Los autores agradecen a sus fuentes de financiación, el Programa de Educación del Instituto Médico Howard Hughes Pregrado Ciencias de la Universidad de William y Mary; Patrocinador de la donación: NIH (SMS); Grant número: R15NS067566. También reconocen el apoyo del Colegio de William y Mary, Departamento de Biología y la Facultad de Artes y Ciencias de la ayuda con el cuidado de animales.

Declaración de Ética: Los métodos se llevaron a cabo con los pinzones cebra domesticados de la colonia de cría en el College of William and Mary. Todos los procedimientos que se siguen las pautas RSPCA 23 y fueron aprobados por el Colegio de William y Mary OLAW (Office of Laboratory Animal Welfare) Animal Welfare Assurance (# A3713-01) y tenía Comité Institucional Cuidado de Animales y Uso (IACUC) aprobación (# 2013-06 -02-8721-dacris). 1. Recolección de huevos e incubación <ol><li> Establecer pares de pinzones cebra en una luz 14:10: oscuridad ciclo. Suministro de alimentos, agua, heno, y una ad libitum caja nido. Nota: La atención de rutina y de cultivo para los pinzones cebra ha sido bien descrita 23. </li><li> Prepare una incubadora de pollo estándar con estantes inclinables. Nota: Mantener la incubadora artificial a 37,5 (+ / - 1) ° C con el 80 - 95% de humedad mediante la adición de agua a la parte inferior de la incubadora sobre una base diaria. Deje que la incubadora se equilibre durante dos díasantes de usar. <ol><li> Seleccione tazas pequeñas de alimentación (5 x 7,6 cm) de al menos 2,5 cm de profundidad para mantener los huevos en la incubadora. Línea de la parte inferior y los bordes inferiores de la taza con dos capas de toallas de papel de modo que la copa se rellena, mientras que todavía permite que los huevos rueden fácilmente. Coloque estos vasos en los estantes de inclinación de la incubadora. Nota: El exceso de relleno puede inhibir la rodadura, lo que evitará la incubación exitosa debido a la adhesión de embriones al interior shell. </li></ol></li><li> Recoge los huevos a las dos horas después del inicio del ciclo de luz. Nota: Esto minimiza las discrepancias en fase de desarrollo para un tiempo de incubación dado debido a la incubación de los padres. <ol><li> Recoge los huevos suavemente con el pulgar y el dedo índice en la punta y la base a lo largo de la longitud del huevo. Utilice un aburrido, suave 4B grafito lápiz para marcar la fecha prevista y el tiempo de recogida de la jerarquía. Nota: El lápiz 4B más suave reduce el riesgo de que el lápiz romper la cáscara del huevo frágil. </li><li> 1.3.2) Colocar 1-5 huevos etiquetados en cada cen la incubadora de modo que los huevos pueden rodar libremente para evitar la adhesión embrionaria al interior de la concha. Nota: La colocación de más de 5 huevos en una taza puede impida la rodadura de los huevos individuales y reducir la viabilidad de los embriones. </li></ol></li></ol> 2. La eliminación del embrión a partir de huevo <ol><li> Para prepararse para la disección, juntad a los siguientes materiales: un bisturí limpio, fórceps de punta fina, y dos de punta fina fórceps extra. Coloque 10 x 10 cm pesan documento sobre la base del microscopio de disección para proporcionar una superficie limpia, no absorbente para la disección. Nota: El papel sopesar es crucial porque permite la fácil manipulación de la yema de huevo y es la mejor superficie para cortar las delicadas membranas con un bisturí. </li><li> Preparar una parte alícuota de solución salina tampón de fosfato (1X PBS) en un tubo de polipropileno de 50 ml, y adquirir al menos tres pipetas de transferencia y un pequeño cubo de residuos. Si la fijación de los embriones, prepare una alícuota del 4% de paraformaldehído (PFA) Precaución:. Vapores PFA son tóxicos, und todos los pasos que involucran PFA se debe hacer dentro de una campana de extracción para minimizar la exposición. Si el flash se congelan los embriones, obtener nitrógeno líquido y mantenerlo cerca del microscopio de disección. La esterilidad no es un problema para este protocolo de disección, pero asegúrese de que todos los materiales están limpios. </li><li> Retire el huevo de la incubadora en el punto de tiempo necesario para la etapa deseada como se describe en la guía de puesta en escena pinzón cebra 22. Nota: Retire los huevos después de 36 horas de incubación para diseccionar etapa 6 embriones (Figura 4A) 22 y retirar los huevos después de 56 horas de incubación para diseccionar etapa 12 embriones (Figura 3) 22. </li><li> El uso de una lámpara de iluminación de fibra óptica, vela del huevo sosteniéndolo sobre su eje y el brillo de luz vertical a través del huevo para iluminar el interior. Coloque la punta de la luz detrás del huevo y localizar la yema y el embrión en desarrollo. <ol><li> Coloque el bisturí en el lado opuesto de la yema y el huevo cortado a lo largo de punta abase con presión leve. </li></ol></li><li> Extraiga el contenido del huevo aplicando cuidadosamente la presión en la punta y la base del huevo con el pulgar y el dedo índice, o haciendo palanca suavemente aparte la cáscara del huevo a lo largo del corte con una pinza. Abra el huevo directamente sobre el papel sopesar de manera que la yema avanza suavemente hacia fuera. </li><li> Examinar la yema de la zona blanca de unión, que es visible como un anillo blanco débil que rodea el desarrollo embrionario y orientar la yema utilizando extra fino con punta de unas pinzas de modo que el embrión se encuentra en el centro. Nota: Si no se observa un círculo blanco débil en la superficie de la yema de huevo, tomar las pinzas finas y suavemente tirar la yema otra vez hasta que el embrión se encuentra en la parte superior de la yema. Nota: Para las etapas 1 - 9 22, el disco embrionario es de menos de 6 mm de diámetro y es visible como un disco débil, ligeramente opaca en la superficie de la yema - véase la figura 1 para referencia. Para las etapas 10 y mayores de 22, la sangre se acumula permiten mejorar visibilidad del embrión, pero tenga cuidado de no perforar el saco vitelino, ya que esto hace que la localización del embrión difícil. </li></ol> 3. Separación de embriones a partir de tejido extra-embrionarias <ol><li> Perforar los bordes de la yema para aliviar la presión (Figura 1B), y hacer cortes individuales a través de la longitud de la yema de diámetro junto con el disco embrionario. Repita hacer estas líneas diagonales hasta que la sección de la yema de huevo que contiene el embrión ha sido separado con éxito (Figura 1B). Nota: Este paso permite que la masa de yema permanezca intacto, pero la presión reducida en la superficie de la yema permite una mayor precisión en el corte alrededor del embrión, la prevención de daños a estructuras embrionarias. </li><li> Quitar los bordes de la yema con una pipeta de transferencia. Nota: Retire la mayor cantidad de yema de lo posible, pero deja una pequeña cantidad para que el embrión no se adhiere a la superficie seca del papel sopesar y desgaste. </li><li> Lave el disco embrionario por dispensacióning 1X PBS a un ángulo de 45 ° hacia la parte inferior del embrión. Coloque la punta de la pipeta de transferencia siguiente-a no más arriba-el disco embrionario. Si las necesidades de yema adicionales a ser removidos, separar cualquier yema con el bisturí en el papel pesan antes de transferir el embrión a la placa de Petri. Nota: Este método elimina el embrión a partir de la superficie del papel de pesar. </li><li> Transferir el embrión utilizando una pipeta de transferencia junto con un volumen mínimo de 1X PBS a una pequeña, de plástico placa de Petri. Lavar el embrión mediante la adición de más de 1X PBS en la placa de Petri y el goteo de 1X PBS cerca de, pero no directamente sobre, el embrión. Agitar la placa de Petri para lavar y quitar la yema residual, incline la placa de Petri, y eliminar los desechos 1X PBS con la pipeta de transferencia. NOTA: Cuando se retira el PBS 1X, el embrión típicamente no se adhiere a la parte inferior de la placa de Petri porque la superficie de plástico es resbaladiza con 1X PBS residual. Sin embargo, más 1X PBS se puede añadir si el embrión se pega al plato. Si fijación tél embrión, siga los pasos 3.5 y 3.6. Si el flash congelar el embrión, vaya al paso 3.8 inmediatamente. </li><li> Si la fijación del embrión para la hibridación in situ, añadir inmediatamente PFA al 4% a la placa de Petri para sumergir el embrión. Goteo 4% de PFA directamente sobre la parte superior del embrión con el fin de aplanarlo; esto evita que el embrión se curve. Fijar el embrión en el 4% PFA a 4 º C durante 12 h. <ol><li> Después de la fijación, deshidratación embriones en metanol clasificado soluciones (MeOH) y almacenarlos a -20 ° C en el 100% de MeOH. </li></ol></li><li> Si el embrión es entre las etapas 1 - 8 22, quitar la membrana vitelina adherido al embrión. Nota: Este paso puede realizarse durante o después de la fijación. Los embriones de menos de la etapa 8 22 no son fáciles de visualizar porque se adhieren a la membrana vitelina, oscureciendo las estructuras clave, como se ve en la Figura 2A. <ol><li> Agarre el borde de la membrana que se extiende más allá de la zona de cruce con unas pinzas finas adicionales. Carefully voltear el embrión durante varias veces para lavar gránulos de yema de residuales y para aflojar la adherencia del disco embrionario a la membrana vitelina. Nota: No toque el centro del embrión, ya que podría dañar las estructuras embrionarias. </li><li> Si hay un espacio no aparece entre la zona de la unión y la membrana vitelina, arañar suavemente la zona de unión con el extra fino con punta de pinzas para aflojarlo de la membrana vitelina. Agarre la membrana vitelina con el extra fino con punta de unas pinzas y suavemente tire de él lejos del embrión. Si es necesario, tire suavemente el embrión lejos de la membrana vitelina agarrando el borde periférico del disco embrionario en la zona de unión. </li><li> Deseche la membrana vitelina en riesgo biológico 1 residuos (nivel de bioseguridad 1) después de la eliminación. </li></ol></li><li> Al llevar a cabo un ensayo de ISH en etapas embrionarias jóvenes, seguir los protocolos integrales estándar mount ISH de embriones de pollo de 24, 25, pero tenga en cuenta las siguientes sugerencias. <ol&gt; <li> Para reducir el daño a los embriones durante el procedimiento de ISH, utilizar un único vial de vidrio de 5 ml con un tapón de rosca para cada embrión. Llenar los frascos con 2-3 ml de solución, lo que garantiza que los embriones están completamente sumergidos. Viales inclinar la cabeza verticalmente mediante la colocación de viales de 5 ml en un bastidor de espuma de poliestireno (o cualquier rack que mantendrá los viales seguro) que está fijado a un nutator. Nota: Esta precaución evita que el embrión a partir de medio de corte, que puede ocurrir cuando entra en contacto con la tapa del vial durante nutación horizontal. </li><li> Para los embriones etapa 0 - 6 22, el tratamiento con 5 mg / ml de proteinasa K en 1X PTW durante 5 minutos a temperatura ambiente. Treat embriones realizaron 7 - 12 22 10 con proteinasa g / ml en 1X PTW K durante 10 min a 37 ° C para reducir la tinción de fondo. </li><li> Para producir una reacción de color suficiente para detectar bajos niveles de expresión génica en las etapas 1 - 10 22, incubar con una concentración de sonda de 10 g / ml durante 12 horas. Para las etapas de mayor edad, se incuban con 1 &amp; #956, g / ml concentración de la sonda a 60 ° C. </li></ol></li><li> Si el flash-congelación del embrión, agregar rápidamente 2 - 3 ml de PBS 1X a la cápsula de Petri después de la disección y la inclinación de la placa de Petri para separar el embrión a partir de los gránulos de yema. Retire el líquido y repetir 2-3 veces para eliminar toda la yema. Usando fino con punta de pinzas, la transferencia de embriones a un tubo de microcentrífuga de pre-marcado y congelación ultrarrápida en nitrógeno líquido antes de almacenar a -80 ° C. </li></ol> 4. EdU Ensayo de proliferación celular. Incorporación y Detección de EdU en Zebra Finch embriones. <ol><li> Candle el huevo utilizando una lámpara de iluminación de fibra óptica para localizar el embrión o yema. </li><li> Marcar el lado del huevo opuesta a la ubicación del embrión o yema dentro del huevo para asegurar que el embrión no se dañe durante el proceso de microinyección. </li><li> Línea de un plato de plástico de 60 mm con plastilina y moldearlo en la forma de un recipiente para contener el huevo en la orientación deseada. El punto marcado debe serorientada para permitir la inserción de la aguja de microinyección usando el micromanipulador. Nota: La arcilla se estabilizará el óvulo durante la microinyección y durante la incubación en el paso 4.11. </li><li> Tire de dos agujas de microinyección capilares de vidrio. Blunt una aguja para hacer un agujero en el huevo en el punto marcado. Preparar la segunda aguja de microinyección para inyección por backloading con aceite mineral y de insertarlo en la microinyector. </li><li> Ajuste el volumen de la solución liberada por inyección a 59,8 nl en la microinyector. </li><li> Cargue la aguja de microinyección con la solución madre EdU 10 mM. </li><li> Crear un agujero en la cáscara en el punto marcado con el capilar de vidrio roma, teniendo cuidado de no romper la cáscara ni deje caer pedazos de la cáscara de huevo en la cavidad. Oriente el huevo de modo que el orificio está en un ángulo de 45 °, permitiendo que la aguja de microinyección que se inserta directamente a través de la cavidad para la yema de huevo o embrión. </li><li> Usando el micromanipulador, inserte elcargado aguja de aproximadamente 1,0 cm en la cavidad. </li><li> Se inyecta la cantidad deseada de la solución EdU directamente sobre el embrión en desarrollo o yema de huevo. Nota: Un máximo de 478 nl de EdU puede inyectarse sin resultado de muerte embrionaria. </li><li> Inmediatamente envolver el huevo y el titular de la arcilla con múltiples capas de envoltura de plástico para cubrir el huevo y el plato para evitar la desecación del embrión durante la incubación. Tape los bordes de la envoltura de plástico en el fondo del plato para evitar que el plástico se desenvuelva durante la incubación. Nota: El papel de plástico sólo se debe quitar inmediatamente antes de la disección. </li><li> Permitir que las células proliferantes recién para incorporar la UDE incubando el huevo a 37 ° C hasta que se alcanza la etapa deseada. Después de la inyección, no regrese huevo para inclinar estantes en incubadora. Coloque el plato de barro revestida de plástico envuelto en una superficie estable dentro de la incubadora. </li><li> Quite la envoltura de plástico y diseccionar el embrión siguiendo el protocolo mencionado.Fijar el embrión en PFA al 4% y se incuba 12 horas a 4 ° C como se describe anteriormente. Después de la fijación, se lava con etanol al 100% (EtOH) durante 5 minutos y guardar en fresco 100% de EtOH a -20 ° C hasta su posterior análisis. </li></ol> 5. EdU &quot;clic&quot; Protocolo de Reacción Los pasos siguientes son todas realizadas en viales de vidrio. <ol><li> Rehidratar embriones con sucesivos lavados de 5 min de los siguientes: </li><li> EtOH, EtOH al 75% y el 25% desionizada destilada estéril (SDD) de agua, 50% de EtOH y 50% de agua sdd, EtOH al 25% y el 75% 1X PTW, 100% 1X Ptw </li><li> Lavar tres veces en 100% 1X PTW durante 10 min cada uno. </li><li> Diluir el aditivo tampón de reacción (Kit de componentes F) mediante la combinación de 1 parte de la solución tampón madre 10X (10 l) y 9 partes de SDD agua (90 l). </li><li> Preparar la mezcla de reacción en un tubo separado mezclando los siguientes: 875 l de PBS 1X, 20 l de CuSO 4, 5 l de azida, 100 l diluida aditivo tampón de reacción.Nota: El volumen de la mezcla de reacción puede ser reducido. La reacción funcionará si el embrión está completamente cubierto en la mezcla de reacción. Añadir el aditivo tampón de reacción diluida (paso 5.3) inmediatamente antes de su uso. Todas las etapas subsiguientes se llevan a cabo en la oscuridad. Cubra los embriones con papel de aluminio para protegerlo de la luz. </li><li> Cubrir los viales con papel de aluminio, y se incuba verticalmente a temperatura ambiente durante dos horas, colocándolos en un bastidor de espuma de poliestireno unido a un nutator. </li><li> Lave los embriones 3 veces en 1X PBS fresco durante 10 min cada uno. </li><li> Incubar los embriones en fresco 4% PFA durante la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar 3 veces en 1X PBS durante 10 minutos cada uno y guardar en 1X PBS fresco a 4 ° C. Cubra los embriones con papel de aluminio hasta su posterior análisis. </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+the+developing+avian+telencephalon:+Regional+timing+and+brain+subdivision+continuities.">Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities.</a> The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El reciente desarrollo de una guía de puesta en escena embriológico 22 y anotación del genoma del pinzón cebra hacen un organismo modelo deseable para los estudios del desarrollo. Sin embargo, el pequeño tamaño y la fragilidad de los embriones pinzón cebra, que van de 3 a 7 mm en los pasos 1 - 10 22, pueden hacer disecciones difícil 11, 14. Localizar y eliminar limpiamente embriones a partir de la superficie de la yema puede ser un reto. Este protocolo proporciona detalles suficientes para realizar el procedimiento con facilidad. Este protocolo demuestra los pasos críticos que no son normalmente conocidos, pero que son necesarias para asegurar una disección éxito. Por ejemplo, es esencial dejar una pequeña capa de yema de entre el embrión y la hoja de peso de papel para evitar que se pegue. Tanto la identificación y eliminación del embrión puede ser difícil. Para solucionar problemas de identificación del embrión en la superficie de la yema, brillará la luz directamente sobre la yema después de tenerha retirado del huevo, y mirar a la yema en un ángulo de 45 ° para encontrar el embrión. Una vez que el embrión se encuentra, corte la yema de huevo en sopesar el papel con cuidado de no rasgar el embrión. Si otras aplicaciones incluyen imágenes de las diferencias anatómicas, hibridación in situ, o ensayos de proliferación celular, es importante para eliminar la membrana vitelina en la etapa 1 - 8 22 para una mejor visualización de las estructuras. Si experimenta dificultades al retirar la yema o la membrana vitelina en las primeras etapas, fijar el embrión en el 4% PFA antes de lavarlo en 1X PBS para reducir la fragilidad embrionario. Al eliminar primero la membrana vitelina durante la disección como se ha descrito, las estructuras son claramente visibles e intacto en embriones pinzón cebra después de realizar una hibridación in situ. Una limitación de edu es que la administración de volúmenes de dosis más de 478 conductores de la Liga Nacional en mortalidad embrionaria. Sin embargo, el intervalo de dosificación amplio permite varyinniveles g de etiquetado de células proliferativas. La reacción de &quot;clic&quot; que se utiliza en este kit es la de cobre (I) catalizado-alquino-azida-cicloadición (Cu (I) AAC). En esta reacción específica, una molécula que contiene análogos de la timidina-alquino (UDE) se incorpora activamente dividir celdas. El grupo alquino en la UDE sobresale de la estructura helicoidal del ADN, y se detecta por la exposición a una molécula de azida conjugado con una molécula de verde, fluorescente que se une al grupo alquino libre. La fluorescencia verde muestra las células recién proliferantes en el embrión. El bio-ortogonalidad de la azida y los grupos alquino evita la tinción no específica debido a que estas especies reactivas no están naturalmente presentes en los organismos. También, debido a que el ADN no tiene que ser desnaturalizado para que se produzca la reacción, un análisis más detallado dependiente de ADN se puede realizar fácilmente 27. Una limitación inherente de este método es el tamaño pequeño y fragmentosilidad de embriones pinzón cebra. Extracción de la membrana vitelina de embriones etapas 1 - 15 22 puede dar lugar a estructuras embrionarias perjudiciales si no se realiza con precaución. Sin embargo, este protocolo simplifica el método de disección, permitiendo a los investigadores utilizan etapas embrionarias tempranas para examinar anomalías estructurales y la expresión de genes que no se han estudiado previamente en profundidad. Este protocolo se abre el camino para una gran cantidad de ensayos celulares moleculares que permitirán a los investigadores a determinar los orígenes del desarrollo de fenotipos adultos. Por ejemplo, será posible examinar la expresión del gen implicado en el aprendizaje vocal en diversas condiciones ambientales o después de los tratamientos farmacológicos en las primeras etapas de desarrollo 28, 29,30,31. Aunque no se ha demostrado en este trabajo, este método permite potencialmente a otros procedimientos como radiactivo hibridación in situ sobre zebra finch secciones de tejido y electroporación / in ovo la cirugía 32, 33,34. Dado que el diamante mandarín se ha establecido como un organismo modelo importante en un vasto cuerpo de literatura, tales estudios ofrecen oportunidades sin explotar para vincular los mecanismos de desarrollo de la fisiología y el comportamiento de los adultos, en particular, el desarrollo del lenguaje 7, 9.

El objetivo general de esta técnica es la obtención de pinzón cebra (guttata) Taeniopygia embriones desde las primeras etapas de la embriogénesis para su uso en una amplia gama de estudios de desarrollo. Pinzón cebra se han convertido en el modelo predominante songbird organismo y se han utilizado ampliamente en una variedad de campos, incluyendo toxicología 1,2, el comportamiento 3, la memoria y el aprendizaje 4,5,6, neuroanatomía comparativa 7,8, y el desarrollo del lenguaje de 9,10 . Como el único pájaro cantor con un genoma secuenciado, el pinzón cebra permite el estudio genético y molecular del orden Passeriformes, que representa más del 50% de las especies de aves conocidas 11, 12,13. A pesar del uso de adultos y pinzón cebra juvenil en una amplia gama de campos, se han realizado pocos estudios sobre los embriones pinzón cebra, especialmente durante las primeras etapas de desarrollo. Esto se puede atribuir al pequeño tamaño de sus huevos, unand embriones, así como su estado más reciente como 14,15,16 organismo modelo para estudios en los que el pollo (Gallus gallus domesticus) se utilizó anteriormente como un 17.18.19.20.21 sistema modelo predominante. Sin embargo, como estudiantes no vocales, los pollos no son un sistema modelo adecuado para el estudio de las bases genéticas de aprendizaje vocal, el desarrollo del aprendizaje vocal, heredabilidad, el comportamiento y los circuitos de los ganglios basales-cortical involucrada en el aprendizaje motor 10. Es importante tener en cuenta que los embriones pinzón cebra son mucho más delicado y más fácil de dañar a los embriones de pollo durante la disección y procedimientos moleculares. En particular, se requiere un mayor cuidado al realizar los pasos de permeabilización en embriones pinzón cebra. Detergentes fuertes y enzimas que no perjudicaría a un embrión de pollo pueden dañar embriones pinzón cebra. En términos de cuidados generales, es necesario poner huevos pinzón cebra en pequeñas tazas antes de la colocación en una incubadorapara evitar que se rompan al rodar durante la incubación. Pinzón cebra son susceptibles de estudios de comportamiento, fácil y prolíficamente se reproducen durante todo el año en cautiverio, y son aprendices vocales. Estas características permiten el uso de pinzón cebra para abordar la necesidad de un organismo modelo que integre el desarrollo, la genética y los aspectos de comportamiento del lenguaje. Los métodos disecciones se detallan a continuación, junto con una guía de puesta en escena recientemente desarrollado específica para pinzón cebra 22, hacen que el pinzón cebra un modelo de desarrollo estandarizado cada vez más útil organismo. Sin embargo, la obtención de embriones en las primeras etapas puede ser desalentador. Este protocolo permite a los investigadores obtener fácilmente embriones en etapa temprana. Los estudios que investigan el desarrollo temprano y la base del desarrollo molecular de comportamientos complejos en el pinzón cebra, o los efectos toxicológicos sobre el desarrollo en otros pequeños, aves paseriformes encontrarán esta metodología disección útil.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chicken egg incubator</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10337</td>
			<td>Detection of cell proliferation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Olympus SZ61</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7&#39;&#39; Drummond capillary for Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-00-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drummond Nanoject II microinjector</td>
			<td colspan="2">Drummond</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont Tweezers #55</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td align="right">14099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Falcon tube (polypropylene)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-18&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastPrep Lysis Matrix H tubes</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>6917-100</td>
			<td>Used for RNA extraction, used to homogenize embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator)</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries&#160;</td>
			<td colspan="2">Fiber-Lite MI-150&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass vials with screw cap (DEPC treated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge eppe tube (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Modeling Clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Narshige PB-7 needle puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Omni Bead Ruptor Homogenizer</td>
			<td style="width:71px;">OMNI International</td>
			<td>19-010</td>
			<td>Used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="3" height="25" style="height:25px;">4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 mL 8% PFA (32g paraformaldehyde, 350mL sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400mL sdd H2O), 20mL 2xPBS</td>
			<td>Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="4" height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline (1xPBS): 200mL 10X PBS, 1800 mL Barnstead H2O, adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="4" height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline (10xPBS): 800mL Barnstead, 2.013g KCL, 80.063g NaCl, 2.722g KH2PO4 monobasic, 14.196g Na2HPO4 dibasic, 200mL Barnstead H2O, adjust pH to 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="4" height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1xPTw): 1800mL Barnstead H2O, 200mL 10X PBS, adjust pH to 7.4, 2mL Tween-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mL Plastic petri dish&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic wrap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prepease RNA Spin Kit</td>
			<td>PrepEase, Affymetrix</td>
			<td>78766 1 KT</td>
			<td>Used for RNA extraction, used to homogenize embryos</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Reaction Mix: 875&#956;L 1xPBS, 100mM 20&#956;L CuSO4 (Kit Component E), 5&#956;L Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100&#956;L diluted reaction buffer additive (Kit Component F)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10337</td>
			<td>Detection of cell proliferation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">sdd H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seed cup&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use it as a container when incubating eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel scalpel&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard nest box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Abba Plastic Finch Nestboxes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4mL, Teflon Lined Cap, Glass Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-912-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipettes (polyethylene)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4x4 weigh paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and downstream analysis of zebra finch embryos at early stages of development

El pinzón cebra (Taeniopygia guttata) se ha convertido en un organismo modelo cada vez más importante en muchas áreas de investigación que incluyen toxicología 1, 2, 3 el comportamiento, y la memoria y el aprendizaje 4,5,6. Como el único pájaro cantor con un genoma secuenciado, el pinzón cebra tiene un gran potencial para su uso en estudios de desarrollo; Sin embargo, las primeras etapas de desarrollo del pinzón cebra no han sido bien estudiados. La falta de investigación en el desarrollo pinzón cebra se puede atribuir a la dificultad de la disección de la pequeña huevo y embrión. El siguiente método de disección minimiza el daño del tejido embrionario, que posibilite la investigación de la morfología y la expresión génica en todas las etapas del desarrollo embrionario. Esto permite tanto de campo brillante y de formación de imágenes de fluorescencia calidad de los embriones, su uso en procedimientos moleculares, tales como la hibridación in situ (ISH), ensayos de proliferación celular, y la extracción de RNA para ensayos cuantitativos tales como REA cuantitatival-PCR en tiempo (qtRT-PCR). Esta técnica permite a los investigadores estudiar las primeras etapas de desarrollo que antes eran de difícil acceso.

Los pasos esquematiza en la Figura 1 indican la aparición del embrión mientras que está unido a la membrana vitelina (A) y demostrar el método adecuado para separar el embrión a partir de la yema de huevo (B). El embrión puede ser identificado por la zona de unión, que es mucho más ligero que la membrana vitelina. El embrión en sí es a menudo difícil de distinguir hasta que la yema se corta distancia. Una vez que el embrión se diseca del huevo, que puede ser fijo o de destello congelado para uso futuro. Si una hibridación in situ se ha previsto para el embrión diseccionado, es necesario para eliminar la membrana vitelina que se adhiere al embrión a través de la zona de unión. Figura 2 ilustra la mejora de la visibilidad del embrión una vez que se retira esta membrana (C), y la forma correcta de pelar la membrana vitelina (A, B). Después de la disección y fijación, montar toda la hibridación in situ se realizó como se ve en la Figura 3 (A, A &#39;, B, B&#39;) Y la Figura 4 (A, A&#39;, B, B &#39;) y la Figura 5 (A, B, C) ​​para detectar diferencias en orthodenticle homeobox 2 (Otx2 expresión) en embriones de desarrollo expuestas a dosis bajas de metilmercurio. Figura 5 muestra resultados de la sonda sentido, lo que demuestra la falta de fondo. En la Figura 4, a pesar de ser diseccionado desde el huevo al mismo punto en el tiempo, el embrión del desarrollo expuesto al metilmercurio (MeHg) alcanzó el estadio 5 22 (B, B &#39;), mientras que el embrión de control desarrollado para escenificar 6 22 (A, A &#39;). El grupo de embriones disecados y se muestra en la Figura 4 se obtuvieron de la jerarquía y tomada de la incubadora a las mismas horas. Aunque algunos variación natural está presente en el desarrollo, sobre la base de datos de disección anteriores, es poco probable que las fluctuaciones de temperatura en la incubadora causarían sólo los 2,4 ppm de metilmercurio embriones sean desarropmentally retrasado. Las diferencias en las etapas indican cambios en la proliferación celular en embriones de desarrollo expuestos a metilmercurio. Antes de la disección, EdU se inyecta en un huevo día 2 y se dejó incubar durante la noche. Después de la disección y la fijación de la etapa 16 22 embrión, EdU se visualizó usando &quot;clic&quot; química, permitiendo la detección de células que proliferan como se ve en la Figura 6 (A, B, C). Es importante controlar cuidadosamente los puntos de tiempo al colocar los huevos en la incubadora y durante disecciones, como la exposición a metilmercurio o realizar el ensayo EdU puede interrumpir la progresión del desarrollo. La inyección se realizó temprano en el día 0, que era el día de la recolección como se especifica en el paso 1.3. Este embrión se disecó aproximadamente 38 horas después (etapa 7 22). Se encontró que la tasa de supervivencia es de aproximadamente 90% (misma velocidad que los embriones de control), siempre y cuando la cantidad de inyección estaba bajo 478 nl. 22 embriones, una extracción de ARN se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante sin optimización requerida, como se ve en la Figura 7. La eliminación de la membrana vitelina era innecesario para la extracción de ARN y posteriores aplicaciones de QRT-PCR. Nota: Todas las cifras de embriones están orientados de manera que las regiones anterior y posterior se encuentran en la parte superior e inferior de las imágenes, respectivamente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig1highres.jpg" /> Figura 1. Procedimiento para la localización y la disección de embriones pinzón cebra, etapas 1-10 22. Localizar embrión rodando suavemente la yema hasta que el disco blanco débil es evidente (A). Una vez que elembrión se encuentra en el centro de la yema de huevo, la yema de huevo se diseca en una forma escalonada (B) en el que el primer corte alivia la presión de la membrana vitelina (1) y los cortes posteriores (2) bordear la zona de unión (zj) que es adherido a la membrana vitelina. Las barras de escala representan 1 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig2highres.jpg" /> Figura 2. La eliminación de la membrana vitelina y la visibilidad de las estructuras embrionarias. Después de la eliminación del embrión a partir de la yema de huevo, embrión lugar en una placa de Petri que contiene 4% de PFA. Si una hibridación in situ necesita ser realizada, la visibilidad de las estructuras embrionarias es esencial y se puede lograr mediante la eliminación de la membrana vitelina (A). Agarre la membrana vitelina con extra fino con punta de unas pinzas y retírela con cuidado lejos del embrión mediante la manipulación del embrión directamente en el borde más externo, si es necesario(B). Extracción de la membrana vitelina aumenta la claridad de las estructuras embrionarias, y permite que los embriones para obtener imágenes o procesados ​​con la hibridación in situ (C). Las barras de escala representan 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig3highres.jpg" /> Figura 3. Todo el montaje hibridación in situ realizado en embriones pinzón cebra desarrollo expuestos al metilmercurio. Los patrones de expresión de orthodenticle homeobox 2 (Otx2) se caracterizaron en los embriones expuestos a 0.0 ppm de metilmercurio (A, A &#39;) y 2,4 ppm de metilmercurio (B, B &#39;) a través de la dieta de los padres. El hacerRsaI (A) y ventral (A &#39;) expresión de Otx2 es visible a través de las vesículas del cerebro medio y óptica durante la etapa 12 22. Los embriones del grupo de tratamiento fueron disecados en el mismo punto de tiempo, pero se retraso en el desarrollo como se ve en la parte dorsal (B) y vista ventral (B &#39;) de las estructuras de la cabeza, que son característicos de la etapa 11 22 Abreviaturas:. mb, cerebro medio; op, vesícula óptica. Las barras de escala representan 1 mm. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig4highres.jpg" /> Figura 4. Todo el montaje &#160; in situ &#160; hibridación a cabo en embriones pinzón cebra desarrollo expuestos al metilmercurio. Los patrones de expresión de orthodenticle homeobox 2 (Otx2) fueron caracterizados en la etapa 6 22 embry<html> os expuestos a 0.0 ppm de metilmercurio (A, A &#39;) y la etapa 5 22 embriones expuestos a 2.4 ppm de metilmercurio (B, B&#39;) a través de la dieta de los padres. Abreviaturas: am, margen anterior del mesodermo; No, notocorda, mesodermo notocorda; po, proamnion, blastoporo anterior; ps, línea primitiva 22. Las barras de escala representan 1 mm. <img alt="La figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig5highres.jpg" width="600" /> Figura 5. Todo el montaje in situ &#160; hibridación a cabo en embriones pinzón cebra con la sonda sentido. (A) Etapa 5 22 embriones. (B) Etapa temprana 6 22 embriones. (C) Etapa 11 22 embriones. Las barras de escala representan 1 mm. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg &quot;/&gt; Figura 6. Incorporación Edu y de protección en los embriones pinzón cebra. EdU &quot;clic&quot; química se utilizó para detectar células que proliferan en una etapa embrionaria 16 22 (A, B, C). EdU se incorpora en el ADN en el lugar de timidina 26, 27 y se detecta usando química, haga clic 27. Proliferación es claramente visible en los bordes laterales de los somitas, y la tailbud. El panel A muestra la proliferación ocurre exclusivamente en la parte posterior del embrión y también muestra las células proliferativas individuales. El panel B muestra los lugares de proliferación en todo el embrión. El panel C muestra la región anterior, y muestra el telencéfalo altamente proliferativa (TE) con mayor detalle. Abreviaturas: af, pliegue amniótico; FLB, esbozo de ala; hlb, miembro posterior brote; le, vesícula del cristalino; ms, mesencéfalo; mt, Metencephalon; opc, copa óptica; pa, arco faríngeo; sm, mesodermo somito; tb, tailbud; te, telencéfalo. Las barras de escala representan 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="La figura 7" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig7highres.jpg" /> Figura 7. Calidad del ARN extraído de embriones disecados pinzón cebra. Control (0,0 ppm) y 1,2 ppm de metilmercurio embriones fueron disecados y flash congelado como se describe en el paso 3.8. Cada carril muestra el ARN extraído a partir de dos embriones homogeneizados de cada grupo de tratamiento.

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Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.

La disección y análisis de aguas abajo de Zebra Finch embriones en etapas tempranas del desarrollo

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.8K vistas.  College of William and Mary. The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications. 

Video: Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

La disección de embriones de ratón 6,5 dpc

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Investigación

Biología

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de Drosophila Midgastrula Etapa

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

La colocación de crecimiento recubierto Factor-bolas en los embriones tempranos de la etapa de pollo

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Aislamiento eficaz y rápida de los embriones en etapa temprana de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semillas

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Un protocolo para la de Lentiviral Transducción y Análisis de Aguas abajo de Intestinal organoides

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis como modelo para identificar Traducción Deterioro

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune system &#8212; such as neutrophils, dendritic cells, and macrophages &#8212; retain the innate ability to detect and clear such invading pathogens through phagocytosis1. Phagocytosis involves choreographed events of membrane reorganization and actin remodeling at the cell surface2,3. Phagocytes successfully internalize and eradicate foreign molecules only when all stages of phagocytosis are fulfilled. These steps include recognition and binding of the pathogen by pattern recognition receptors (PRRs) residing at the cell surface, formation of phagocytic cup through actin-enriched membranous protrusions (pseudopods) to surround the particulate, and scission of the phagosome followed by phagolysosome maturation that results in the killing of the pathogen3,4.
Imaging and quantification of various stages of phagocytosis is instrumental for elucidating the molecular mechanisms of this cellular process. The present manuscript reports methods to study the different phases of phagocytosis. We describe a microscope-based approach to visualize and quantify the binding, phagocytic cup formation, and the internalization of particulate by phagocytes. As phagocytosis occurs when innate receptors on phagocytic cells encounter ligands on a target particle bigger than 0.5 &#181;m, the assays we present here comprise the use of pathogenic fungi Candida albicans and other particulates such as zymosan and IgG-coated beads.

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

La visualización de las primeras etapas de la fagocitosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...