이 작품은 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust), 글락소 스미스 클라인 (GSK)과 세포 신호 전달을위한 스코틀랜드 연구소 (MRC 단백질 인산화 및 Ubiquitylation 단위의 지금 부분)에 의해 지원되었다.

1. 분석 개발 단계 참고 : 이전에 siRNA의 화면을 시작으로, 분석 개발 단계는 기자 셀 라인과 심사에 중요한 매개 변수를 설정하는 것이 중요합니다. 이것이 화면의 미래의 성공을 뒷받침하므로이 단계에서 상당한 노력을 투자하는 것이 필수적입니다. <ol><li> U20S-HRE 기자 세포주의 저산소증 응답의 특성을, 10 % FBS와 보충 이글 중간 (DMEM) 수정 Dulbeccos 80-90 % 년 합류에 2 × 75cm에게 U20S-HRE 세포의 2 플라스크를 성장. </li><li> 기음 셀 중 하나 술병에서 미디어는 10 ㎖의 PBS로 두 번 씻어 2 ML 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가하고 5 분 동안 37 ° C에서 배양하여 세포를 분리. 8 ML의 DMEM 균일 한 세포 현탁액을 만들 수 상하 10 % FBS와 피펫을 Resuspend 세포. </li><li> 피펫 (20) 중복의 셀 카운팅 챔버 정지 μL, 그리고 자동화 된 셀 커플에 실을 삽입NTER. 셀 카운터 소프트웨어의 &quot;디스플레이 이미지&quot;를 클릭하고 세포의 초점이되어 있는지 확인합니다. &quot;횟수&quot;를 클릭하고 셀 밀도를 기록해 둡니다. 다른 중복에 대해이 단계를 반복하고 평균 셀 밀도를 계산합니다. 60000 세포 / ml의 농도로 DMEM 10 % FBS를 가진 세포를 희석. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 같은 세 개의 열 (예 : A5-H5, A6-H6과 A7-H7) 5 멸균 흰색 벽으로 둘러싸인 96 - 웰 분석 플레이트 및 전송로에 희석 된 세포 100 μL (6000 셀)를 추가 밤새 5 % CO 2에서 가습 37 ° C의 배양기. 참고 : 1 시간, 2 시간, 6 시간, 10 시간 및 24 시간 :이 판은 저산소 노출의 범위에 대한 저산소증 의존 루시 페라 제의 출력을 결정하는 데 사용됩니다. </li><li> 다음 하루의 끝에서, 시간을 기록하고 1 %의 산소에 저산소증 워크 스테이션 세트에 24 시간 저산소증 판을 추가합니다. 24 시간 플레이트 FR을 제거 할 예정이다하기 전에 다음과 같은 아침 시간 10 시간, 6 시간, 2 시간을 계산저산소증 워크 스테이션 옴. 이 시간에, 저산소증의 워크 스테이션에 10 시간, 6 시간, 2 시간 플레이트를 추가합니다. </li><li> 16 mM의 MgCl2를, 2 mM의 DTT, 2 % 트리톤 - X-100, 30 % 글리세롤, 1 mM의 ATP, 1 % BSA, 0.25 mM의 2 배 결합 루시퍼 용해 / 분석 완충액 30 ㎖ (50 mM 트리스 인산염 pH가 7.8을 준비 루시페린 8 μM 나 4 P 2 O 7). 참고 : 나열된 순서대로 구성 요소를 추가하고 BSA 적어도 30 분은 루시페린과 나 4 P 2 O 7의 추가 전에 해산 할 수 있습니다. </li><li> 적절한 시간에 저산소증 워크 스테이션에서 모든 플레이트를 제거합니다. 분석 플레이트의 적절한 우물에 배 루시퍼 용해 / 분석 완충액 100 μl를 추가하고 투명 필름 커버. 철저하게 세포를 용해하기 위해 500 rpm에서 10 분 동안 접시 통에 접시를 흔들어. </li><li> 자동화 된 96 웰 플레이트 루미 랙에 플레이트 스택을 전송합니다. &quot;프로토콜&quot;메뉴에서 &quot;복근 595&quot;을 선택하고 모든 아를 강조LS는 &quot;잘 선택&quot;메뉴에서 화면 플레이트지도에서 읽을 수 있습니다. 그럼 각 판의 평균값을 계산 각각의 발광을 측정하기 위해 &quot;실행&quot;을 클릭합니다. 정상 산소 상태 (0 시간 저산소증) 제어 판의 평균값에 의해 각 저산소증 판의 평균 독서를 분할하여 기자 활동의 저산소증 의존 접이식 증가를 계산합니다. 참고 :이 검사에 적합하도록 강력한 저산소증 의존 루시 페라 제의 반응을 관찰하는 것이 필수적입니다. 기자 활동의 5-10 배의 증가가 우수한 것으로 간주됩니다. </li><li> 4 단 제어 (HIF1A의 siRNA)은 복제 (웰스 A1-D1), (FIH1의 siRNA) (웰스 A12-D12) 복제 개의 낮은 컨트롤이 포함 된 마스터 제어 판을 만들어, 네 개의 버퍼는 반복 실험 (우물 E1-H1)를 제어 네 모든 siRNA를 풀이 200 ㎚의 농도에서 아르 비 표적 siRNA를 제어 복제물 (E12-H12). 참고 : 높고 낮은 컨트롤이 증가하고 DECR 알려진 경로의 규제에 따라 설립각각 저산소증 반응을 완화. 대안 적으로, 라이브러리의 서브 세트를 사용하여 분석 개발은 적절한 컨트롤을 식별하기 위해 사용될 수있다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 멸균 흰색 벽으로 둘러싸인 분석 플레이트에 각 컨트롤의 siRNA의 10 μl를 전송합니다. 10 μL의 0.1 μL의 형질 전환 시약의 형질 믹스를 준비 감소 혈청 배지 (1:100)도 각 컨트롤에 잘 및 전송 형질 믹스 10 μL 당. 최대 피펫 믹스 다운 간략하게하고, 형질 복합체 형성을 할 수 있도록 20 ~ 60 분 동안 휴식을 판을 둡니다. </li><li> U20S-HRE 셀들의 제 플라스크로 75000 세포 / ml의 세포 현탁액을 준비한다. 멀티 채널 피펫을 사용하여, 각각의 형질 전환 혼합물에 세포 현탁액 80 μL (6000 세포)를 추가한다. 24 시간 동안 5 % CO 2 가습 37 ° C 배양기에 플레이트를 전송 한 후 추가로 24 시간 동안 저산소 워크 스테이션에 전송하고 단계에 설명 된대로 루시 페라 제 분석을 수행 1.61.8. </li><li> [3 × (높은 컨트롤 + 저 제어의 표준 편차) / (높은 제어의 의미 - - 낮은 컨트롤의 평균을)] = 1 식 Z를 사용하여 높고 낮은 컨트롤에 대한 Z-계수를 계산한다. 주 : 0.5 ~ 1 사이의 값은 훌륭한 분석을 나타내며위한 노력을해야한다. </li></ol> 2. 기본 화면 주 : 분석 개발 단계에서 이러한 기본 조건이 준비되면, 주 화면은 다음 프로토콜을 이용하여 96 웰 플레이트 포맷 중으로 수행 될 수있다. <ol><li> DMEM 80-90 % 년 합류로 7 × 75cm에게 U20S-HRE 세포의 2 플라스크를 성장 10 %의 V 보충 / V 소 태아 혈청 (FCS). 참고 : 다음은 2.2-2.13은 1 일에 실시해야합니다 단계를 반복합니다. </li><li> 단계 1.9 및 해동 중의 siRNA ubiquitome 리터의 희석 시리즈에 설명 된대로 각 컨트롤의 200 μl를 포함하는 마스터 제어 판을 준비하여 복제 1 시작30 분의 최소 ibrary. 참고 : 각이 잘 컨트롤 비어 열 1 12 17 X 96 - 웰 플레이트에 조립 4 siRNA가 풀을 포함하고 있습니다. </li><li> 층류 후드에서, 라벨 (또는 바코드) 숫자 1-17에서 뚜껑 17 멸균 흰색 벽으로 둘러싸인 분석 플레이트를,의 siRNA 라이브러리 시리즈의 각 판에 해당. </li><li> 마스터 컨트롤 플레이트를 원심 분리기와 siRNA의 모든 siRNA가이 우물의 바닥에 축적하기 위해 라이브러리를 짧게 (2,000 XG에 1 분) ubiquitome. </li><li> 각 플레이트에 대해 동일한 96 웰 팁 스택을 사용하여 17 분석 플레이트에 자동화 된 액체 디스펜서 로봇을 &quot;스탬프&quot;마스터 제어 판에서 각 컨트롤의 10 μl를 사용합니다. </li><li> 17 라이브러리 판의 각각의 신선한 96 웰 팁 스택, 전송 각 10 μl를 사용하여 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하여 해당 분석 플레이트에의 siRNA를 ubiquitome. </li><li> 비 ES를 사용하여 분석 플레이트 (17)에 대해 40 ㎖ 형질 감염 시약을 준비1.10에 수립 된. 참고 :이 셀 디스펜서에서 &quot;죽은 양&quot;을 설명하기 위해 추가 20 ㎖를 포함한다. &quot;죽은 볼륨은&quot;셀 디스펜서 튜브 네트워크 내에서 지속적으로 존재하는 액체의 양을 의미한다. </li><li> 17 분석 플레이트의 각 웰에 형질 전환 시약의 10 μl를 전송하는 자동화 된 세포의 디스펜서를 사용합니다. 형질 전환 시약 복합체 형성 : 간단히 다음 siRNA를 할 수 있도록 20 ~ 60 분 동안 실온에서 여전히 남겨, siRNA의 형질 전환 및 시약을 완전히 혼합 할 수 있도록 진탕 (500 rpm에서 1 분)에 대한 분석 플레이트를 흔들. </li><li> 10 ㎖ PBS로 두 번 두 75cm에게 U20S-HRE 세포의 2 플라스크를 세척하고 5 분 동안 37 ° C에서 2 ML 트립신-EDTA로 분리합니다. 균질 한 세포 현탁액을 만들 위아래로 각각의 플라스크에 피펫으로 8 ML의 DMEM을 여러 번 10 % FBS를 추가합니다. 두 플라스크에서 세포를 결합하고 멸균 50 ML 플라스틱 튜브에 전송할 수 있습니다. </li><li> 피펫으로 세포 농도를 계산20 μL의 셀 카운팅 챔버 중복 된 셀 및 단계 130에 설명 된대로 자동 세포 계수기의 두 판독에서 보통 세포 농도를 산출한다. </li><li> 멸균 플라스틱 용기에 밀리리터 당 75,000 세포의 농도로 DMEM 10 % FBS로 희석하여 세포 현탁액 155 ㎖를 준비. 참고 :이 볼륨은 17 플레이트에 충분하며, 세포 디스펜서 죽은 볼륨에 대한 추가 25 ML을 포함한다. </li><li> 세포의 응집을 제한하는 층류 후드 내부 설정 교반기에 세포 현탁액과 장소에 멸균 자석 교반기를 추가합니다. 세포 현탁액과 자동화 된 세포 디스펜서 평형 잘 당 세포의 80 μL (6000 셀)를 분배하기 위해 설정합니다. </li><li> 자동화 된 세포 디스펜서에, 차례 차례로, 17 판을 각각 배치하고 세포를 분배. 5 그룹의 시간과 스택 플레이트를 기록 한 후 24 시간 동안 5 % CO 2에서 습기가 37 ° C 배양기에서 스택을 배치합니다. 참고 : 최종 농도를siRNA를 풀은 100 ㎕의 총 부피의 20 nm의 것입니다. 참고 : 다음은 2.14-2.15는 2 일에 실시해야합니다 단계를 반복합니다. </li><li> 복제 1 (2.2-2.13)에 대해 1 일에 설명 된 절차에 따라, 2 일에 두 번째 복제를 시작합니다. </li><li> 형질 전환 24 시간 후, 저산소증 워크 스테이션에 무균 환경에서 복제 1에서 전송 플레이트는 1 % 산소로 설정하고 HRE 기자를 유도하기 위해 24 시간 동안 둡니다. 참고 : 다음은 2.16-2.20는 3 일에 실시해야합니다 단계를 반복합니다. </li><li> 복제 1 (2.2-2.13)에 대해 1 일에 설명 된 절차에 따라, 세 번째 복제를 시작합니다. </li><li> 형질 전환 24 시간 후, 저산소증 워크 스테이션에 무균 환경에서 복제 2에서 전송 플레이트는 1 % 산소로 설정하고 HRE 기자를 유도하기 위해 24 시간 동안 둡니다. </li><li> 2 시간 전에, 1 판이 저산소증 워크 스테이션에서 제거하여야한다 복제 1.6에 설명 2X 루시페라아제 용해 / 분석 완충액 200 ㎖를 준비한다. 참고 :이 볼륨에버퍼 저장이 잘 덮여 유지하기 위해 추가로 20 ㎖를 cludes. </li><li> , 24 시간 저산소증 노출과 자동화 된 액체 디스펜서를 사용한 후 저산소증 워크 스테이션에서 1 분석 플레이트를 복제 각 분석 플레이트에 2 배 루시퍼 용해 / 분석 완충액 100 μl를 추가하고 투명 필름 커버 제거합니다. </li><li> 철저 용균 500 rpm으로 10 분 동안 세포 쉐이커에 플레이트를 흔들어. 단계 1.8에 설명 된대로 루미 플레이트 리더 기록 발광에 차례로 각각의 판을 전송합니다. 참고 : 다음은 2.21-2.22는 4 일에 실시해야합니다 단계를 반복합니다. </li><li> 형질 전환 24 시간 후, 저산소증 워크 스테이션에 무균 환경에서 복제 3 전송 플레이트는 1 % 산소로 설정하고 HRE 기자를 유도하기 위해 24 시간 동안 둡니다. </li><li> 복제 1에 사용되는 다음 단계 2.18-2.20하여 복제 2 판을 읽어보십시오. 주 : 다음 단계 2.23는 5 일에 실시한다. </li><li> 다음으로 복제 3 판을 읽고복제 1에 사용 2.18-2.20 단계. </li><li> 기본 화면의 모든 3 개의 반복을 컴파일하고 1.12의 식을 사용하여 각 판의 Z 계수를 계산합니다. 주 : 모든 플레이트는 0.5 미만의 Z 팩터를 가지고있는 경우, 데이터의 품질을 향상시키기 위해이 플레이트를 반복 참고. </li><li> 다음과 같은 수식을 사용하여 높고 낮은 컨트롤에 대한 분산 (CV)의 계수를 계산 컨트롤의 컨트롤 / 평균 100 × 표준 편차. 주 : CV 가능한 한 낮아야, 그것은 15 % 변화를 예상하는 것이 합리적이다. 편차가 상당히 높은 경우에, 플레이트를 반복 참고. </li><li> . × 100 또한, 비 표적을 계산 (NT [- - / (높은 제어의 의미 낮은 컨트롤의 평균) (siRNA의 점수 높은 제어의 의미)] : 다음과 같은 수식을 사용하여 판마다 각각의 siRNA %의 활성화를 계산 식 [NT의 샘플 데이터 / 평균]을 사용하여 각각의 siRNA) 배. %의 활성화 및 NT-방면 모두에 대해, 세 replic의 평균을 계산ATES와 값을 컴파일합니다. </li><li> 원시 데이터를 사용하여, 세 개의 복제에 플레이트 식을 이용하여 상관 관계를 결정하는 방법에 밀접 스피어의 순위 상관 계수 (SRCC)를 계산한다 : <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51572/51572eq1.jpg" width="120" /> 여기서, R = SRCC; D = 각 계급 쌍의 데이터 쌍의 N = 수의 두 숫자의 차이. 참고 :. 하나의 복제가 다른 2 판에 대해 낮은 SRCC가 표시되면 판은 복제 사이의 상관 관계는 1 가까운 값을 줄 것이다, 더 조사하고 그 판을 반복하는 것이 좋습니다. </li><li> (80까지) 2 차 심사에 충분한 관심이되는 siRNA를 결정합니다. (예를 들어, 5 % 미만의 이상 95 % %의 활성화, 이하 0.5 NT 배 또는 1.5 이상 NT 배를 보여주는 모든 siRNA를 선택) 사용자 정의 컷 오프를 사용하거나 클러스터를 검색하는 생물 정보학 또는 지식 기반 추론을 적용 같은 UBL 경로에서 떨어지는 안타. 참고 :일반적으로, 이러한 접근 방식의 조합의 siRNA가 차 심사에 촬영을 결정합니다. </li></ol> 3. 보조 화면 참고 : 확실한 보조 화면이 기본 화면에서 관심의 80 siRNA를 최대 기준으로 수행합니다. 이 숫자는 편리하게 기본 화면에 따라 전체 컨트롤과 하나의 96 웰 플레이트에 도금 각 복제 (2.2 참조)로 수행 할 수 있습니다. 그것은 기본 화면에서 식별 된 규제 재현성 같은 표현형을 유도하고,이 최종 차 / 디컨 볼 루션 화면을 통해 수행되어야한다 명중되는 환자 분류 결정을 정제에 도움이되는지 확인하는 것이 매우 유용하다. <ol><li> 10 % FBS와 DMEM 80-90 % 년 합류에 1 개의 x 75cm에게 U20S-HRE 세포의 2 플라스크를 성장. </li><li> 판 번호와 기본 화면 히트 위치를 확인하고, 열 1을 떠나, 보조 스크린 체리 마스터 플레이트를 포착에 새 위치를 계획D 컨트롤에 대한 무료 12. 1.9에서와 같이하지만, 50 μL의 각 컨트롤의 전체 볼륨 제어 마스터 판을 준비합니다. </li><li> 최소 30 분의 ubiquitome 라이브러리의 두 번째 희석 시리즈 (체리 따기 개인의 siRNA 풀에 따로) 해동. 판 짧게 (2,000 XG에 1 분)을 원심 분리 한 후 체리에 새로운 판 위치에 보조 화면 siRNA를 50 μl를 추가 마스터 플레이트를 들었다. </li><li> 다음 수정을 기본 화면에 대한 설명 동일한 기본 프로토콜을 사용하여 보조 화면을 수행한다 : (a) 복제 당 하나의 분석 플레이트에서 같은 날에 세 개의 반복을 실행하고 (b)에 따라 시약의 볼륨을 조정합니다. </li></ol> 4. 차 / 디컨 볼 루션 화면 참고 : 차 또는 컨볼 루션 검사가 보조 화면에서 20 siRNA를 최대에서 수행됩니다. 이 단계는 일본어 똥에서 각각의 siRNA를 이용하여 넉다운의 효과를 조사하는 것이다네 L. 일반적으로, 각 풀에서 적어도 두 개의 개별 siRNA의 이중 가닥 관찰 된 표현형은 siRNA를 표적 이탈 효과로 인해이 아니라고 확신의 합리적인 학위를 가지고 동일한 표현형을 이끌어 낼 것이다. 또이 단계에서 신뢰성을 높이기 위해, 문제의 유전자를 표적으로 추가적인 개별의 siRNA 이중 가닥을 설계하고 관련 표현형을 유도하는 능력에 대해 시험 할 수있다. 이 실험의 결과는 H는 = 0.6 이상 (즉, 5 개인 siRNA를 중 적어도 3 표현형을 유도 곳이) 6 허용 간주되는 H 점수를 계산하는 데 사용할 수 있습니다. <ol><li> 10 % FBS와 DMEM 80-90 % 년 합류 한 75cm에게 U20S-HRE 세포의 2 플라스크를 성장. </li><li> 컨트롤에 대한 무료 열 1과 12를 떠나, 차 화면 마스터 접시에 명중 된 각각의 네 개의 개별 siRNA의 이중 가닥의 위치를​​ 계획하여 차 화면 접시지도를 만듭니다. 1.9으로 만 총 컨트롤 마스터 플레이트를 준비합니다50 μL의 각 컨트롤의 볼륨. </li><li> 디컨 볼 루션 / 개인 siRNA의 판을 해동 세 × 10 μL의 복제하고 편안한 20 ㎕의 초과를 허용하는 판지도 (4.2)에 따라 차 화면 마스터 플레이트의 각 웰에 각각의 siRNA를 (200 NM)의 50 μl를 추가 . </li><li> () 복제 당 하나의 분석 플레이트에서 같은 날에 세 개의 반복을 실행하고 (b)에 따라 시약의 볼륨을 조정 : 다음 수정을 기본 화면에 대한 설명 동일한 기본 프로토콜을 사용하여 차 화면을 수행 </li></ol> 참고 : 이상적으로 개인의 siRNA 이중 가닥에 대한 임계 값이 같은 엄격한 설정해야 차단 풀로. 그러나, 적어도 하나의 다른 양면은 설정된 임계 값 내에 특히 여기서 개별적인 siRNA가 10-20 %의 임계 값을 완화하도록 허용 될 수있다. 그것은 siRNA를의 개별 효과는보다 적은 수 있다는 것을 염두에두고 가치 베어링입니다반대로 수영장, 일부의 경우 개별 된 siRNA는 (농도를 차지하더라도) 풀에 존재하는 경우에 비해 분리의 세포 표현형에 강한 효과를 표시 할 수 있습니다.

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	<li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins.">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458, 422-429 (2009).</li><li>Schulman, B. A., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+activation+by+E1+enzymes:+the+apex+for+downstream+signalling+pathways.">Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 319-331 (2009).</li><li>Siomi, H., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+road+to+reading+the+RNA-interference+code.">On the road to reading the RNA-interference code.</a> Nature. 457, 396-404 (2009).</li><li>Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensing+by+metazoans:+the+central+role+of+the+HIF+hydroxylase+pathway.">Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway.</a> Mol Cell. 30, 393-402 (2008).</li><li>Melvin, A., Mudie, S., Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+remodeler+ISWI+regulates+the+cellular+response+to+hypoxia:+role+of+FIH.">The chromatin remodeler ISWI regulates the cellular response to hypoxia: role of FIH.</a> Mol Biol Cell. 22, 4171-4181 (2011).</li><li>Bhinder, B., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+analyzing+actives+in+random+RNAi+screens:+introducing+the+&amp;#34;H+Score&amp;#34;+for+hit+nomination+&amp;+gene+prioritization.">A simple method for analyzing actives in random RNAi screens: introducing the &amp;#34;H Score&amp;#34; for hit nomination &amp; gene prioritization.</a> Comb Chem High Throughput Screen. 15, 686-704 (2012).</li><li>Bett, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-body+component+USP52/PAN2+is+a+novel+regulator+of+HIF1A+mRNA+stability.">The P-body component USP52/PAN2 is a novel regulator of HIF1A mRNA stability.</a> Biochem J. 451, 185-194 (2013).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Birmingham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+methods+for+analysis+of+high-throughput+RNA+interference+screens.">Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens.</a> Nat Methods. 6, 569-575 (2009).</li><li>Stagg, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TRC8+E3+ligase+ubiquitinates+MHC+class+I+molecules+before+dislocation+from+the+ER.">The TRC8 E3 ligase ubiquitinates MHC class I molecules before dislocation from the ER.</a> J Cell Biol. 186, 685-692 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF146+is+a+poly(ADP-ribose)-directed+E3+ligase+that+regulates+axin+degradation+and+Wnt+signalling.">RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling.</a> Nat Cell Biol. 13, 623-629 (2011).</li><li>Jackson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi.">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li><li>Birmingham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+UTR+seed+matches,+but+not+overall+identity,+are+associated+with+RNAi+off-targets.">3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets.</a> Nat Methods. 3, 199-204 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whither+RNAi.">Whither RNAi.</a> Nat Cell Biol. 5, 489-490 (2003).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

포유 동물 세포의 게놈 전체의 siRNA 스크린의 사용은 별개의 생물 학적 경로의 새로운 규제를 식별하는 매우 가치있는 것으로 입증되었습니다. 여기서, 우리는 저산소증 HIF1A - 매개 세포 반응의 레귤레이터를 식별하기 위해 타겟 ubiquitome의 siRNA를 화면의 사용을 설명했다. 그들은 일반적으로 저렴 빠르고, 쉽게 관리 할 수 만 수사관 7, 10, 11, 관심있는 통로의 구성 요소에 대한 보고서입니?...

유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 분자 (UBLs)와 단백질의 변형은 다양한 생물 학적 경로와 스트레스 반응을 조절하는 광대 한 생화학 시스템을 나타냅니다. 타겟 단백질에 UBLs의 공유 결합은 안정성, 현지화, 기능 또는 기판 (1)의 interactome를 조절하는 다양한 결과를 가질 수 있습니다. UBL 수정의 기초가되는 효소 단계는 첫 번째 유비퀴틴 설립, 지금 SUMO, NEDD8, ISG15 및 FAT10를 포함한 대부분의 UBLs와 수정을위한 패러다임의 역할을 하였다. 수정이 발생하는 경우, UBL의 diglycine 모티프의 카르 복실 그룹은 제 E2 컨쥬 효소의 활성 사이트에 전송된다 시스테인 고 에너지 티올을 형성하기 위해 E1 활성화 효소에 의해 활성화된다. E2는 (보통) 측쇄 (isopeptide)을 생성 대상 라이신 잔기가 결합이 상 UBL의 이동을 중재하는 기판 - 결합 E3 리가 아제와 상호 작용. 수정의 연속 라운드 선형 유비퀴틴 체인을 만들 유비퀴틴을위한 일곱 라이신의를 통해 발생할 수있는 기판 상에 또는 N-말단 메티오닌을 통해 isopeptide 체인을 구축하기 위해 발생할 수 있습니다. 이러한 수정은 이전의 전문 단백질 분해 효소에 의해 UBL 제거에 새로운 상호 작용 모티브를 생성하고 분해를 위해 단백질을 대상으로 다양한 목적으로 별도의 토폴로지를 형성한다. 유비퀴틴의 경우 두 개의 E1 효소, 30 ~ 40 E2 활용시키는 효소, 적어도 600 E3 ligase라는 약 100 deubiquitylating 효소 (더빙)가있다. 경로가 다른 10 정도 UBLs 덜 팽창 동안, 전반적인 ubiquitome 복잡성은 특정 UBL 개질 생물학적 결과에 큰 다양성을 제공한다. UBL 생물학의 주요 발전하였으나 그러나, 이러한 ubiquitome 구성 요소의 대부분의 정확한 세포의 역할은 잘 알려져 있지 않은 상태이다. 짧은 INT의 사용erfering 리보 핵산 (siRNA를)은 개별 유전자의 역할은 다른 생물 학적 맥락 3에서 조사 할 수 있도록 구체적으로 인해 파괴 세포의 mRNA를 표적으로하는 siRNA를의 능력에 역 유전학의 강력한 도구로 떠오르고있다. 전체 게놈 화면은 많은 세포 과정의 새로운 규제를 확인하고 유효성을 검사하는 데 사용되었으며, 넓은 과학 사회에 접근 할 유용한 데이터의 재산을 만들었습니다. 전체 게놈 스크린은 매우 유용 입증하면서 그러나, 대상 화면들이 저렴 점점 인기를 끌고있다, 빨리 만 조사가 가장 관심있는 게놈의 구성원에 더 적은 데이터 관리 및보고를 포함한다. 따라서, 더 나은 세포 프로세스 UBL 가족 구성 요소에 관여하는 이해하기 위해, 우리는 모든 알려진 ubiquitome의 구성 요소를 예측을 대상으로하는 인간의 siRNA 라이브러리를 컴파일합니다. 이것은 UBLs, E1 활성화 효소, E2의 공액을 포함효소, E3의 리가 제, 유비퀴틴 결합 도메인 (UBD) 함유 단백질과 더빙. 이 라이브러리는 그러므로 이러한 경로를 지배하는 신규 UBL 성분의 공정한 식별을 허용 별개 생물학적 문제 리포터 세포주의 넓은 범위에 대하여 스크린 할 수있다. 다음 프로토콜은 엄격한 대상의 siRNA에게 저산소증에 HIF1A 의존 반응의 새로운 규제를 식별 할 수 ubiquitome 화면을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 정상 산소 분압에서 HIF1A는 폰 Hippel 린다 우 (VHL) E3 리가 단지 4 인식하고 분해 대상이됩니다 프 롤릴 수산화이 적용됩니다. 저산소증은 HIF1A의 안정화로 이어지는 프 롤릴 하이드 록을 억제하고 그 이후의 저산소증 반응 요소 (HRES)에 결합하는 유전자 발현을 구동 할 수 있습니다. 여기서, 우리는 안정적 하이록 세 탠덤 복사본 제어 하에서 반딧불 루시퍼 라제를 발현 U20S 골육종 세포를 사용하여 화면을 설명poxia 응답 요소 (HRE U20S-세포) 5. 리포터 활성의 강력한 판독이 달성 적절한 양성 및 음성 대조군으로 결합 할 수있는 경우이 프로토콜은 모든 생물학적 경로에 대해 적응 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:288px;">Automated Liquid Dispenser</td>
			<td style="width:147px;">Fluid-X</td>
			<td style="width:200px;">XPP-721</td>
			<td style="width:156px;">http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Automated cell counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
			<td>http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hypoxia Workstation</td>
			<td>Ruskin</td>
			<td>In vivo2 300</td>
			<td>http://www.ruskinn.com/products/invivo2300</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Automated Cell Dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Matrix Wellmate</td>
			<td>http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Plate Shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Titramax 1000</td>
			<td>http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Luminometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Envision 2104 Multilabel Reader</td>
			<td>http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">White Walled Assay Plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655083</td>
			<td>http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Clear Plate Film</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1450-461</td>
			<td>http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Name of the Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">siRNA library</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>On-Target Plus</td>
			<td>http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Lipofectamine RNAimax</td>
			<td>http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Reduced Serum Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Optimem</td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tryspin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sirna screening to identify ubiquitin and ubiquitin-like system regulators of biological pathways in cultured mammalian cells

유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 분자 (UBLs)와 단백질의 번역 후 변형은 저산소증 응답, proteostasis, DNA 손상 반응 및 전사 등 다양한 생물 학적 경로를 조절하는 동적 인 세포 신호 전달 네트워크로 부상하고있다. 더 나은 UBLs이 인간의 질병에 관련된 경로를 조절하는 방법을 이해하기 위해, 우리는 인간의 siRNA를 컴파일 &quot;ubiquitome&quot;모든 알려진 UBL 시스템 경로의 구성 요소를 예측을 대상으로 1,186 siRNA의 이중 풀로 구성된 라이브러리입니다. 이 라이브러리는 UBL 성분은 당해 통로의 포지티브 또는 네거티브 레귤레이터 역할 결정하는 다양한 생물학적 경로의 기자 발현 세포주의 범위에 대해 스크리닝 할 수있다. 여기에서, 우리는 전사 기반의 루시 페라 제 기자를 사용하여 저산소증에 HIF1A - 매개 세포 반응의 ubiquitome - 레귤레이터를 식별하기 위해이 라이브러리를 사용하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 초기 분석 개발 단계1 차, 2 차 및 3 차 / 컨볼 루션 스크리닝 : 세 단계로 화면을 수행하기 전에 세포주의 선별 적합한 매개 변수를 설정하기 위해 수행된다. 그것은 단지 조사가 가장 관심있는 통로의 구성원에 대한보고의 이점을 제공으로 전체 게놈의 siRNA 라이브러리를 통해 대상의 사용은 점점 더 인기를 끌고있다. siRNA의 심사의 본질적인 한계에도 불구하고, 특히 가양는 siRNA를 표적 이탈 효과로 인한 문제의 경로의 진정한 새로운 규제의 식별은주의 깊게 수행 제어 일련의 실험을 수행함으로써 극복 할 수있다 이러한 단점을보다 큽니다.

이전 검사에, U20S-HRE 세포의 저산소증 응답이 설정됩니다. U20S-HRE 세포는 하류 저산소증에 노출 (그림 1A)에 HIF1A/HIF1B의 이종 구속 된 저산소증 응답 요소의 세 가지 직렬 사본의 융합 반딧불 루시 페라로 구성된 기자의 구조를 표현한다. 세포를 저산소 노출 스크리닝을위한 가장 효율적인 반응을 생성하는 확립 배의 범위 저산소증 워크 스테이션에 배치된다. U20S 세포는 따라서 루시 페...

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siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

여기, 우리는 저산소증에 HIF1A - 매개 세포 반응의 새로운 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 규제를 식별 할 수있는 대상의 siRNA &quot;ubiquitome&quot;화면을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 기자 활동 중 강력한 읽기가 사용할 수있는 모든 생물학적 경로에 적용 할 수 있습니다.

배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

sirna-screening-to-identify-ubiquitin-ubiquitin-like-system

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K 조회수.  University of Dundee.  여기, 우리는 저산소증에 HIF1A - 매개 세포 반응의 새로운 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 규제를 식별 할 수있는 대상의 siRNA "ubiquitome"화면을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 기자 활동 중 강력한 읽기가 사용할 수있는 모든 생물학적 경로에 적용 할 수 있습니다. 

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MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

포유 동물 세포에서 RNAi 심사를위한 선교 esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

연구

생물학

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

임무 LentiPlex는 포유 동물 세포에서 shRNA 도서관 검사를 풀링

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

유전자 발현의 DNA 상호 작용, 디스 전사 레귤레이터, 그리고 소설 안티 종양 에이전트를 식별 : 단백질을 연구하는 정량 분석

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

포유류의 핵 수용체 잔류를 확인하기 위해 효모 두 하이브리드 시스템을 반전하는 리간드 및 / 또는 길항제와 상호 작용

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

배양 된 포유 동물 세포에서 대규모 병렬 리포터 분석 실험

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the large size of the human BRCA2 protein (approximately 390 kDa). We report modifications of standard siRNA transfection and immunoblotting protocols to silence human BRCA2 and detect endogenous BRCA2 protein, respectively, in human epithelial cell lines. Key steps include a high siRNA to transfection reagent ratio and two subsequent rounds of siRNA transfection within the same experiment. Using these and other modifications to the standard protocol we consistently achieve more than 70% silencing of the human BRCA2 gene as judged by immunoblotting analysis with anti-BRCA2 antibodies. In addition, denaturation of the cell lysates at 55 &#176;C instead of the conventional 70-100 &#176;C and other technical optimizations of the immunoblotting procedure allow detection of intact BRCA2 protein even when very low amounts of starting material are available or when BRCA2 protein expression levels are very low. Efficient silencing of BRCA2 in human cells offers a valuable strategy to disrupt BRCA2 function in cells with intact BRCA2, including tumor cells, to examine new molecular pathways and cellular functions that may be affected by pathogenic BRCA2 mutations in tumors. Adaptation of this protocol for efficient silencing and analysis of other &#39;large&#39; proteins like BRCA2 should be readily achievable.

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

의 침묵<em&gt; BRCA2</em&gt; 배양 된 인간 세포에 소설 BRCA2 규제 생물학적 기능을 확인하는

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

포유 동물 세포에서 RNAi 심사를위한 선교 esiRNA

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

임무 LentiPlex는 포유 동물 세포에서 shRNA 도서관 검사를 풀링

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리

유전자 발현의 DNA 상호 작용, 디스 전사 레귤레이터, 그리고 소설 안티 종양 에이전트를 식별 : 단백질을 연구하는 정량 분석

포유류의 핵 수용체 잔류를 확인하기 위해 효모 두 하이브리드 시스템을 반전하는 리간드 및 / 또는 길항제와 상호 작용

배양 된 포유 동물 세포에서 대규모 병렬 리포터 분석 실험

이미징 로컬 CA

의 침묵

배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영

요약

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포유 동물 세포에서 RNAi 심사를위한 선교 esiRNA

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

임무 LentiPlex는 포유 동물 세포에서 shRNA 도서관 검사를 풀링

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리

유전자 발현의 DNA 상호 작용, 디스 전사 레귤레이터, 그리고 소설 안티 종양 에이전트를 식별 : 단백질을 연구하는 정량 분석

포유류의 핵 수용체 잔류를 확인하기 위해 효모 두 하이브리드 시스템을 반전하는 리간드 및 / 또는 길항제와 상호 작용

배양 된 포유 동물 세포에서 대규모 병렬 리포터 분석 실험

이미징 로컬 CA

의 침묵

배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영