Os autores gostariam de agradecer Lloyd Ung para entrada construtiva nas primeiras versões dessa técnica, o Dr. Jeremy Agresti para dicas de design da tampa de pressão, e Dr. Dongping Qi por sua ajuda na fabricação da tampa de pressão. Somos gratos aos laboratórios de M. Teitell e P. Gunaratne para fornecer uma variedade de amostras de células para testes. Somos gratos à Fundação Nacional de Ciências (Prémio Carreira DBI-1254185), o Comprehensive Cancer Center da UCLA Jonsson, ea UCLA Clinical and Translational Science Institute para apoiar este trabalho.

1. Microfluidic Dispositivo Projeto NOTA: O projeto do dispositivo tem quatro regiões funcionais básicos: porta de entrada, filtro celular, matriz constrição, e porta de saída (Figura 1). A concepção geral pode ser aplicada a uma grande variedade de tipos de células, com ajustamentos menores dimensões. Desde que aqui estão algumas recomendações de projeto básico, juntamente com os parâmetros do dispositivo que são eficazes para a seleção de ambas as células primárias e imortalizadas. <ol><li> Seleccione a largura dos canais de constrição da matriz (Figura 1B) ser de aproximadamente 30-50% do diâmetro médio de célula; esta constrição-célula de tamanho resultados em relação deformação celular significativa, mas o entupimento mínima. Dado um tipo de célula que não tenha sido previamente testado, é prudente para projetar uma variedade de larguras de constrição de ~ 30-50% do diâmetro celular para encontrar a largura ideal. Tal como acontece com muitos tipos de dispositivos microfluídicos, mais de 120 moldes de mestre do dispositivo pode ser modelado em um pecadogle bolacha de silício de 4 polegadas, permitindo uma variedade de diferentes modelos de dispositivos de ser fabricado num processo de fabricação. </li><li> Seleccione a altura do canal de ser, pelo menos, 50% do diâmetro da célula; isto assegura a célula está confinada em duas dimensões. Para evitar o colapso do canal durante a ligação, certifique-se que a relação de aspecto de canal nada menos que 1:10 é (altura: largura) em todo o dispositivo. Para os canais que devem ultrapassar esta relação de aspecto, adicionar mensagens de apoio para evitar o colapso. Mensagens de apoio Espaço, a uma distância que é pelo menos duas vezes o diâmetro da célula, para não impedir o fluxo de células. </li><li> Incluir um filtro para as portas de entrada para remover detritos e desagregar grupos de células (Figura 1B). Ajustar o tamanho e espaçamento das mensagens de filtro de modo a que a distância que separa os dois postes é aproximadamente igual a um diâmetro da célula. NOTA: O limite inferior de tamanho recurso é definido pela resolução com que a máscara de litografia é impresso. Certifique-se que todos os recursos estão dentro dos resolução limite especificado pelo fornecedor máscara. </li></ol> 2. Suprimentos e Preparação NOTA: Antes de iniciar qualquer experimento, os seguintes itens devem estar preparados. Um esquemática de toda a configuração é dado na Figura 1. <ol><li> Fabricar o mestre dispositivo utilizando técnicas padrão para micromachining litográfica 14,15. Verificar a altura das características padronizadas utilizando um perfilómetro. NOTA: Enquanto mestres podem ser facilmente fabricado em uma instalação de sala limpa, alguns laboratórios desenvolveram métodos de litografia de baixo custo para uso em um ambiente semi-limpo 16,17. </li><li> Prepare a fonte de ar de fluxo accionado por pressão, utilizando um tanque de ar comprimido e a sequência de reguladores de ar e acessórios (Figura 1A). <ol><li> Configurar um tanque de alimentação de ar e regulador manual. Observação: Uma composição de 5% de CO 2 em ar mantém um ambiente semelhante como uma cultura de células incubato típicor, mas outras misturas de gases que pode também ser utilizado. </li><li> Configure um regulador de pressão controlada eletronicamente em linha com o regulador manual. Use um conversor eletro-pneumático para regular e manter uma queda de pressão estável ao longo dos canais, com flutuações de pressão de menos de 2 kPa. Use o código simples escrito em LabVIEW (Informações Complementares) para introduzir a pressão desejada. NOTA: O conversor electro-pneumático usa um ciclo de feedback interno para regular a pressão de saída da válvula, para corresponder à pressão indicada através do dispositivo de microfluidos. </li><li> Configurar uma câmara pressurizada para dirigir o fluxo da suspensão de células. Montar uma câmara de suspensão de células de citómetro de fluxo padrão de um tubo e uma tampa maquinada que cria uma vedação estanque à pressão sobre o tubo. NOTA: A tampa da câmara de pressão contém dois orifícios: uma entrada que liga o reservatório de ar comprimido e uma saída através da qual as células de fluxo a partir da câmara sob pressão no interior do dispositivo (Figure 2). </li></ol></li><li> Configure um microscópio invertido equipado com uma câmara que tem uma taxa de aquisição de pelo menos 100 frames por segundo para capturar imagens das células que fluem através da matriz constrição. Interface com a câmera com uma placa de captura de vídeo e um computador. </li><li> Prepara-se uma solução do tensioactivo de 10% w / w de Pluronic F-127 em tampão fosfato salino (PBS) como a adição de uma pequena quantidade de solução de F127 para o meio celular vai ajudar a minimizar a adesão das células às paredes PDMS. Para preparar a solução de F127, vortex e aquece-se suavemente a 37 ° C para dissolver o F127. Antes do uso, passar a solução através de um filtro de seringa de 0,2 um e armazenar à temperatura ambiente. Preparar a solução de tensoactivo antes de vórtice e filtragem irá gerar bolhas que persistem durante mais de 24 horas. </li></ol> 3. fabricação de dispositivos microfluídicos <ol><li> Fabricar bloco de PDMS com canais microfluídicos. <ol><li> Mix PDMS completamente umta proporção de 1:10 (w / w) do agente de cura à base. </li><li> Despeje a mistura sobre o mestre dispositivo (Passo 2.1). Degas em uma redoma de vidro com vácuo aplicado até que as bolhas aprisionadas desaparecer, ou por cerca de 10-20 min. Nota: Após este tempo, podem ainda existir bolhas na interface ar-PDMS, o que é normal; estes normalmente dissipar durante o cozimento. É mais importante para garantir que não existem remanescentes bolhas adjacentes aos canais. </li><li> Coza no dispositivo desgaseificada a 65 ° C durante 4 h. Para evitar que os canais entre em colapso, o dispositivo de cozer durante a noite para reticular mais os PDMS para um dispositivo com um maior módulo de elasticidade que é mais resistente ao colapso do canal. No entanto, nota que se estendeu de cozimento também embrittles os PDMS e pode levar a fissuras quando perfurando (Passo 3.3). </li></ol></li><li> Remover dispositivos microfluídicos do molde mestre. Corte dispositivos microfluídicos individuais fora do bloco de PDMS com uma lâmina de barbear e remover o dispositivo do mastroer. Comece tirando delicadamente um canto do dispositivo; descamação lento e suave, ao contrário de levantamento do bloco de PDMS para cima, reduz a tensão em ambos os PDMS e o mestre. </li><li> Faça furos no dispositivo de PDMS para criar portas de conexão para acesso entre a tubulação e microcanais. Criar buracos usando um punção de biópsia e perfurar a partir do lado do canal através do lado exterior do dispositivo. NOTA: A biópsia por punção com diâmetro 0,75 milímetros cria buracos que a interface perfeitamente com polieteretercetona (PEEK) tubulação (diâmetro externo = 1/32 &quot;ou 0,79 milímetros) ou tubos de polietileno (PE-20, diâmetro externo = 0,043&quot; ou 1,09 milímetros ). Use um anel de luz para ajudar a visualizar buracos em dispositivos com canais rasos 18. Certifique-se o punção biópsia é nítida; após o uso repetido de ponta embota eo soco biópsia deve ser descartado e substituído. </li><li> Lavar o dispositivo PDMS com isopropanol (grau HPLC) para remover a poeira e nela pedaços de PDMS. Verifique se ofuros são livre de detritos, direcionando um fluxo constante de isopropanol puro a partir de um frasco de pressão através dos orifícios. Seque com ar filtrado. Após a limpeza, coloque os blocos de PDMS com canais enfrentam-se em uma placa de Petri limpa para manter a limpeza do dispositivo. Se necessário, dispositivos de armazenamento de desta forma até que a ligação. </li><li> Limpe o substrato de vidro por lavagem com metanol (grau HPLC), seque com ar filtrado, e coloque em um 200 ° C fogão para 5-10 min para garantir o copo está completamente limpo e seco antes do tratamento de plasma. NOTA: O substrato de vidro forma o fundo de cada canal. Tipicamente, uma lâmina de vidro é suficiente, uma vez que uma objectiva 10X ou 20X é ideal para imagiologia de múltiplos canais em paralelo. Para uma maior resolução de imagem, ligar o dispositivo a uma lamela (# 1.5 espessura). </li><li> Ligar o dispositivo de PDMS ao substrato de vidro. <ol><li> Plasma de oxigénio tratar lado do canal do bloco de PDMS e um lado de uma lâmina de vidro. NOTA: Wom uma unidade de descarga de mão, utilizar um tempo de tratamento de 1 minuto, mas optimizar o tempo de tratamento para cada aparelho de plasma de oxigénio. </li><li> Coloque o lado do canal do PDMS no topo do lado tratado do vidro imediatamente após o tratamento. </li><li> Segure com uma leve pressão para ~ 10 segundos para promover a ligação. Asse todo o dispositivo a uma temperatura elevada (60-80 ° C) durante pelo menos 15 minutos para melhorar a força de ligação. </li></ol></li></ol> 4. Deformação células através de canais constrição <ol><li> Inspeccionar o dispositivo de microfluidos sob um microscópio. Certifique-se de que os canais não são recolhidos ou quebrado e que ambos os orifícios de entrada e de saída, ligar diretamente para os canais de dispositivo usando uma objectiva de baixa potência (10x). Designar dispositivos defeituosos, marcando a superfície do PDMS com uma lâmina de barbear e não usá-los para experiências. </li><li> Preparar as amostras de cultura de células a ser ensaiadas. Células de cultura, usando condições padrão. <ol><li> Fou exemplo, cultura de células HL-60 em meio RPMI-1640 suplementado com solução de penicilina-estreptomicina a 1% e 10% de soro fetal bovino em 5% de CO2 numa estufa a 37 ° C. </li><li> Para as células aderentes, colhê-los por tripsinização e ressuspender em meio de crescimento fresco. Use um protocolo de tripsinização padrão; por exemplo, adicionar ~ 0,5 ml de tripsina a um frasco de 25 cm 2, a área de cultura, e ressuspender em ~ 30 mL de meio fresco. Diferenciar células HL-60 em células do tipo de neutrófilos pelo ácido all-trans retinóico (ATRA), a uma concentração final de 5 mM por 1 x 10 5 células / ml como previamente descrito 19,20. </li><li> Centrifugar as células a 300 xg durante 3 minutos, cuidadosamente aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com a densidade final adequada em meio de cultura fresco com 0,1% v / v de F-127. </li></ol></li><li> Contar as células usando um contador Coulter, hemocitômetro, ou citometria de fluxo. Ajustar a suspensão de células para uma densidade de 1 × 10 6 a 5 X 10 <sup&gt; 6 células / ml. Uma vez que a densidade da suspensão é ajustado, aproximadamente, com suplemento de 0,1% v / v de F-127. NOTA: A densidade celular e a concentração de surfactante podem precisar de ser modificado em função dos sistemas de células específicas; Tabela 1 fornece um registo de concentrações usadas anteriormente e de células F-127 para os diferentes tipos de células. </li><li> Coloque suspensão de células em um citômetro de fluxo tubo e conectar-se à tampa de pressão. Antes de ligar a tubagem para o dispositivo de microfluidos, ajustar a pressão para cerca de 14-21 kPa e lavar a suspensão de células até que emerge a partir da ponta do tubo. Isso vai ajudar a minimizar bolhas de ar na tubulação e dispositivo. </li><li> Inserir a extremidade do tubo contendo a suspensão de células para dentro da entrada do dispositivo. Se o dispositivo estiver ligado a uma lamela, colocar o dispositivo sobre uma superfície plana, sólida, tal como a platina do microscópio antes de ligar a tubagem; a lamela é frágil e pode quebrar o contrário. </li><li> Coloque um pedaço de tubo into orifício de saída e encaminhá-lo para um tubo vazio para a recolha de resíduos, tal como um tubo Falcon de vazio para o lado gravado de platina do microscópio. Para consistência na resistência fluídica global do dispositivo entre experiências, assegurar que o tubo de entrada e saída são do mesmo diâmetro e, aproximadamente, o mesmo comprimento para cada experimento. </li><li> Suavemente rampa até a pressão a cerca de 28 kPa ou até que as células fluem através dos canais. Posicionar o dispositivo de modo que os múltiplos canais está no campo de visão e são perpendiculares à parte inferior do ecrã. Se a câmera é limitada pelo tamanho dos dados, adquirir vários vídeos para gerar um número suficiente de pontos de dados independentes. Ajuste a taxa necessária para a saída de dados desejado quadro. Para capturar mudanças na forma celular, use alta velocidade de imagens em 300 frames por segundo (fps); para medir o tempo de passagem de células, use as taxas de frame de aproximadamente 100 fps. </li></ol> Análise de Dados 5. <ol><li> Abra o arquivo de mastroer_script.m (Downloadable Arquivo Suplementar) e execute o programa. </li><li> Selecione o primeiro vídeo a ser analisado a partir da janela do Windows Explorer que aparece. Especifique a taxa de quadros para o vídeo selecionado e pressione enter. NOTA: A figura aparecerá solicitando que o usuário selecione uma janela de recorte retangular para o primeiro vídeo. </li><li> Escolher a uma janela que engloba todos os canais da esquerda para a direita e intersecta os canais imediatamente acima da primeira lâmpada da matriz de canais, na parte superior e na parte inferior (figura 3). </li><li> Selecione as regiões de constrição da imagem recortada. Preste atenção especial para manter uma distância de pixel fixo entre a parte superior e inferior fronteira janela para cada vídeo selecionado. NOTA: A borda superior da janela especifica a constrição de nível superior ea borda inferior da janela especifica a constrição na extremidade inferior (Figura 4); constrições intermédias são aproximadas a partir desta entrada do usuário. Em seguida, o algoritmo mostra as segmentation das células para os primeiros 50 quadros de vídeo cada (Figura 5). </li><li> Monitorar a imagem da parte superior esquerda (Figura 5A) perto para determinar se o algoritmo for exacta localização de células; uma imagem binarizada é sobreposto sobre o video fonte para demonstrar a localização das células identificadas. NOTA: As diferentes janelas, (Figuras 5B-5D) são para o diagnóstico de código e demonstrar os quadros de vídeo após as operações de processamento de imagem específicos. </li><li> Selecione o próximo vídeo a ser processado a partir da janela do Windows Explorer. NOTA: O algoritmo irá repetir os passos de 5,2-5,5 para cada vídeo selecionado. </li><li> Selecione cancelar uma vez todos os vídeos desejados foram adicionadas através da janela do Windows Explorer para instruir a função que a lista de vídeo está completa. NOTA: O algoritmo irá executar as operações restantes, sem intervenção do usuário. Isso levará cerca de 1-2 horas, dependendo do número de vídeos processados ​​e pe computadorrformance. Após a conclusão, o algoritmo irá produzir um histograma dos dados de tempo de trânsito e salvar os dados no diretório como um arquivo .mat MATLAB e um arquivo xls Microsoft Excel. </li></ol>

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Os autores não têm conflitos de interesse de divulgar.

Aqui nós fornecemos um procedimento experimental abrangente para analisar a deformação das células que transitam através dos canais microfluídicos constricted usando fluxo orientado a pressão. Um script MATLAB permite o processamento automático de dados (Material complementar); uma versão atualizada do código é mantida ( <a href="www.ibp.ucla.edu/research/rowat" target="_blank">www.ibp.ucla.edu/research/rowat</a> ). Mais amplamente, as técnicas aqui apresentadas podem ser adaptadas em muitos ensaios microflu...

Alterações na forma de células são críticas em muitos contextos biológicos. Por exemplo, hemácias e leucócitos deformar através dos capilares, que são menores do que seu próprio diâmetro 1. Em metástase, as células cancerosas deve deformar-se através de aberturas estreitas intersticiais, bem como vasos tortuosos e redes linfáticos para semear em sites secundários 2. Para investigar o comportamento físico das células individuais, dispositivos microfluídicos apresentar uma plataforma ideal que pode ser personalizado para estudar uma série de comportamentos de células, incluindo a sua capacidade de migrar através de aberturas estreitas 3 e deformar passivamente através constrições em escala mícron 3- 9. PDMS (polidimetilsiloxano) dispositivos microfluídicos são opticamente transparentes, permitindo deformações celulares para ser visualizado através de microscopia de luz e analisados ​​utilizando ferramentas básicas de processamento de imagem. Além disso, as matrizes de constrições pode ser definido com precisão, permitindo a análise de várias células simultaneamente com umrendimento que excede muitas técnicas existentes 10,11. Aqui apresentamos um protocolo experimental detalhado para deformabilidade celular usando o dispositivo micro &#39;celular Deformer&#39; PDMS sondagem. O dispositivo é projetado de modo que as células passagem por constrições seqüenciais; esta geometria é comum em contextos fisiológicos, tais como o leito capilar pulmonar 12. Para medir a capacidade de deformação das células, tempo de trânsito fornece uma métrica conveniente que seja facilmente medido, como o tempo necessário para uma célula individual de trânsito através de uma única 4,6 constrição. Para manter uma queda de pressão constante através dos canais de constrição durante o trânsito celular, usamos o fluxo orientado a pressão. Nosso protocolo inclui instruções detalhadas sobre o desenho e fabricação do dispositivo, a operação do dispositivo accionado por pressão de fluxo, e a preparação de células de imagiologia, assim como o processamento de imagens para medir o tempo para as células para se deformar através de uma série de constrições. Nós incluímosambos os projetos de dispositivos e código de processamento de dados como arquivos de visão suplementar. Como um exemplo representativo de dados, que mostra o tempo de trânsito das células através de uma série de constrições como uma função do número de constrições subculturas. Análise da escala de tempo para que as células de trânsito que constrições estreitas de um dispositivo de microfluidos pode revelar as diferenças na capacidade de deformação de uma variedade de tipos de células 4,5,13. O dispositivo demonstrado aqui examina exclusivamente trânsito célula através de uma série de constrições escala mícron; este projeto emula o caminho tortuoso que as células experiência em circulação e também permite sondar características físicas adicionais de células, tais como tempo de relaxamento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">8409400</td>
			<td style="width:167px;">Produced by BASF, also available through Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">PDMS base and crosslinker</td>
			<td style="width:71px;">Essex Brownell</td>
			<td style="width:119px;">DC-184-1.1</td>
			<td style="width:167px;">Product commonly named Sylgard 184 Elastomer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Oxygen plasma discharge unit</td>
			<td style="width:71px;">Enercon</td>
			<td style="width:119px;">Dyne-A-Mite 3D Treater</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm)</td>
			<td style="width:71px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">15072</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Fingertight Ferrule, 1/32&#34;</td>
			<td style="width:71px;">Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:119px;">UP-F-113</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Fingertight III Fitting, 10-32</td>
			<td style="width:71px;">Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:119px;">UP-F-300X</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32&#34;or 0.79 mm</td>
			<td style="width:71px;">Valco</td>
			<td style="width:119px;">TPK.515-25M</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">polyethylene (PE-20) tubing, 0.043&#34; or 1.09 mm</td>
			<td style="width:71px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">427406</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Pressure regulator</td>
			<td style="width:71px;">Airgas or Praxair</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Polyurethane tubing, 5/32&#8221; OD</td>
			<td style="width:71px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:119px;">5648K284</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Push-to-connect fittings</td>
			<td style="width:71px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:119px;">5111K91</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter</td>
			<td style="width:71px;">Omega</td>
			<td style="width:119px;">IP413-020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">NI PCI 6225-779295-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">Analog Connector Block-Screw Terminal</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">SCB-68-776844-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">LabView System Design Software</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">Matlab Software</td>
			<td style="width:71px;">The MathWorks, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Matlab R2012a</td>
			<td style="width:167px;">Code requires the Image Processing Toolbox</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:216px;">Shielded Cable</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">SHC68-68</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic technique to probe cell deformability

Aqui nós detalhe do desenho, fabrico e utilização de um dispositivo de microfluidos para avaliar a capacidade de deformação de um grande número de células individuais de uma maneira eficiente. Tipicamente, os dados de 10 ~ 2 células pode ser adquirida num experimento 1 hr. Um programa automatizado de análise de imagem permite que a análise pós-experimento eficiente de dados de imagem, permitindo o processamento a ser completa dentro de algumas horas. Nossa geometria do dispositivo é único na medida em que as células têm de se deformar através de uma série de constrições escala mícron, permitindo assim a deformação inicial e dependente do tempo de relaxamento de células individuais a serem ensaiadas. A aplicabilidade deste método para leucemia promielocítica humana (HL-60) células é demonstrada. Células Conduzindo a deformar através constrições micro-escala, utilizando fluxo orientado a pressão, observamos que promielocítica humana (HL-60) células ocluir momentaneamente a primeira constrição por um período médio de 9,3 ms antes passaging mais rapidamente através da constrição posterioríons com um tempo de trânsito médio de 4,0 ms por constrição. Por outro lado, todo-trans-retinóico tratadas com ácido (tipo neutrófilos) células HL-60 ocluir a primeira constrição para apenas 4,3 ms antes passaging através das constrições subsequentes com um tempo de trânsito mediana de 3,3 ms. Este método pode fornecer insights sobre a natureza viscoelástica de células e, finalmente, revelar as origens moleculares desse comportamento.

Para investigar a capacidade de deformação dos diferentes tipos de células, as células de leucemia mielóide humana (HL-60), as células diferenciadas de neutrófilos, linfócitos, células de rato e de linhas de células de cancro humano do ovário (OVCAR8, HEYA8) são avaliadas utilizando a técnica de microfluidos &#39;celular Deformer&#39;. Os resultados representativos para o tempo de trânsito das células HL-60 e do tipo de neutrófilos células HL-60 mostra a escala de tempo para uma única célula de trâns...

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A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Nós demonstramos um ensaio baseado em microfluídica para medir a escala de tempo para que as células de trânsito através de uma seqüência de constrições em escala mícron.

A técnica de microfluídica para sondar Deformabilidade celular

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

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11.2K visualizações.  University of California, Los Angeles.  Nós demonstramos um ensaio baseado em microfluídica para medir a escala de tempo para que as células de trânsito através de uma seqüência de constrições em escala mícron. 

Vídeo: A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

Análise sistemática de<em&gt; In Vitro</em&gt; Célula de rolamento usando um sistema microfluídicos Multi-bem placa

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Bioengenharia

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Espremendo celular como uma plataforma de entrega intracelular Robust Microfluidic

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analisando falta de homogeneidade de mistura em um dispositivo micro, pela técnica Microscale Schlieren

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Técnica microfluídico genipina Deposição de Cultura Extensão da micropatterned vasculares musculares Filmes Finos

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Usando Adhesive Padronização Construir 3D de papel microfluídicos

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Padronização Subtractive rápida de camadas de células vivas com uma Probe microfluídicos

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Multi-passo fotolitografia Variável Altura para Valved multicamada microfluídicos Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of nanometer-scale features. Historically, a major drawback of scanning probe lithography has been the intrinsically low throughput of single probe systems. This has been tackled by the use of arrays of multiple probes to enable increased nanolithography throughput. In order to implement such parallelized nanolithography, the accurate alignment of probe arrays with the substrate surface is vital, so that all probes make contact with the surface simultaneously when lithographic patterning begins. This protocol describes the utilization of polymer pen lithography to produce nanometer-scale features over centimeter-sized areas, facilitated by the use of an algorithm for the rapid, accurate, and automated alignment of probe arrays. Here, nanolithography of thiols on gold substrates demonstrates the generation of features with high uniformity. These patterns are then functionalized with fibronectin for use in the context of surface-directed cell morphology studies.

Here we present a protocol for wide-area scanning probe nanolithography enabled by the iterative alignment of probe arrays, as well as the utilization of lithographic patterns for cell-surface interaction studies.

Grande área varredura sonda Nanolitografia facilitada pelo alinhamento automatizado e sua aplicação para fabricação de substrato para estudos de cultura celular

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.