En vídeo, presentamos un protocolo para la fracturación por congelación de vesículas extracelulares procedentes de células de cáncer de vejiga in vitro. Las vesículas extracelulares son vesículas limitadas por membrana que derivadas de las células se liberan en el espacio extracelular y tienen un papel en la comunicación intercelular. Dentro de las vesículas extracelulares, discriminamos tres poblaciones, exosomas, microvesículas y cuerpos apoptóticos, que difieren por su origen, tamaño y composición molecular.
La composición molecular de las vesículas extracelulares refleja el perfil molecular de la célula donante e interfiere con los procesos biológicos en la célula receptora. Sin embargo, la composición de la membrana limitante de las vesículas celulares es crucial para la interacción con la membrana celular receptora. Para analizar la organización de la membrana limitante, las vesículas extracelulares deben aislarse primero y luego abordarse a la técnica de congelación-fractura.
La congelación-fractura es una técnica microscópica electrónica dedicada a estudiar la organización bidimensional de las membranas biológicas, incluidas las vesículas. Los pasos de la congelación-fractura son la congelación rápida de la muestra, la fractura de la muestra, la fabricación de la réplica de la superficie congelada-fracturada y la limpieza de la réplica para eliminar los materiales biológicos. Las réplicas se visualizan finalmente con microscopio electrónico de transmisión.
Nuestro objetivo fue utilizar la técnica de congelación-fractura para caracterizar las microvesículas en términos de forma, tamaño y composición de la membrana. Comience con el crecimiento de células en la incubadora de células. Inspeccione las células bajo el microscopio para confirmar su variabilidad y confluencia.
Recoger los medios de cultivo con microvesículas en tubos y centrifugar a 300 g-fuerzas durante 10 minutos. Recoger sobrenadante. Posteriormente, sobrenadante de centrífuga a 2000 fuerzas g y 10,000 fuerzas g.
Después de eso, observe la punta del tubo en busca de un gránulo blanquecino que indique microvesículas. Retire con cuidado el sobrenadante. Agregue 1.5 mililitros de PBS y vuelva a suspender el pellet que contiene microvesículas.
Luego centrifugar a 10, 000 g-fuerzas. Observe el pellet blanquecino. Retire el sobrenadante y agregue suavemente el fijador.
Dejar actuar durante 20 minutos a 4 grados centígrados. A continuación, retire el fijador y agregue el tampón de lavado para enjuagar el pellet sin volver a suspenderlo. Dejar actuar durante 10 minutos a 4 grados centígrados.
Retire el tampón de lavado y agregue 30% de glicerol al pellet. Vuelva a suspender el pellet en suspensión homogénea e incube durante 30 minutos a 4 grados centígrados. Prepare portadores de cobre limpios con un hoyo central y desarrolle un matraz con el ceño fruncido y nitrógeno líquido.
Bajo el microscopio, transfiera la muestra al pozo central del portador de cobre. Mezcle el freón solidificado para licuar. Agarra el anillo exterior del portador con pinzas y sumérgelo en freón enfriado.
Después de ocho segundos, transfiera rápidamente el portador al matraz de desarrollo con nitrógeno líquido. Marca crio vil y enfríalo. Bajo nitrógeno líquido, recoja los portadores en el vil, ciérrelo y guárdelo en el recipiente de nitrógeno líquido hasta que se congele.
Prepare la unidad de fracción de congelación de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento del fabricante. Encienda el sistema de vacío y enfríe la cámara de la unidad a menos 150 grados centígrados. Transfiera los portadores de cobre con muestra congelada a la unidad de fraccionamiento por congelación.
Ajuste la temperatura del cuchillo a menos 100 grados centígrados y espere el vacío. Comience a seccionar la muestra activando el movimiento motorizado de la cuchilla hasta que la superficie de la muestra esté lisa. Para la fracturación, apague el movimiento motorizado del cuchillo y proceda con el control manual lento del cuchillo.
Continúe con el sombreado de platino en el ángulo de 45 grados. Encienda la alta tensión y aumente la corriente a la pistola de platino. Las chispas de platino deben comenzar a sombrear la muestra.
Supervise la posición del platino en el monitor de espesor de cristal de cuarzo. El espesor recomendado del platino es de 2,5 nanómetros. Apague la corriente y la alta tensión.
Proceda con la sombra de carbono en un ángulo de 90 grados. Encienda la alta tensión y aumente la corriente a la pistola de carbono. Las chispas de carbono deben comenzar a sombrear la muestra.
Cuando se obtengan 2,5 nanómetros de carbono, apague la corriente y la alta tensión. Transfiera esas muestras con las réplicas de la unidad de congelación-fractura a una placa de 12 válvulas llena de agua de doble destilación. Las réplicas flotarán en la superficie del agua mientras los portadores se hunden.
Transfiera réplicas con bucle de alambre a una placa de 12 válvulas llena de hipoclorito de sodio e incube durante la noche. Lave las réplicas en agua de doble destilación. Recógelos en una rejilla TM de cobre de malla y déjalos secar al aire durante dos horas.
Utilice un microscopio electrónico de transmisión para obtener imágenes de réplicas y obtener micrografías. Para una interpretación precisa de réplicas y micrografías, siga las pautas para la orientación adecuada en la nomenclatura. Los análisis de réplicas mostraron que el medio aislado-acondicionado contenía fracción enriquecida de vesículas.
Las vesículas aisladas se reunieron en grupos de tres o más o muy individualmente distribuidas. Las vesículas tenían forma esférica. El diámetro de las vesículas correspondía al diámetro de las microvesículas.
La fracturación por congelación también reveló la organización bidimensional de la membrana de microvesículas. La fase exoplásmica de las microvesículas tuvo un aspecto suave y uniforme, mientras que en la fase de protoplastos observamos partículas entre membranas. Las partículas entre membranas aparecieron esporádicamente, lo que implica que las microvesículas aisladas de las células del material cancerígeno contienen solo una baja cantidad de proteínas de membrana o ensamblajes de proteínas.
En resumen, la técnica de congelación-fractura utilizada en el protocolo presentado demuestra ser una técnica óptima para la caracterización de vesículas extracelulares y puede utilizarse para la evaluación de otras poblaciones de vesículas extracelulares. Una ventaja crucial de la técnica de congelación-fractura es su poder para resolver la organización interna de la membrana limitante de vesículas, que determina la función biológica de las vesículas extracelulares.
