Gli autori vorrebbero riconoscere Lloyd Ung per l&#39;input costruttivo nelle prime versioni di questa tecnica, il dottor Jeremy Agresti per le punte di design tappo a pressione, e il dottor Dongping Qi per il suo aiuto nella fabbricazione il tappo di pressione. Siamo grati ai laboratori di M. Teitell e P. Gunaratne per fornire una varietà di campioni di cellule per il test. Siamo grati per la National Science Foundation (CARRIERA Premio DBI-1254185), la UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, e la UCLA clinica e traslazionale Science Institute per sostenere questo lavoro.

1 Microfluidic Device Design NOTA: Il disegno dispositivo ha quattro regioni funzionali di base: porta di entrata, filtro cellule, matrice costrizione, e la porta di uscita (Figura 1). Il disegno complessivo può essere applicato a una vasta gamma di tipi di cellule, con piccoli aggiustamenti alle dimensioni. Purché ecco alcuni consigli di progettazione di base insieme con i parametri del dispositivo che sono efficaci per una selezione di entrambe le cellule primarie e fotografati. <ol><li> Selezionare la larghezza dei canali di matrice costrizione (Figura 1B) a circa il 30-50% del diametro medio delle cellule; Questa costrizione-cellula dimensioni quoziente desse un risultato deformazione delle cellule significativo ma intasamento minimo. Dato un tipo di cellula che non è stato testato in precedenza, è prudente progettare una gamma di larghezze di costrizione da ~ 30-50% il diametro delle cellule per trovare la larghezza ottimale. Come con molti tipi di dispositivi microfluidici, oltre 120 maestri stampi dispositivo possono essere modellati su un peccatogle wafer di silicio da 4 pollici, che consente una serie di disegni di dispositivi diversi per essere fabbricato in un unico processo di fabbricazione. </li><li> Selezionare l&#39;altezza del canale di almeno il 50% del diametro della cellula; ciò assicura la cella è confinata in 2 dimensioni. Per evitare il collasso canale durante l&#39;incollaggio, accertarsi che le proporzioni canale non meno di 1:10 è (altezza: larghezza) in tutto il dispositivo. Per i canali che devono superare il rapporto di aspetto, aggiungere posti di sostegno per prevenire il collasso. Pali di sostegno spazio ad una distanza che è almeno il doppio del diametro delle cellule, per non ostacolare il flusso delle cellule. </li><li> Include un filtro nei porti di entrata per rimuovere i detriti e disaggregare ammassi cellulari (Figura 1B). Regolare la dimensione e la spaziatura dei posti di filtro in modo che la distanza che separa i messaggi è approssimativamente pari ad un diametro di cella. NOTA: Il limite inferiore di dimensioni funzione è impostata dalla risoluzione alla quale la maschera litografica viene stampato. Assicurarsi che tutte le funzioni sono all&#39;interno delle resoluzione limite specificato dal fornitore di maschera. </li></ol> 2. Le forniture e Preparazione NOTA: Prima di iniziare qualsiasi esperimento, i seguenti elementi devono essere preparati. Una schematica dell&#39;intero configurazione è dato in Figura 1. <ol><li> Realizzare il maestro dispositivo utilizzando tecniche standard per microlavorazioni litografica 14,15. Verificare l&#39;altezza delle caratteristiche modellata utilizzando un profilometro. NOTA: Mentre master possono essere facilmente fabbricati in un impianto di camera bianca, alcuni laboratori hanno sviluppato metodi di litografia a basso costo per l&#39;uso in un ambiente semi-pulito 16,17. </li><li> Preparare la fonte d&#39;aria per il flusso guidato-pressione, utilizzando un serbatoio di aria compressa e la sequenza dei regolatori aria e raccordi (Figura 1A). <ol><li> Impostare un serbatoio di alimentazione dell&#39;aria e il regolatore manuale. NOTA: Una composizione di 5% di CO 2 in aria mantiene un ambiente simile a un tipico incubato coltura cellularer, ma altre miscele di gas possono anche essere utilizzati. </li><li> Impostare un regolatore di pressione a controllo elettronico in linea con il regolatore manuale. Utilizzare un convertitore elettro-pneumatico per regolare e mantenere una caduta di pressione stabile su tutti i canali, con le variazioni di pressione di meno di 2 kPa. Utilizzare il semplice codice scritto in LabVIEW (Informazioni supplementari) per inserire la pressione desiderata. NOTA: Il convertitore elettro-pneumatico utilizza un circuito di feedback interno per regolare la pressione di uscita della valvola in modo che corrisponda alla pressione specificata attraverso il dispositivo di microfluidica. </li><li> Impostare una camera pressurizzata per guidare il flusso della sospensione cellulare. Assemblare una camera di sospensione cellulare su un citometro a flusso standard tubo e un cappuccio lavorata che crea una guarnizione a tenuta di pressione sul tubo. NOTA: Il tappo camera di pressione contiene due orifizi: un ingresso che si collega al serbatoio dell&#39;aria compressa e una presa attraverso il quale le cellule derivano dalla camera in pressione nel dispositivo (Figure 2). </li></ol></li><li> Impostare un microscopio invertito dotato di una fotocamera che ha un tasso di acquisizione di almeno 100 fotogrammi al secondo per catturare le immagini delle cellule che attraversano la matrice costrizione. Interfaccia la fotocamera con una scheda di acquisizione video e un computer. </li><li> Preparare una soluzione madre tensioattivo del 10% w / w Pluronic F-127 in tampone fosfato (PBS), come l&#39;aggiunta di una piccola quantità di F127 alla soluzione multimediale cellule aiuterà a ridurre al minimo l&#39;adesione delle cellule alle pareti PDMS. Per preparare la soluzione F127, vortice e riscaldare lentamente a 37 ° C per sciogliere la F127. Prima dell&#39;uso, passare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron e conservare a temperatura ambiente. Preparare la soluzione di tensioattivo in anticipo come vortex e filtraggio genera bolle che persistono per più di 24 ore. </li></ol> 3 Microfluidic Fabrication dispositivo <ol><li> Realizzare blocco PDMS con canali microfluidici. <ol><li> Mescolare accuratamente PDMS unrapporto ta di 1:10 (w / w) agente indurente alla base. </li><li> Versare il composto sopra il master del dispositivo (punto 2.1). Degas in una campana di vetro con il vuoto applicato fino a quando le bolle intrappolate scompaiono, o per circa 10-20 min. NOTA: Dopo questo tempo, ci possono essere ancora bolle all&#39;interfaccia aria-PDMS, che è normale; queste saranno tipicamente dissipare durante la cottura. È più critico per garantire che non vi siano bolle rimanenti adiacenti ai canali. </li><li> Cuocere il dispositivo degasato a 65 ° C per 4 ore. Per evitare che i canali di collassare, cuocere il dispositivo durante la notte per reticolare ulteriormente le PDMS per un dispositivo con un alto modulo elastico che è più resistente al collasso canale. Tuttavia, nota che si estendeva cottura embrittles anche i PDMS e può portare alla fessurazione quando punzonatura fori (punto 3.3). </li></ol></li><li> Rimuovere i dispositivi microfluidici dallo stampo master. Tagliare dispositivi microfluidici individuali fuori del blocco PDMS con una lametta e rimuovere il dispositivo dal paloer. Iniziate sollevando delicatamente un angolo del dispositivo; peeling lento e dolce, in contrasto con il sollevamento del blocco di PDMS verso l&#39;alto, riduce lo stress su entrambi i PDMS e il master. </li><li> Punch buchi nel dispositivo PDMS per creare porte di connessione per l&#39;accesso tra tubi e microcanali. Creare fori con una biopsia, e punch dal lato canale attraverso il lato esterno del dispositivo. NOTA: Un pugno biopsia con un diametro 0,75 millimetri crea buchi che si interfacciano perfettamente con polietereterchetone (PEEK) tubo (diametro esterno = 1/32 &quot;o 0,79 millimetri) o tubo di polietilene (PE-20, diametro esterno = 0,043&quot; o 1,09 millimetri ). Utilizzare un anello di luce per aiutare a visualizzare i fori nei dispositivi con canali poco profondi 18. Assicurarsi che la biopsia è tagliente; dopo un uso ripetuto all&#39;avanguardia offusca e la biopsia deve essere eliminata e sostituita. </li><li> Sciacquare il dispositivo PDMS con isopropanolo (HPLC) per rimuovere polvere e depositati pezzi di PDMS. Assicurarsi che ilfori sono chiari di detriti da dirigere un flusso costante di isopropanolo puro da una bottiglia squeeze attraverso i fori. Asciugare con aria filtrata. Dopo la pulizia, posizionare i blocchi PDMS con canali a faccia in su in un piatto pulito Petri per mantenere la pulizia del dispositivo. Se necessario, dispositivi di archiviazione in questa forma fino legame. </li><li> Pulire il substrato di vetro risciacquando con metanolo (grado HPLC), asciugare con aria filtrata, e mettere su una piastra riscaldante a 200 ° C per 5-10 minuti al fine di garantire il vetro è completamente pulita e asciutta prima del trattamento al plasma. NOTA: Il substrato di vetro forma il fondo di ciascun canale. Tipicamente un vetrino sufficiente, dal momento che un obiettivo 10X o 20X è l&#39;ideale per l&#39;imaging più canali in parallelo. Per una maggiore risoluzione delle immagini, legare il dispositivo a un coprioggetto (# 1.5 di spessore). </li><li> Incollare il dispositivo PDMS al substrato di vetro. <ol><li> Il plasma ad ossigeno trattare il lato canale del blocco PDMS e 1 parte di un vetrino. NOTA: Won una unità di scarico manuale, utilizzare un tempo di trattamento di 1 min, ma ottimizzare il tempo di trattamento per ciascun apparecchio plasma di ossigeno. </li><li> Posizionare il lato canale delle PDMS sulla parte superiore del lato trattato del vetro immediatamente dopo il trattamento. </li><li> Tenere insieme con una leggera pressione per ~ 10 secondi per promuovere l&#39;incollaggio. Cuocere l&#39;intero dispositivo a temperatura elevata (60-80 ° C) per almeno 15 minuti per migliorare la forza di legame. </li></ol></li></ol> 4 Deformazione cellule attraverso i canali ristretto <ol><li> Controllare il dispositivo di microfluidica sotto un microscopio. Assicurarsi che i canali non sono crollate o rotti e che entrambi i fori di entrata e uscita si collegano direttamente nei canali del dispositivo utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento (10X). Designare dispositivi difettosi segnando la superficie delle PDMS con una lametta e non usarli per esperimenti. </li><li> Preparare i campioni di coltura cellulare per essere processati. Cellule Cultura usano condizioni standard. <ol><li> Fo esempio, la cultura HL-60 cellule in terreno RPMI-1640 integrati con la soluzione di penicillina-streptomicina 1% e siero fetale bovino al 10% in 5% CO 2 incubatore a 37 ° C. </li><li> Per le cellule aderenti, li raccogliere da tripsinizzazione e risospendere in terreno di coltura fresco. Utilizzare un protocollo standard di tripsinizzazione; per esempio, aggiungere ~ 0,5 ml di tripsina ad un pallone con il 25 cm 2 area culturale, e risospendere in ~ 30 ml di terreno fresco. Differenziare cellule HL-60 in cellule neutrofili di tipo da parte di tutti-trans retinoico (ATRA) ad una concentrazione finale di 5 mM per 1 x 10 5 cellule / ml come descritto in precedenza 19,20. </li><li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 3 minuti, aspirare con cura le cellule surnatante e risospendere alla densità finale appropriato terreno di coltura fresco con 0,1% v / v F-127. </li></ol></li><li> Contare le cellule utilizzando un contatore Coulter, emocitometro, o citofluorimetro. Regolare la sospensione cellulare ad una densità di 1 x 10 6 a 5 x 10 <sup&gt; 6 cellule / ml. Una volta che la densità della sospensione è impostato, supplemento con circa 0,1% v / v F-127. NOTA: La densità cellulare e la concentrazione di tensioattivi possono avere bisogno di essere modificato a seconda dei sistemi cellulari particolari; La tabella 1 fornisce una registrazione delle concentrazioni utilizzate in precedenza di cellule e di F-127 per i diversi tipi di cellule. </li><li> Mettere sospensione cellulare in un citofluorimetro tubo e collegarlo al tappo a pressione. Prima di collegare il tubo al dispositivo microfluidica, regolare la pressione a circa 14-21 kPa e filo fino alla sospensione cellulare emerge dalla punta del tubo. Questo aiuterà a ridurre al minimo le bolle d&#39;aria nel tubo e il dispositivo. </li><li> Inserire la punta del tubo contenente la sospensione cellulare nella presa del dispositivo. Se il dispositivo è legato ad un coprioggetto, posizionare il dispositivo su una superficie piana e solida come la fase di microscopio prima di collegare il tubo; il vetrino è fragile e può rompersi in caso contrario. </li><li> Inserire un pezzo di tubo into l&#39;apertura di uscita e farlo passare in un tubo vuoto per la raccolta dei rifiuti, ad esempio un tubo Falcon vuota attaccata al lato del palco microscopio. Per coerenza nella resistenza fluidica complessiva del dispositivo tra esperimenti, verificare che il tubo di ingresso e uscita è dello stesso diametro e circa la stessa lunghezza per ogni esperimento. </li><li> Rampa delicatamente la pressione di circa 28 kPa o fino a quando le cellule passano attraverso i canali. Posizionare il dispositivo in modo che i diversi canali sono nel campo visivo e sono perpendicolari al fondo della schermata. Se la fotocamera è limitata dalla dimensione dei dati, acquisire più video per generare un numero sufficiente di punti di dati indipendenti. Regolare il tasso necessario per l&#39;uscita dei dati desiderata telaio. Per catturare cambiamenti nella forma cellulare, utilizzare l&#39;imaging ad alta velocità a 300 fotogrammi al secondo (fps); per misurare i tempi di transito di celle, utilizzare frame rate di circa 100 fps. </li></ol> Analisi dei dati 5. <ol><li> Aprire il file Master_script.m (scaricabile File supplementare) ed eseguire il programma. </li><li> Selezionare il primo video da analizzare dalla finestra di Windows Explorer che viene visualizzata. Specificare la frequenza dei fotogrammi per il video selezionato e premere invio. NOTA: Una figura apparirà che richiede all&#39;utente di selezionare una finestra di ritaglio rettangolare per il primo video. </li><li> Selezionare una finestra che comprende tutti i canali da sinistra a destra e interseca i canali appena sopra la prima lampadina della matrice di canali in alto e in basso (Figura 3). </li><li> Selezionare le regioni costrizione da l&#39;immagine ritagliata. Prestare particolare attenzione a mantenere una distanza fissa di pixel tra la finestra limite superiore e inferiore per ogni video selezionato. NOTA: Il bordo superiore della finestra specifica la costrizione più in alto e il bordo inferiore della finestra specifica la costrizione in basso (figura 4); costrizioni intermedie sono approssimate da questo input dell&#39;utente. Successivamente, l&#39;algoritmo mostra le segmentation delle cellule per i primi 50 frame di ogni video (Figura 5). </li><li> Monitorare l&#39;immagine in alto a sinistra (Figura 5A) strettamente per determinare se l&#39;algoritmo è localizzare con precisione le cellule; un&#39;immagine binarizzata viene sovrapposta al video sorgente per dimostrare la posizione delle cellule identificate. NOTA: Le finestre diverse, (Figure 5B-5D) sono per la diagnosi di codice e dimostrano i fotogrammi video dopo le operazioni di elaborazione delle immagini specifiche. </li><li> Selezionare il video successivo da elaborare dalla finestra di Windows Explorer. NOTA: L&#39;algoritmo si Ripetere i passaggi 5,2-5,5 per ogni video selezionato. </li><li> Selezionare Annulla una volta tutti i video desiderati sono stati aggiunti tramite la finestra di Esplora risorse per istruire la funzione che l&#39;elenco dei video è completa. NOTA: L&#39;algoritmo eseguirà le operazioni rimanenti senza l&#39;intervento dell&#39;utente. Questo richiederà circa 1-2 ore a seconda del numero di video trasformati e pe informaticirformance. Al termine, l&#39;algoritmo produrrà un istogramma dei dati di tempo di transito e di salvare i dati nella directory come un file .mat MATLAB e un file xls di Microsoft Excel. </li></ol>

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	<li>Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+neutrophil+and+capillary+diameters+and+their+relation+to+neutrophil+sequestration+in+the+lung.">Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung.</a> Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+cancer+metastasis:+the+`seed+and+soil&#8217;+hypothesis+revisited.">The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil&#8217; hypothesis revisited.</a> Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).</li><li>Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+access+microfluidic+device+for+the+study+of+cell+migration+during+chemotaxis.">Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis.</a> Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).</li><li>Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformability+study+of+breast+cancer+cells+using+microfluidics.">Deformability study of breast cancer cells using microfluidics.</a> Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).</li><li>Byun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+deformability+and+surface+friction+of+cancer+cells.">Characterizing deformability and surface friction of cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).</li><li>Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+cell+mechanics+in+hematologic+diseases+with+microfluidic+biophysical+flow+cytometry.">Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry.</a> Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+cell+types+using+a+microfluidic+device+for+mechanical+and+electrical+measurement+on+single+cells.">Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).</li><li>Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+biophysical+measurement+of+human+red+blood+cells.">High-throughput biophysical measurement of human red blood cells.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).</li><li>Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+measurement+of+red+blood+cell+deformability+on+a+microfluidic+device.">Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).</li><li>Hogg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+kinetics+and+lung+injury.">Neutrophil kinetics and lung injury.</a> Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).</li><li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+aspiration+of+living+cells.">Micropipette aspiration of living cells.</a> Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).</li><li>Yap, B., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+remodeling+and+cellular+activation+during+deformation+of+neutrophils+into+narrow+channels.">Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels.</a> Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).</li><li>Bow, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+deformability-based+flow+cytometer+with+application+to+malaria.">A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria.</a> Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).</li><li>Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+single+cells+using+flow+in+microfluidic+devices.">Probing single cells using flow in microfluidic devices.</a> The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).</li><li>Doll, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-8+force+sensing+pillar+arrays+for+biological+measurements.">SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements.</a> Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).</li><li>Huntington, M. D., Odom, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Portable,+Benchtop+Photolithography+System+Based+on+a+Solid-State+Light+Source.">A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source.</a> Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).</li><li>Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinky-Dink+microfluidics:+rapid+generation+of+deep+and+rounded+patterns.">Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns.</a> Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).</li><li>Rowat, A. C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chips+&amp;+Tips:+see+where+to+punch+holes+easily+in+a+PDMS+microfluidic+device.">Chips &amp; Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).</li><li>Meyer, P., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+Acid+Induced+Differentiation+and+Commitment+in+HL-60+cells.">Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells.</a> Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).</li><li>Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+Acid+Differentiation+of+HL-60+Cells+Promotes+Cytoskeletal+Polarization.">Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization.</a> Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).</li><li>Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Microscopy+of+Nonadherent+Cells:+A+Comparison+of+Leukemia+Cell+Deformability+.">Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability .</a> Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).</li><li>Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+HL-60+cell+deformability+during+differentiation+induced+by+DMSO.">Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO.</a> Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).</li><li>Rowat, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Envelope+Composition+Determines+the+Ability+of+Neutrophil-type+Cells+to+Passage+through+Micron-scale+Constrictions.">Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).</li><li>Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+exposure+increases+leukemia+cell+stiffness.">Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness.</a> Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).</li><li>Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+surface+wettability+of+poly(dimethyl)+siloxane+(PDMS)+and+glass+under+oxgen-plasma+treatment+and+correlation+with+bond+strength.">Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).</li><li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+poly(dimethylsiloxane)+surface+modification+to+control+cell+adhesion.">Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion.</a> Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+Microfabricated+Valves+and+Pumps+by+Multilayer+Soft+Lithography.">Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Qui forniamo una procedura sperimentale completo per l&#39;analisi della deformazione delle cellule che transitano attraverso i canali microfluidici ristretto con flusso pressione-driven. Uno script MATLAB consente l&#39;elaborazione automatica dei dati (Supplemental materiale); di una versione aggiornata del codice è mantenuta ( <a href="www.ibp.ucla.edu/research/rowat" target="_blank">www.ibp.ucla.edu/research/rowat</a> ). Più in generale, le tecniche qui presentate possono essere adattati in molti saggi microfluidi...

Le variazioni di forma delle cellule sono fondamentali in numerosi contesti biologici. Ad esempio, eritrociti e leucociti deformano attraverso capillari che sono più piccoli di loro diametro 1. In metastasi, le cellule tumorali devono deformare attraverso spazi interstiziali stretti così come vascolare tortuoso e le reti linfatiche per seminare nei siti secondari 2. Per sondare il comportamento fisico delle singole cellule, dispositivi microfluidici presentano una piattaforma ideale che può essere personalizzato per studiare una serie di comportamenti cellulari tra cui la loro capacità di migrare attraverso strette fessure 3 e deformare passivamente attraverso costrizioni micron scala 3- 9. Polidimetilsilossano (PDMS) dispositivi microfluidici sono otticamente trasparente, consentendo deformazioni cellulari per essere osservata con un microscopio ottico e analizzati utilizzando strumenti di elaborazione delle immagini di base. Inoltre, le matrici di costrizioni possono essere definite con precisione, consentendo l&#39;analisi di più celle contemporaneamente conrendimento che supera molte tecniche esistenti 10,11. Qui vi presentiamo un piano sperimentale dettagliato per sondare deformabilità cellulare utilizzando il dispositivo di microfluidica &#39;cellulare Deformatore&#39; PDMS. Il dispositivo è progettato in modo che le cellule passaggio attraverso costrizioni sequenziali; questa geometria è comune in contesti fisiologici, come il capillare polmonare letto 12. Per misurare la deformabilità delle cellule, il tempo di transito fornisce una metrica conveniente che è facilmente misurato come il tempo richiesto per una singola cella di transito attraverso un&#39;unica 4,6 costrizione. Per mantenere una caduta di pressione costante su tutti i canali ristretti durante il trasporto delle cellule, usiamo il flusso di pressione-driven. Il nostro protocollo include istruzioni dettagliate sulla progettazione e fabbricazione del dispositivo, il funzionamento del dispositivo di pressione-driven flusso, la preparazione e l&#39;imaging di cellule, così come l&#39;elaborazione delle immagini per misurare il tempo per le celle a deformare attraverso una serie di costrizioni. Includiamoentrambi i modelli del dispositivo e codice di elaborazione dati di visione come file supplementari. Come un campione rappresentativo di dati, mostriamo tempo di transito cella attraverso una serie di costrizioni in funzione del numero di costrizioni diversi passaggi. Analisi dei tempi per celle di transitare se costrizioni strette di un dispositivo microfluidico può rivelare differenze di deformabilità di una varietà di tipi cellulari 4,5,13. Il dispositivo dimostrato qui sorveglia unicamente transito cella attraverso una serie di costrizioni micron scala; questo disegno emula il percorso tortuoso che le cellule vivono in circolazione e permette anche sondare le caratteristiche fisiche supplementari di cellule, come tempo di rilassamento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">8409400</td>
			<td style="width:167px;">Produced by BASF, also available through Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">PDMS base and crosslinker</td>
			<td style="width:71px;">Essex Brownell</td>
			<td style="width:119px;">DC-184-1.1</td>
			<td style="width:167px;">Product commonly named Sylgard 184 Elastomer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Oxygen plasma discharge unit</td>
			<td style="width:71px;">Enercon</td>
			<td style="width:119px;">Dyne-A-Mite 3D Treater</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm)</td>
			<td style="width:71px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">15072</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Fingertight Ferrule, 1/32&#34;</td>
			<td style="width:71px;">Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:119px;">UP-F-113</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Fingertight III Fitting, 10-32</td>
			<td style="width:71px;">Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:119px;">UP-F-300X</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32&#34;or 0.79 mm</td>
			<td style="width:71px;">Valco</td>
			<td style="width:119px;">TPK.515-25M</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">polyethylene (PE-20) tubing, 0.043&#34; or 1.09 mm</td>
			<td style="width:71px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">427406</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Pressure regulator</td>
			<td style="width:71px;">Airgas or Praxair</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Polyurethane tubing, 5/32&#8221; OD</td>
			<td style="width:71px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:119px;">5648K284</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Push-to-connect fittings</td>
			<td style="width:71px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:119px;">5111K91</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter</td>
			<td style="width:71px;">Omega</td>
			<td style="width:119px;">IP413-020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">NI PCI 6225-779295-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">Analog Connector Block-Screw Terminal</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">SCB-68-776844-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">LabView System Design Software</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">Matlab Software</td>
			<td style="width:71px;">The MathWorks, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Matlab R2012a</td>
			<td style="width:167px;">Code requires the Image Processing Toolbox</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:216px;">Shielded Cable</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">SHC68-68</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic technique to probe cell deformability

Qui noi dettaglio la progettazione, la fabbricazione e l&#39;uso di un dispositivo di microfluidica per valutare la deformabilità di un gran numero di singole cellule in modo efficiente. In genere, i dati per ~ 10 2 cellule possono essere acquisite all&#39;interno di un esperimento di 1 ora. Un programma di analisi delle immagini automatizzata consente efficiente analisi post-esperimento dei dati di immagine, consentendo l&#39;elaborazione di essere completo entro poche ore. La geometria del dispositivo è unico in quanto le cellule devono deformare attraverso una serie di costrizioni micron scala, consentendo in tal modo la deformazione iniziale e rilassamento dipendente dal tempo di singole cellule da dosare. L&#39;applicabilità di questo metodo per leucemia promielocitica umana (HL-60), le cellule è dimostrata. Cellule Guidando a deformarsi attraverso costrizioni micron scala usando flow-driven pressione, osserviamo che promielocitica umana (HL-60) le cellule momentaneamente occludono la prima costrizione per un tempo mediano di 9,3 msec prima passaging più rapidamente attraverso la successiva costrizioneioni con un tempo di transito medio di 4,0 msec per costrizione. Al contrario, tutto-trans retinoico trattati con acido (neutrofili-tipo) cellule HL-60 occludono la prima costrizione per soli 4.3 msec prima passaging attraverso le strettoie successivi con un tempo di transito medio di 3,3 msec. Questo metodo può fornire indicazioni sulla natura viscoelastica di cellule, e in ultima analisi rivelano le origini molecolari di questo comportamento.

Per studiare la deformabilità dei diversi tipi di cellule, cellule di leucemia mieloide umana (HL-60), le cellule differenziate neutrofili, cellule linfocitarie topo, e linee cellulari di carcinoma ovarico umano (OVCAR8, HEYA8) vengono valutati utilizzando la tecnica microfluidica il &#39;cellulare Deformer&#39;. Risultati rappresentativi per il tempo di transito di HL-60 cellule HL-60 e neutrofili tipo mostrano i tempi per una singola cella di transito attraverso una serie di costrizioni, come mostrato nella F...

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A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Dimostriamo un saggio basato microfluidica-per misurare i tempi di cellule di transitare attraverso una sequenza di costrizioni micron scala.

Una tecnica Microfluidic per sondare deformabilità cellulare

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

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11.2K Views.  University of California, Los Angeles.  Dimostriamo un saggio basato microfluidica-per misurare i tempi di cellule di transitare attraverso una sequenza di costrizioni micron scala. 

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Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

Analisi sistematica delle<em&gt; In Vitro</em&gt; Cella rotolamento Utilizzando un piatto multi-ben Sistema Microfluidic

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Ricerca

Bioingegneria

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Spremere cellulare come un robusto, Microfluidic intracellulare Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analizzando disomogeneità Mescolando in un dispositivo a microfluidi da Tecnica microscala Schlieren

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Microfluidic genipina Deposizione Tecnica per la cultura estesa di micropatterned vascolari muscolari Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Utilizzando adesivo Patterning per costruire dispositivi microfluidici di carta 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Rapid Patterning sottrattiva di strati cellulare dal vivo con una sonda Microfluidic

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Multi-step altezza variabile fotolitografia per Valvolati multistrato microfluidici Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of nanometer-scale features. Historically, a major drawback of scanning probe lithography has been the intrinsically low throughput of single probe systems. This has been tackled by the use of arrays of multiple probes to enable increased nanolithography throughput. In order to implement such parallelized nanolithography, the accurate alignment of probe arrays with the substrate surface is vital, so that all probes make contact with the surface simultaneously when lithographic patterning begins. This protocol describes the utilization of polymer pen lithography to produce nanometer-scale features over centimeter-sized areas, facilitated by the use of an algorithm for the rapid, accurate, and automated alignment of probe arrays. Here, nanolithography of thiols on gold substrates demonstrates the generation of features with high uniformity. These patterns are then functionalized with fibronectin for use in the context of surface-directed cell morphology studies.

Here we present a protocol for wide-area scanning probe nanolithography enabled by the iterative alignment of probe arrays, as well as the utilization of lithographic patterns for cell-surface interaction studies.

Grande area scansione sonda nanolitografia nei paraggi allineamento automatico e sua applicazione alla fabbricazione di substrato per gli studi della coltura delle cellule

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.