Este estudio fue apoyado por una subvención CIHR TEAM # 82946 CTP, un CIHR subvención # 102741 MOP, así como una silla de Canadá # 216684 y una Fundación Strauss. ER fue apoyado por una beca de la Fundación del Corazón de Canadá y Stroke.

Oclusión transitoria de la arteria cerebral media (MCAO) 1. Cirugía de Procedimiento (Figura 1) Oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAO) se realiza en 2 - a 3-meses de edad de sexo masculino C57BL / 6 ratones (22-28g). Este protocolo fue aprobado por el cuidado de los animales bioética IRCM comité. Los instrumentos quirúrgicos se esterilizaron mediante tratamiento en autoclave (121 ° C a 15 psi durante 60 min). Entre cada animal, que fueron esterilizadas mediante el calor esterilizador de cuentas (15 segundos). Mesa de cirugía y otros equipos se desinfectan con 70% de etanol. Dos horas antes de la cirugía, los ratones se analgesized con buprenorfina (0,03 mg / kg bwip). Figura 1A. <ol><li> Profundamente anestesiar a los ratones con isoflurano 5% y luego mantener la anestesia con isoflurano al 2,5%. La temperatura corporal de los ratones se mantiene constante durante la cirugía con una almohadilla térmica. </li><li> Desinfecte la piel y skcon 70% de etanol o Betadine. Desde el afeitado produce liberación de pelo fragmento, microabrasiones y la inflamación que puede repercutir en la fisiopatología de golpe, no afeitarse la piel del ratón. </li><li> Hacer una incisión en la línea media del cuello y suavemente separar los tejidos blandos. </li><li> Bajo un microscopio estéreo (Stemi 2000, Zeiss), una disección roma se realiza para exponer la tráquea y retraer los músculos para localizar la arteria carótida. </li><li> La arteria carótida común izquierda (CCA) se diseca cuidadosamente del tejido circundante y la CCA está temporalmente ocluido por una sutura temporal (1) con sutura de seda 5-0 corte en segmentos de 20 mm. Gran cuidado debe ejercerse para no dañar el nervio vago. </li><li> Separe la bifurcación de la izquierda interna arteria carótida común (ICA) y la arteria carótida externa común (ECA). Una sutura permanente (2) se coloca alrededor de la ECA, como distalmente como sea posible, y otra sutura temporal ligeramente apretado (3) se coloca en la ECA distal a labifurcación. </li><li> Clip de la ACI izquierda (4) utilizando unas pinzas de acción inversa para evitar el sangrado. Gran cuidado debe ejercerse para no dañar el nervio vago. </li><li> Corte un pequeño agujero en la CEPA (5) entre permanentes (2) y temporal (3) puntos de sutura. </li></ol> La figura 1B. <ol start="9"><li> Introducir un 12 mm de largo 6-0 revestido con silicio (alrededor de 9-10mm es recubierto de silicona) sutura de monofilamento (Doccol Corporation) en la ECA (6), cortar completamente el ECA distal a la sutura permanente e invertir el oclusor en la ICA . La sutura está fuertemente atada alrededor del monofilamento para evitar el sangrado y las pinzas de acción inversa se eliminan. </li><li> El oclusor se introdujo para ocluir el origen de la MCA en el círculo de Willis. Deje su inserción en torno a 9-10 mm más allá de la bifurcación de la CEPA y la CCA. El oclusor está bloqueado y no se puede mover más. Se debe tener cuidado de no penetrar en la arteria esfenopalatino. La sutura (3) en el ECA es tightly atado para fijar el monofilamento en posición. </li><li> Cierre de la piel con un sistema de cierre autoclip herida. </li><li> Inyectar 1 ml de solución salina por vía subcutánea y colocar los ratones bajo una lámpara de calentamiento por infrarrojos durante todo el período de post-oclusión (60 min). </li></ol> 2. Restauración del Medio flujo cerebral sanguíneo de la arteria Antes de reanesthesia, la neuroscore se pueden comprobar para evaluar el éxito de la cirugía. <ol><li> Anestesiar a los ratones descritas anteriormente, y eliminar las autograpas. </li><li> Abra ligeramente la sutura (3) en la ECA para permitir la retirada de monofilamento y reperfusión sanguínea. </li><li> Permanentemente atar la sutura temporal de la ECA para evitar la pérdida de sangre. El monofilamento se mantiene para su reutilización. </li><li> Retirar la sutura temporal (1) en el CCA para permitir la recirculación de sangre. </li><li> Cerrar la herida. Los ratones deben recibir otra solución de 1 ml de solución salina por vía subcutánea. </li><li> Coloque los ratones bajo la lámpara de calor infrarrojo para 1 hr. Después de comprobar que el animal recupera la movilidad, el ratón se devolvió a su jaula y se dejó bajo la almohadilla de calefacción y toallas para 72 hr. Tenga en cuenta que sólo la mitad de la jaula se coloca sobre la almohadilla de calentamiento para permitir que los ratones a elegir su medio ambiente. Debido post-quirúrgico de pérdida de peso se observa en general, alimentos en puré se coloca en una placa de Petri para promover la alimentación. Doce horas después de la cirugía, los ratones recibieron otra dosis de buprenorfina (0,03 mg / kg bwip). </li></ol> 3. Sham operación Para operaciones simuladas, todos los procedimientos son idénticos excepto que el oclusor no está insertada. 4. Neuroscore Déficits neurológicos permitir la evaluación del éxito de tMCAO justo después de la reperfusión y después de la estimación del grado de gravedad de la lesión. Déficits neurológicos se obtuvo como se ha descrito previamente 5 &lt;/ Sup&gt; y realizaron a 1, 24, 48 y 72 horas después de la reperfusión. Una amplia escala de seis puntos se utiliza: <ul><li> 0: normal. </li><li> 1: leve rodeando comportamiento con o sin rotación inconsistente al cogerlo por la cola, &lt;50% de los intentos para girar hacia el lado contralateral. </li><li> 2: leve consistente en círculos,&gt; 50% de los intentos para girar hacia el lado contralateral. </li><li> 3: consistente fuerte e inmediato en circuito, el ratón tiene una posición de rotación de más de 1-2 segundos, con la nariz casi llegando a la cola. </li><li> 4: Rotación grave progresando en encubado, pérdida del reflejo de enderezamiento o caminar. </li><li> 5: comatoso o moribundos. </li></ul> 5. Tinción con violeta de cresilo (Figura 2) Tras la perfusión de solución de PBS, los cerebros se congelaron rápidamente en isopentano y se almacenaron a -80 °C. cerebros de ratón puede ser también perfundidos con paraformaldehído al 4% (PFA) en función de los estudios de inmunohistoquímica planificadas. Criostato de separación de las secciones del cerebro coronal (17 micras) se realizan. Una sección de cada 30 se recogen en la misma diapositiva de sufrir una lesión cerebral representante. Para la cuantificación del volumen, 2 portaobjetos se tiñen mediante tinción con violeta de cresilo y un sistema de análisis de imágenes (Scion Corporation, Frederick, MD) se usó para evaluar la lesión. El volumen de lesión se calculó en unidades arbitrarias (pixeles), y se expresó como un porcentaje de la contralateral no lesionado área de cada sección. Otras diapositivas se guardan a -80 ° C para estudios de inmunohistoquímica. Alternativamente, PFA-fijo cerebro puede ser cortado a 30-50 micras utilizando vibratome y el volumen del infarto medido según lo recomendado por Han et al. (2009) 6.

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	<li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema,+I:+a+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area.">Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jpn. J. Stroke. 8, 1-8 (1986).</li><li>Chan, P. H., Kamii, H., Yang, G., Gafni, J., Epstein, C. J., Carlson, E., Reola, L. B. r. a. i. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=infarction+is+not+reduced+in+SOD-1+transgenic+mice+after+a+permanent+focal+cerebral+ischemia.">infarction is not reduced in SOD-1 transgenic mice after a permanent focal cerebral ischemia.</a> Neuroreport. 5, 293-296 (1993).</li><li>Yang, G., Chan, P. H., Chen, J., Carlson, E., Chen, S. F., Weinstein, P., Epstein, C. J., Kamii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+copper-zinc+superoxide+dismutase+transgenic+mice+are+highly+resistant+to+reperfusion+injury+after+focal+cerebral+ischemia.">Human copper-zinc superoxide dismutase transgenic mice are highly resistant to reperfusion injury after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 25, 165-170 (1994).</li><li>Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+stroke+model+guidelines+for+preclinical+stroke+trials+(1st+edition.">Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition.</a> J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).</li><li>Jiang, S. X., Lertvorachon, J., Hou, S. T., Konishi, Y., Webster, J., Mealing, G., Brunette, E., Tauskela, J., Preston, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlortetracycline+and+demeclocycline+inhibit+calpains+and+protect+mouse+neurons+against+glutamate+toxicity+and+cerebral+ischemia.">Chlortetracycline and demeclocycline inhibit calpains and protect mouse neurons against glutamate toxicity and cerebral ischemia.</a> J. Biol. Chem. 280, 33811-33888 (2005).</li><li>Han, R. Q., Ouyang, Y. B., Xu, L., Agrawal, R., Patterson, A. J., Giffard, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postischemic+brain+injury+is+attenuated+in+mice+lacking+the+beta2-adrenergic+receptor.">Postischemic brain injury is attenuated in mice lacking the beta2-adrenergic receptor.</a> Anesth. Analg. 108, 280-287 (2009).</li><li>Rousselet, E., Marcinkiewicz, J., Kriz, J., Zhou, A., Hatten, M. E., Prat, A., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCSK9+reduces+the+protein+levels+of+the+LDL+receptor+in+mouse+brain+during+development+and+after+ischemic+stroke.">PCSK9 reduces the protein levels of the LDL receptor in mouse brain during development and after ischemic stroke.</a> J. Lipid Res. 52, 1383-1391 (2011).</li><li>Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat:+1.+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion.">Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1986).</li><li>Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+pterygopalatine+arterial+blood+flow+decreases+infarct+volume+variability+in+a+mouse+model+of+intraluminal+suture+middle+cerebral+artery+occlusion.">Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion.</a> J. Neurosci. Methods. 174, 18-24 (2008).</li><li>Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+suture+size+and+carotid+clip+application+upon+blood+flow+and+infarct+volume+after+permanent+and+temporary+middle+cerebral+artery+occlusion+in+mice.">Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice.</a> Brain Res. 970, 131-192 (2003).</li><li>Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infarct+volume+quantification+in+mouse+focal+cerebral+ischemia:+a+comparison+of+triphenyltetrazolium+chloride+and+cresyl+violet+staining+techniques.">Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques.</a> J. Neurosci. Methods. 139, 203-207 (2004).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar. La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por Zeiss, Inc.

Diferentes modelos de accidente cerebrovascular se han desarrollado para imitar las consecuencias de accidente cerebrovascular en pacientes. La elección del modelo de accidente cerebrovascular depende de la cuestión biológica. El intraluminal modelo MCAO imita uno de los tipos más comunes de un accidente cerebrovascular isquémico en pacientes y es menos invasiva y más consistente que el modelo Tamura 4,7. Es un modelo muy interesante para el análisis de la muerte neuroprotección, Neurorreparación y celular. El éxito del modelo intraluminal depende de muchos factores tales como el sexo del animal, edad y peso, la temperatura, la anestesia y el momento de la cirugía, que tienen que ser controlados. Las propiedades físicas del oclusor (diámetro de la punta, longitud, forma y fexibility) son críticos para la consistencia de la MCAO 4. Aquí, se utiliza el 12 mm de largo 6-0 monofilamento recubierto con silicona en 9-10 mm de Corporación Doccol. La gran ventaja de este monofilamento es reducir las hemorragias subaracnoideas y porque su longitud cubierto toda la ICALa longitud, el flujo de sangre residual, que proviene de las arterias comunicantes anterior y posterior del Círculo de Willis y PPA, y se evita la variabilidad en 8 disminuye el volumen de infarto (15% de la variabilidad en las manos). La sutura de CCA también disminuye la variabilidad del volumen de infarto 9. La extensión de la lesión cerebral después de tMCAO puede evaluarse mediante diferentes maneras. Déficits neurológicos se puede medir como se ha mencionado anteriormente. Sin embargo, es difícil tener una medida eficiente de esta manera. La extensión del infarto se realiza comúnmente mediante tinción con TTC. Más recientemente, las técnicas de resonancia magnética se utilizan también, una tecnología particularmente interesante para los tratamientos neuroprotectores. Para comprender los mecanismos celulares implicados en el accidente cerebrovascular tal como muerte celular Neurorreparación, o la proliferación celular, el estudio de diferentes marcadores por inmunohistoquímica es crítico y muy informativo. Por lo tanto, nuestro protocol de preparaciones sección del cerebro tiene la gran ventaja de permitir que estos análisis, y minimiza el número de ratones utilizados. Además, Tureyen et al. 10 han informado de que hay una buena correlación entre la tinción con violeta de cresilo y TTC.

<table border="1"&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Descripción</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de catálogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microscopio estéreo</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt; Stemi 2000</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fibra-Light Iluminador de alta intensidad</td&gt;<td&gt; Dolan-Jenner Industries Inc.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sistema de Anestesia para isoflurano</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Isoflurano</td&gt;<td&gt; CDMV</td&gt;<td&gt; 108737</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Calefacción manta</td&gt;<td&gt; Gaymar Medsearch</td&gt;<td&gt; TP22G</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lámpara de calefacción infrarroja</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ultra fino pinzas, estilo 5</td&gt;<td&gt; Ciencias de Microscopía Electrónica</td&gt;<td&gt; 78320-5TI</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tijeras Vannas Cutting Edge 3 mm, Recto</td&gt;<td&gt; Ciencias de Microscopía Electrónica</td&gt;<td&gt; 72932-01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Estilo de LA-1 y 1-MPF Todas las hojas lisas</td&gt;<td&gt; Ciencias de Microscopía Electrónica</td&gt;<td&gt; 77926-5S</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinzas acción negativa, estilo KOPINC 5</td&gt;<td&gt; Ciencias de Microscopía Electrónica</td&gt;<td&gt; 72850-F</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tijeras de disección 5 1/2 &quot;Straight</td&gt;<td&gt; Cedarlane</td&gt;<td&gt; 72960</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Autoclip starter set</td&gt;<td&gt; Harvard aparato</td&gt;<td&gt; 34-0557</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BD autoclip herida Syst Clausura., 9 mm de largo, 100 por paquete</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 01-804-5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 5-0 sutura</td&gt;<td&gt; Harvard aparato</td&gt;<td&gt; 517763</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Material de sutura monofilamento de PDS II violeta, 5-0, RB-1; Z303H</td&gt;<td&gt; CDMV</td&gt;<td&gt; 6167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12 mm de longitud 6-0 de silicio recubierto de sutura monofilamento</td&gt;<td&gt; Doccol Corporación</td&gt;<td&gt; 60SPRePK5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Seringes 1 ml</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 14-823-2F</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agujas 26G1 / 2</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; BD-305111</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; C57BL / 6</em&gt; Ratones</td&gt;<td&gt; IRCM</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</table

mouse model of intraluminal mcao: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining

El accidente cerebrovascular es la tercera causa de mortalidad y la principal causa de discapacidad en el mundo. Isquémicos cuentas de recorrido para aproximadamente el 80% de todos los accidentes cerebrovasculares. Sin embargo, el trombolítico activador del plasminógeno tisular (tPA) es el único tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico agudo que existe. Estos investigadores llevaron a desarrollar varios modelos de accidente cerebrovascular isquémico en una variedad de especies. Dos tipos principales de modelos de roedores se han desarrollado: modelos de isquemia global cerebral o isquemia cerebral focal. Para imitar el accidente cerebrovascular isquémico en los pacientes, en los cuales aproximadamente el 80% Ataques cerebrales trombóticos o embólicos ocurren en el territorio de la arteria cerebral media (MCA), la oclusión intraluminal de arteria cerebral media (MCAO) el modelo es muy relevante para los estudios de tiempos. Este modelo fue desarrollado por primera vez en ratas por Koizumi et al. En 1986 1. Debido a la facilidad de manipulación genética en ratones, estos modelos también se han desarrollado en este 2-3 especies. contenido &quot;&gt; Aquí, se presenta el procedimiento de oclusión MCA transitoria en ratones C57/BL6. Estudios previos han informado que las propiedades físicas del dispositivo de oclusión tales como diámetro de la punta, la longitud, la forma y la flexibilidad son fundamentales para la reproducibilidad del volumen de infarto 4. aquí, un monofilamentos silicio comerciales recubiertos (Doccol Corporation) han sido utilizados. Otra gran ventaja es que este monofilamento reduce el riesgo de inducir hemorragias subaracnoideas. Usando el estereomicroscopio Zeiss Stemi 2000, el monofilamento recubierto de silicona se introduce en la arteria carótida interna (ICA) a través de un corte en la arteria carótida externa (ECA) hasta que el monofilamento ocluye la base de la MCA. El flujo sanguíneo fue restaurado 1 hora después de la eliminación del monofilamento para imitar la restauración del flujo sanguíneo después de la lisis de un coágulo en tromboembólica los seres humanos. La extensión de infarto cerebral pueden ser evaluados primero por una puntuación neurológica y por la medición del volumen del infarto.Ratones isquémicos fueron analizados tanto por su puntuación neurológica en diferentes tiempos después de la reperfusión. Para evaluar el volumen del infarto, la tinción con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) se llevó a cabo por lo general. En esto, se utilizó tinción con violeta de cresilo, ya que ofrece la oportunidad de probar muchos marcadores críticos por inmunohistoquímica. En este vídeo, se presenta el procedimiento MCAO, los resultados neurológicos y la evaluación del volumen de infarto por tinción con violeta de cresilo.

La evaluación neuroscore confirma el éxito de tMCAO post-apoplejía y determina la eficiencia de la tMCAO después de la reperfusión. En nuestras manos, todos los ratones sometidos al procedimiento intraluminal presenta al menos una leve consistente Curling (neuroscore 2) y los déficit neurológicos son generalmente estables hasta 72 hr. La mayoría de los ratones muestran una leve rizado consistente (neuroscore 2). Los ratones que muestran ausencia de rizado se excluyeron del estudio. Sin embargo, la evaluación neuroscore no nos permite distinguir entre los ratones con un hipocampo lesionado y los que tienen un hipocampo intacto. No se observó mortalidad durante el día de la cirugía, lo que sugiere que las hemorragias subaracnoideas no ocurrió. Cuando la hemorragia subaracnoidea se identifica en un ratón, éste es sistemáticamente excluidos del análisis. El uso de silicio recubierto con monofilamento de Doccol Corporation, que es más suave que preparados en casa monofilamentos, incrementa el éxito detMCAO y reduce la hemorragia subaracnoidea. La mortalidad entre 24 hr y 72 hr es 14% en este modelo, como generalmente se informó de 60 minutos de oclusión. La mortalidad observada se debe probablemente a un volumen de infarto grande en esta cepa de ratón. Una reproducibilidad lesión fuerte también se ha observado (desviación estándar es 15%), que es muy interesante para estudiar las moléculas de neuroprotección donde podría ser su efecto (s) ocultas por la variabilidad del modelo. Para evaluar el alcance de la lesión cerebral después de tMCAO, se optó por utilizar tinción con violeta de cresilo (Figura 2) en lugar de TTC con el fin de tener una gran cantidad de materiales a prueba de marcadores relevantes 6. La extensión de la lesión es relativamente consistente. Sin embargo, nos dimos cuenta de que en algunos ratones, el hipocampo se lesionó (alrededor del 30% de los ratones). Es interesante notar que la tinción de violeta de cresilo se puede aplicar hasta 1 semana después. En la literatura, el porcentaje de infarto cerebral varía de unestudiar a la otra. Depende de la elección de la cepa de ratón, la anestesia, el espesor de las secciones del cerebro, el monofilamento usado, o la tinción utilizado 6, 7. <img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1highres.jpg" /> Figura 1. Esquema de la oclusión de la arteria cerebral media utilizando silicio recubierto con monofilamento intraluminal. Un esquema. Simplificado de cerebro de ratón y las arterias cerebrales que muestran suturas sucesivas y clip de preparar la introducción de silicio recubierto con monofilamento. B. La posición de monofilamento a través del círculo de Willis se representa. El monofilamento se introduce en la ACI a través de ECA para ocluir la base de la MCA ACA, la arteria cerebral anterior;. BA, arteria basilar, CCA, arteria carótida común; C. Willis, Círculo de Willis; ECA, la carótida externa artery, ICA, la arteria carótida interna, MCA, la arteria cerebral media, PCA, arteria comunicante posterior, PPA, arteria esfenopalatino. <img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Representativos secciones coronales de cerebro de ratón teñidas con violeta de cresilo después de 72 horas después de la reperfusión. Área de infarto (principalmente cuerpo estriado, la corteza y las áreas adyacentes del cerebro) aparece en blanco (sin manchas de violeta de cresilo). El volumen de la lesión (parte blanca, hemisferio derecho) se delimitó y se expresó como un porcentaje de la contralateral no lesionado área (hemisferio izquierdo).

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Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

El medio de oclusión intraluminal modelo cerebral en ratones se presentan en la presente memoria. La extensión del infarto cerebral se evaluó mediante una puntuación neurológica y tinción con violeta de cresilo, una alternativa a la tinción con TTC, que ofrece la gran ventaja de prueba en paralelo marcadores de interés muchos.

Modelo de ratón de MCAO intraluminal: Evaluación del infarto cerebral mediante tinción con violeta de cresilo

Stroke is the third  cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic  stroke accounts for approximately 80% of all strokes. ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

62.8K vistas.  Clinical Research Institute of Montreal. El medio de oclusión intraluminal modelo cerebral en ratones se presentan en la presente memoria. La extensión del infarto cerebral se evaluó mediante una puntuación neurológica y tinción con violeta de cresilo, una alternativa a la tinción con TTC, que ofrece la gran ventaja de prueba en paralelo marcadores de interés muchos.

Video: Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Modelo de ratón de la oclusión arteria cerebral media

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Investigación

Medicina

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United States in 20091,2. The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was developed by Koizumi4 in 1986 to simulate this 
impactful human pathology in the rat. A modification of the MCAO method was later presented by Longa3. Both techniques have been widely used to identify 
molecular mechanisms of brain injury resulting from ischemic stroke and potential therapeutic modalities5. This relatively noninvasive method in rats has been 
extended to use in mice to take advantage of transgenic and knockout strains6,7. To model focal cerebral ischemia, an intraluminal suture is advanced via 
the internal carotid artery to occlude the base of the MCA. Retracting the suture after a specified period of time mimics spontaneous reperfusion, but the 
suture can also be permanently retained. This video will be demonstrating the two major approaches for performing intraluminal MCAO procedure in mice in a 
stepwise fashion, as well as providing insights for potential drawbacks and pitfalls. The ischemic brain tissue will subsequently be stained by 
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to evaluate the extent of cerebral infarction8.

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is the most frequent used model among experimental ischemic stroke models. Here we will demonstrate the entire model in detail with the guide of Laser Doppler flowmetry, and its representative results.

Intraluminal la arteria cerebral media de oclusión (MCAO) Modelo para el ictus isquémico con Orientación flujometría láser Doppler en ratones

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal models of acute ischemic stroke allows to confirm successful arterial occlusion and exclude subarachnoid hemorrhage. Cerebral perfusion monitoring can also be used to study intracranial collateral circulation, which is emerging as a powerful determinant of stroke outcome and a possible therapeutic target. Despite a recognized role of Laser Doppler perfusion monitoring as part of the current guidelines for experimental cerebral ischemia, a number of technical difficulties exist that limit its widespread use. One of the major issues is obtaining a secure and prolonged attachment of a deep-penetration Laser Doppler probe to the animal skull. In this video, we show our optimized system for cerebral perfusion monitoring during transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal filament in the rat. We developed in-house a simple method to obtain a custom made holder for twin-fibre (deep-penetration) Laser Doppler probes, which allow multi-site monitoring if needed. A continuous and prolonged monitoring of cerebral perfusion could easily be obtained over the intact skull.

Cerebral perfusion monitoring has been demonstrated to improve accuracy in ischemic stroke models. Technical difficulties often limit the use of this essential tool for cerebrovascular research. In this video, an optimized system is shown to obtain a single or multi-site hemodynamic monitoring during intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats.

Sistema optimizado para la monitorización de la perfusión cerebral en el modelo de rata de Carrera intraluminal oclusión arteria cerebral media

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic stroke. However, the use of tPA is limited by its narrow therapeutic window and by increased risk of hemorrhagic transformation. There is an urgent need to develop suitable stroke models to study new thrombolytic agents and strategies for treatment of ischemic stroke. At present, two major types of ischemic stroke models have been developed in rats and mice: intraluminal suture MCAO and embolic MCAO. Although MCAO models via the intraluminal suture technique have been widely used in mechanism-driven stroke research, these suture models do not mimic the clinical situation and are not suitable for thrombolytic studies. Among these models, the embolic MCAO model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical investigation of thrombolytic therapy. This embolic model was first developed in rats by Overgaard et al.1 in 1992 and further characterized by Zhang et al. in 19972. Although embolic MCAO has gained increasing attention, there are technical problems faced by many laboratories. To meet increasing needs for thrombolytic research, we present a highly reproducible model of embolic MCAO in the rat, which can develop a predictable infarct volume within the MCA territory. In brief, a modified PE-50 tube is gently advanced from the external carotid artery (ECA) into the lumen of the internal carotid artery (ICA) until the tip of the catheter reaches the origin of the MCA. Through the catheter, a single homologous blood clot is placed at the origin of the MCA. To identify the success of MCA occlusion, regional cerebral blood flow was monitored, neurological deficits and infarct volumes were measured. The techniques presented in this paper should help investigators to overcome technical problems for establishing this model for stroke research.

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

Arteria embólico cerebral media oclusión (MCAO) para el ictus isquémico con homólogas coágulos de sangre en las ratas

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Evaluación de pulmón metástasis en el ratón mamarias modelos tumorales mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

A Battery of Motor Tests in a Neonatal Mouse Model of Cerebral Palsy

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, standardized battery of neonatal mouse motor tests. These tests can validate injury or disease models, determine treatment efficacy and/or assess motor behaviors in new transgenic strains. This paper presents a series of neonatal motor tests to evaluate general motor function, including ambulation, hindlimb foot angle, surface righting, negative geotaxis, front- and hindlimb suspension, grasping reflex, four limb grip strength and cliff aversion. Mice between the ages of post-natal day 2 to 14 can be used. In addition, these tests can be used for a wide range of neurological and neuromuscular pathologies, including cerebral palsy, hypoxic-ischemic encephalopathy, traumatic brain injury, spinal cord injury, neurodegenerative diseases, and neuromuscular disorders. These tests can also be used to determine the effects of pharmacological agents, as well as other types of therapeutic interventions. In this paper, motor deficits were evaluated in a novel neonatal mouse model of cerebral palsy that combines hypoxia, ischemia and inflammation. Forty-eight hours after injury, five tests out of the nine showed significant motor deficits: ambulation, hindlimb angle, hindlimb suspension, four limb grip strength, and grasping reflex. These tests revealed weakness in the hindlimbs, as well as fine motor skills such as grasping, which are similar to the motor deficits seen in human cerebral palsy patients.

Presented is a concise battery of mouse neonatal motor tests. Using these tests, neonatal motor deficits can be demonstrated in a variety of neonatal motor disorders. By having a standardized set of tests, results from different studies can be compared, allowing for better and accurate reporting between groups.

Una batería de pruebas de motor en un modelo de ratón neonatal de la parálisis cerebral

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, ...

Intraluminal Drug Delivery to the Mouse Arteriovenous Fistula Endothelium

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The simple murine AVF model was combined with intraluminal administration of drug solution to the venous endothelium at the same time as fistula creation. Technical aspects of this model are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The infra-renal aorta and IVC are dissected for clamping. After proximal and distal clamping, the puncture site is exposed and a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta and into the IVC. Immediately after the puncture, a reporter gene-expressing viral vector was infused in the IVC via the same needle, followed by 15 min of incubation. The intraluminal administration method enabled more robust viral gene delivery to the venous endothelium compared to administration by the external route. This novel method of delivery will facilitate studies that explore the role of the endothelium in AVF maturation and enable intraluminal drug delivery at the time of surgical operation.

After puncturing the aorta through the inferior vena cava (IVC) to create an aorto-caval fistula in the mouse, solution containing a drug is infused into the IVC via the same needle, followed by incubation. This method enables more robust drug delivery to the venous endothelium compared to the external route.

Intraluminal entrega de la droga a la fístula arteriovenosa ratón endotelio

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The ...

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have been established by tamoxifen induced deletion of Ccm genes in postnatal animals. These mouse models provide invaluable tools to investigate molecular mechanism and therapeutic approaches for CCM disease. An accurate and quantitative method to assess lesion burden and progression is essential to harness the full value of these animal models. Here, we demonstrate the induction of CCM disease in a mouse model and the use of the contrast enhanced X-ray micro computed tomography (micro-CT) method to measure CCM lesion burden in mouse brains. At postnatal day 1 (P1), we used 4-hydroxytamoxifen (4HT) to activate Cre recombinase activity from the Cdh5-CreErt2 transgene to cleave the floxed allele of Ccm2. CCM lesions in mouse brains were analyzed at P8. For micro-CT, iodine based Lugol&#39;s solution was used to enhance contrast in brain tissue. We have optimized the scan parameters and utilized a voxel dimension of 9.5 &#181;m, which lead to a minimum feature size of approximately 25 &#181;m. This resolution is sufficient to measure CCM lesion volume and number globally and accurately, and provide high-quality 3-D mapping of CCM lesions in mouse brains. This method enhances the value of the established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for CCM and other cerebrovascular diseases.

This protocol demonstrates the induction of cerebral cavernous malformation disease in a mouse model and uses contrast enhanced micro computed tomography to measure lesion burden. This method enhances the value of established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for cerebral cavernous malformation and other cerebrovascular diseases.

Inducción y Micro-CT en la proyección de imagen de malformaciones cavernosas cerebrales en modelo murino

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Two-vessel Occlusion Mouse Model of Cerebral Ischemia-reperfusion

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse model is useful for investigating the pathophysiology of cerebral ischemia-reperfusion and determining potential therapeutic strategies for patients with stroke. Variations in the anatomy of the circle of Willis of C57BL/6 mice affects their infarct volume after cerebral-ischemia-induced injury. Studies have indicated that distal MCA occlusion (MCAO) can overcome this problem and result in a stable infarct size. In this study, we establish a two-vessel occlusion mouse model of cerebral ischemia-reperfusion through the interruption of the blood flow to the right MCA. We distally ligate the right MCA and right common carotid artery (CCA) and restore blood flow after a certain period of ischemia. This ischemia-reperfusion injury induces an infarct of stable size and a behavioral deficit. Peripheral immune cells infiltrate the ischemic brain within the 24 h infiltration period. Additionally, the neuronal loss in the cortical area is less for a longer reperfusion duration. Therefore, this two-vessel occlusion model is suitable for investigating the immune response and neuronal recovery during the reperfusion period after cerebral ischemia.

A mouse model of cerebral ischemia-reperfusion is established to investigate the pathophysiology of stroke. We distally ligate the right middle cerebral artery and right common carotid artery and restore blood flow after 10 or 40 min of ischemia.

Oclusión de los vasos dos ratón modelo de isquemia-reperfusión Cerebral

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse ...