pocillos e incube durante la noche. Usando medio OCT, conecte un bloque de tejido al disco de la muestra de criostato.
Para congelar el tejido, coloque el isopentano en un recipiente apropiado y sumerja el disco de la muestra, asegurándose de que el tejido esté por encima del nivel del isopentano. Luego baje el recipiente de isopentano en nitrógeno líquido y permita que el tejido se congele. Una vez que el tejido esté completamente congelado, deje el bloque de tejido en la cámara de criostato a menos 20 grados centígrados durante 30 minutos para permitir que la temperatura del bloque se equilibre.
Después del equilibrio, corte secciones de 40 micrómetros de espesor en el criostato y use un pincel fino para guiar las secciones de la cuchilla. Adhiera estas secciones congeladas a un portaobjetos de microscopio de vidrio recubierto de poli-L-lisina a temperatura ambiente tocando el portaobjetos con las secciones. Después de agregar 150 microlitros de medio de montaje a cada portaobjetos, aplique el cubreobjetos y elimine cualquier burbuja de aire presionando suavemente el cubreobjetos.
Cubra los portaobjetos para protegerlos contra el fotoblanqueo y déjelos secar al aire durante 12 horas. Luego, con un microscopio de fluorescencia, examine la ubicación del sitio de inyección viral. Para la tinción de biocita, incubar las rodajas en peróxido de hidrógeno al 3% en PBS durante 30 minutos para bloquear cualquier actividad de la peroxidasa endógena.
Luego lave las rodajas de cerebro con PBS hasta que no se vean más burbujas de oxígeno. A continuación, incubar las rodajas durante tres horas en una solución de complejo HRP biotinilada al 1% en PBS que contiene 0,1% Triton X-100. Después de seis lavados PBS, incubar cada rebanada en solución DAB hasta que la tinción de biocitina de las estructuras neuronales se haga visible.
Detenga la reacción transfiriendo las rodajas en PBS frío. Luego monte las rodajas en los portaobjetos del microscopio de vidrio con un cepillo. Después de eliminar el exceso de PBS, agregue el medio de montaje.
Cubra las rodajas con cubrebocas y déjelas secar al aire, como se demostró anteriormente. Se localizó y parcheó una célula piramidal sana. Si se requiere la identificación de células postsinápticas, una célula que exprese el marcador fluorescente debe localizarse utilizando óptica de campo amplio.
Los pulsos de luz individuales de dos milisegundos dieron como resultado potenciales postsinápticos excitatorios optogenéticos de forma de onda simple. La plasticidad a corto plazo de la sinapsis se examina aplicando trenes de estimulación lumínica de cinco, 10 y 20 hercios. Mientras se investigaba la plasticidad a largo plazo, la adición del agonista colinérgico carbachol al aCSF circulante durante 10 minutos causó una depresión a largo plazo que todavía era evidente 40 minutos después de la eliminación del ligando.
La longitud del sitio de inyección se examinó histológicamente. El reportero fluorescente mCherry se localizó en las capas más profundas de la corteza prelímbica e infralímbica. Además, la tinción de una célula llena de biocitina confirmó su ubicación y morfología.
Los pasos críticos de este protocolo son la transducción precisa de la región aferente del cerebro, que se puede verificar post hoc, y la disección rápida del cerebro al preparar cortes agudos. Este procedimiento se combina fácilmente con el marcado fluorescente de un tipo de célula individual, como una subclase particular de interneuronas. Para hacer esto, usaríamos un animal transgénico que expresa una recombinasa en ese tipo de célula en particular.
Las construcciones optogenéticas entregadas viralmente han permitido rápidos avances en los campos de los sistemas y la neurociencia de circuitos.
