Al medir las propiedades electrofisiológicas de las membranas celulares, la cuestión de lo principal demuestra que se puede resolver la modulación de la actividad eléctrica de una célula. El registro de pinza de parche de células enteras es una técnica periférica para estudiar las corrientes iónicas en células individuales e interrogar la respuesta celular a diferentes estímulos. El mejor rendimiento en las pregrabaciones de pinzas de parche de células enteras se logrará después de practicar y estudiar mucho.
Para comenzar la disección cerebral, haga una incisión con tijeras quirúrgicas en la piel en la parte superior del cráneo del animal decapitado desde el caudle hasta el rostral y retire el cuero cabelludo. A continuación, corte la placa interparietal a lo largo de la sutura sagital con las tijeras del iris y retire el hueso occipital. Deslice el osteotomo debajo del hueso parietal y sáquelo suavemente hasta que el cerebro esté expuesto.
Después de exponer el cerebro, voltee la cabeza boca abajo. Baje suavemente el cerebro para visualizar el nervio trigémino en cada lado. Luego corte el nervio trigémino usando tijeras curvas Castroviejo.
Después de visualizar el hipotálamo identificar el nervio óptico y cortarlo suavemente. A continuación, corte la porción anterior lejana del lóbulo frontal. Retire el cerebro e inmediatamente sumérjalo en la solución de corte hasta adquirir las rodajas.
Para cortar las muestras de cerebro, coloque el cerebro en un papel de filtro para secar el exceso de solución. Luego, con una hoja de afeitar de corte afilado, realice un corte coronal que separa el tronco encefálico con el cerebelo del resto del tejido. A continuación, pegue la porción del caudle del cerebro a la base de un vibratomo y llene la cámara del dispositivo de corte con la solución de corte o la solución de aCSF enfriada de cero a dos grados centígrados.
Empaque hielo seco alrededor de la cámara de vibratomo para mantener fría la solución de corte durante el procedimiento. Inserte la cuchilla de afeitar en el vibratomo y establezca los parámetros de corte del dispositivo, como la velocidad a tres, la frecuencia a nueve y la alimentación a 250 micrómetros. Durante el procedimiento de corte de tejido, transfiera las rodajas con una pipeta de transferencia de acrílico a la cámara de recuperación y espere 60 minutos para la recuperación del tejido después de la adquisición de la rebanada.
Antes de comenzar el sellado y la grabación celular, encienda el microscopio, el amplificador, el digitalizador y el micromanipulador. Construya la cámara de grabación conectada al microscopio con la solución aCSF. Use una bomba de perfusión para perfundir constantemente el aCSF a dos mililitros por minuto.
Compruebe la configuración del software y cree protocolos específicos para las grabaciones según el tipo de experimento. Transfiera una rebanada de cerebro de interés de una en una a la cámara de grabación utilizando una pipeta de transferencia de acrílico. Sujete la rebanada con un anclaje de rebanada para que no se mueva durante la perfusión del LCR.
Coloque la rebanada en el centro de la cámara de grabación utilizando la lente de objetivo de baja potencia del microscopio de inmersión, 10X o 20X. La posición del corte es crítica para permitir una buena visión de la región deseada bajo el microscopio y para un alcance perfecto para la micropipeta de grabación. Después de localizar la región de interés, cambie la lente del objetivo a la lente de alta potencia, 63X y concéntrese en el nivel del tejido observando la proteína fluorescente endógena y las formas de las células en la región objetivo para localizar las células kisspeptina en la superficie del corte cerebral.
Cuando se encuentre una posible celda objetivo, márquela en la pantalla de la computadora con el cursor del mouse o dibujando un formato como un cuadrado sobre el área de interés. La marca de pantalla del ordenador ayuda a guiar la posición de la pipeta de grabación hasta la celda. Después de determinar la ubicación exacta de la célula objetivo, levante el objetivo e introduzca la micropipeta de registro llena con la solución interna en el soporte del electrodo, asegurándose de que la solución interna esté en contacto con el electrodo de plata.
Aplique una presión positiva antes de sumergir la micropipeta en la solución de aCSF utilizando una jeringa llena de aire de uno a tres mililitros conectada al soporte de micropipeta a través de un tubo de polietileno para evitar que entren residuos en la micropipeta. Usando el micromanipulador guía la micropipeta por debajo del centro del objetivo. Mueva los botones del micromanipulador para guiar el eje XYZ de la micropipeta hacia la celda de interés.
Ajusta el enfoque para ver la punta de la micropipeta y acercar el enfoque, pero no demasiado cerca de la rebanada. Reduzca la velocidad del micromanipulador y baje lentamente la micropipeta hasta el plano de foco, asegurándose de que la punta de la micropipeta no penetre bruscamente en el corte, sino que descienda lentamente hasta que toque la superficie de la célula o la región objetivo. Aplicar una ligera presión positiva con una jeringa llena de aire de uno a tres mililitros para eliminar cualquier residuo de la trayectoria de aproximación.
Mueva lentamente el micromanipulador en el eje XYZ para acercar la punta de la micropipeta y toque la célula objetivo, lo que provoca un hoyuelo por la presión aplicada. Después de establecer el hoyuelo con la ayuda del modo de abrazadera de voltaje en el software, aplique una breve succión débil por la boca durante uno o dos segundos a través del tubo conectado al soporte de micropipeta para generar el sello entre la micropipeta y la celda. Si el sello permanece mecánicamente estable sin interferencia de ruido durante aproximadamente un minuto, ajuste el voltaje de retención en el potencial de reposo fisiológico más cercano de la celda de interés.
Para las neuronas hipotalámicas kisspeptina se recomienda menos 50 milivoltios. A continuación, aplique una breve succión por vía oral para romper la membrana plasmática en la punta de micropipeta sellada colocada a la célula para que la membrana rota no obstruya la micropipeta o atraiga una porción considerable de la membrana o la célula. Se puede lograr una configuración adecuada de toda la celda realizando succión con suficiente fuerza.
Consulte el manual de configuración del sistema utilizado. Después de romper la membrana celular, habilite la opción de celda completa en el modo de abrazadera de voltaje y haga clic en el comando automático que se refiere a la pestaña de toda la celda. La resistencia en serie de la celda y la capacitancia de toda la celda se calculan automáticamente y el software muestra instantáneamente.
A continuación, verifique los parámetros de viabilidad celular en el software como se describe en el manuscrito de texto. Monitoree la resistencia en serie y la capacitancia del estado estacionario de la celda durante los experimentos. Una vez que toda la configuración de la celda se logra correctamente, mida las corrientes sinápticas en el modo de abrazadera de voltaje.
Registre los cambios en el potencial de membrana en reposo y las variaciones inducidas del potencial de membrana en reposo en el modo de abrazadera actual. Los posibles efectos de la hormona de crecimiento recombinante humana sobre la actividad de las neuronas kisspeptina hipotalámicas se estudiaron con la ayuda de registros de pinza de parche de células enteras. La administración de hormona de crecimiento recombinante humana, HGH a 20 microgramos por gramo indujo una hiperpolarización significativa del potencial de membrana en reposo en 5 de 12 neuronas de kisspeptina AVPV / PeN y 9 de 14 neuronas de kisspeptina ARH registradas.
Las neuronas hiperpolarizadas AVPV/PeN kisspeptina y ARH kisspeptina cambiaron significativamente el potencial de membrana en reposo en comparación con las células que no responden. Los efectos sobre el potencial de membrana en reposo durante la aplicación de HGH siguieron a una reducción significativa de la resistencia de entrada de células enteras de aproximadamente 0.9 a 0.7 gigaohmios en neuronas de kisspeptina AVPV / PeN y 1.7 a 1.0 gigaohmios en neuronas de kisspeptina ARH. Durante las líneas cerebrales perfectas realizadas a través de gigaseal cuidadoso y el área en la célula a través de parámetros de playa son necesarios para lograr las mejores grabaciones de células completas.
La solución de micropipeta de la célula registrada se puede recolectar y utilizar para RTPCR de una sola célula permitiendo la caracterización molecular de una célula aislada. La técnica de pinza de parche de células enteras combinada con el uso de animales modificados genéticamente representa un gran avance en la comprensión de la reproducción que permite la definición de las propiedades aumentadas de las neuronas kisspeptina, y son los principales moduladores.
