Este trabajo fue financiado por el cluster de excelencia de la Fundación Alemana de Investigación &quot;Munich Cluster de Sistemas de Neurología (sinergia)&quot; y por la Fundación Daimler-Benz para AL

Declaración de Ética Los experimentos descritos en este video se realizaron de acuerdo con las directrices nacionales para el uso de animales de experimentación y los protocolos fueron aprobados por los comités gubernamentales alemanas (Regierung von Oberbayern, Múnich, Alemania). 10 semanas de edad, los ratones macho C57BL/6J se utilizan en este estudio. Los animales fueron alojados en condiciones de temperatura controlada (22 ± 2 ° C), con una duración del ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y acceso a los alimentos en gránulos y agua ad libitum. Analgesia y protocolos de sedación se describen como aprobado por el comité gubernamental local, pero pueden diferir de protocolos utilizados en otros laboratorios. 1. Preparación del Material y Instrumentos <ol><li> Conectar la manta de calor con el fin de mantener el área de operación de calentamiento y mantener la temperatura del cuerpo del ratón durante la anestesia (37 ° C). </li><li> Tijeras Preparar en autoclave, pinzas y algodones, dexpanthenol pomada para los ojos y el material de sutura. Preparar una jeringa con solución salina (sin aguja) para mantener el área de operación hidratado. Prepare el gas de anestesia (70% de N 2 O + 30% O 2 + isoflurano). </li><li> Inyectar analgésicos por vía intraperitoneal: Metamizol 200 mg / kg, carprofeno 4 mg / kg de buprenorfina y 0,1 mg / kg. </li><li> Coloque el ratón en la cámara de inducción con una tasa de flujo de isoflurano de 4% para anestesiar hasta movimiento espontáneo de cuerpo y vibrisas se detiene. </li><li> Transferir el ratón en la posición lateral, con su nariz en la máscara de la anestesia y mantener la concentración de isoflurano en el 4% aproximadamente un minuto, luego reducir y en approx.1.5% para mantener la anestesia adecuada. </li><li> Aplique una pomada ocular dexpantenol en ambos ojos. </li></ol> 2. Modelo MCAO distal <ol><li> Haga una incisión en la piel de 1 cm entre el oído y el ojo utilizando pequeñas tijeras de funcionamiento después de la preparación aséptica del usin del sitio quirúrgicog desinfectante de la piel. </li><li> Separar la piel y localizar el músculo temporal. </li><li> Seleccione en el generador de alta frecuencia de la función de la coagulación, el modo bipolar, seleccione 12 W y conecte las pinzas de electrocoagulación con el cable. </li><li> Añadir una gota de solución salina y el uso de los fórceps para separar el músculo temporal del cráneo en su parte apical y dorsal, de ese modo, haciendo un colgajo de músculo sin retirar totalmente el músculo. </li><li> Identificar la MCA por debajo del cráneo transparente, en la parte rostral de la zona temporal, dorsal al seno retro-orbital (Figura 2A). Si la bifurcación MCA no es visible (debido a una variación normal anatómica) identificar el recipiente más rostral. </li><li> Agregue un poco de solución salina en el cráneo y disipe el hueso con la broca justo encima de la rama MCA hasta que tenga una textura fina y translúcida (Figura 2B). </li><li> Retirar con cuidado el hueso por encima de la arteria con un muy delgadas fórceps. </li><li> Seleccione el modo bipolar in el generador de frecuencia alta a 7 W. Coagulate la arteria con la electrocoagulación fórceps proximal y distal a la bifurcación (Figura 2C). Cuando la bifurcación no es visible debido a una variante anatómica, coagular la rama MCA correctamente identificados (véase más arriba) en dos sitios de aprox. Distancia de 1 mm. No es necesario para comprender la arteria con las pinzas para la coagulación, tocar la arteria cuidadosamente con las pinzas en ambos lados desde arriba es suficiente e induce menos daño mecánico. </li><li> Espere 30 segundos y toque suavemente la arteria con una pinza de punta roma para comprobar si hay flujo sanguíneo debido a la recanalización espontánea. En caso de recanalización repetir la electrocoagulación una vez. </li><li> Cambie la ubicación del músculo temporal a su posición, cubriendo el agujero de trépano. </li><li> La sutura de la herida y colocar al animal en una caja de enfermería a los 32 ° C para recuperarse de la anestesia y devolverlo a la jaula. En general se tarda 5-10 min para el animal pueda recuperarse de AnesthEIAS. </li><li> Inyectar la analgesia postoperatoria (ip) después de 24 horas y luego todos los días hasta el quinto día del postoperatorio: Carprofeno 4 mg / kg. </li></ol> 3. Sham Operación Realice todos los procedimientos de forma idéntica a la operación descrita anteriormente - incluyendo adelgazamiento de la calavera y su eliminación - a excepción de no coagular la arteria expuesta. 4. Prueba del cilindro 13 <ol><li> Colocar el animal en un cilindro de acrílico transparente de vidrio (diámetro: 8 cm, altura: 25 cm) delante de dos espejos y cintas de vídeo de 5 min. Ajuste la cámara en el centro delante de los dos espejos y el cilindro para obtener un vídeo (Figura 3A) óptima. </li><li> Para la evaluación del uso de la extremidad anterior independiente, la puntuación (1) contacto de la pared del cilindro con una extremidad anterior durante trasera completa y (2) el aterrizaje con una sola extremidad anterior en el piso después de trasero completo. Contar al menos 20 contactos para una extremidad anterior utilizando la cámara lenta o cuadro por frfunción ame del Video Client Lan (VLC) software freeware ( <a href="http://www.videolan.org/vlc">http://www.videolan.org/vlc</a> ). </li><li> Para el análisis de la línea de base antes de la cirugía: realizar la prueba dos veces por ratón, con un descanso de 1 hora entre los ensayos. Uso de la extremidad anterior se expresa como una proporción de la derecha / izquierda caras, el uso de la extremidad anterior independiente. </li><li> Después de la coagulación MCA: realice la prueba de nuevo dos veces por ratón, con un descanso de 1 hora entre los ensayos, como se indica más arriba. </li></ol> 5. Perfusión <ol><li> Anestesiar los animales (por ejemplo, por la ketamina y xilazina 120/16 mg / kg de peso corporal, respectivamente). </li><li> Fijar el animal en posición supina y abrir la cavidad abdominal con un corte de la mediana. Retire rasgaduras y esternón. Haga una pequeña incisión en la aurícula derecha. Insertar una cánula de perfusión en el ventrículo izquierdo y perfundir lentamente con 20 ml de solución salina. </li><li> Decapitar al animal, abrir la bóveda craneal y retire suavemente el cerebro de la base del cráneo. </li><li&gt; Congelar los cerebros en -40 ° C isopentano frío durante 10 min. Después retire los cerebros del isopentano y almacenar hasta nuevo análisis a -80 ° C. </li></ol> 6. Infarto Volumetría <ol><li> Cryosectioning: Corte los cerebros en serie en un criostato a 20 micras de espesor secciones cada 400 m en las diapositivas y las diapositivas almacenar a -20 ° C. </li><li> Cresil violeta (CV) tinción: <ol><li> Preparar la solución de tinción: Mezclar 0,5 g de acetato de CV en 500 ml de H 2 O. Agitar y calentar (60 ° C) hasta que se disuelven los cristales. Deje enfriar la solución y lo guarde en un frasco oscuro. Vuelva a calentar a 60 ° C y el filtro antes de cada uso. </li><li> Secar los portaobjetos a TA durante 30 min. Luego colocarlos en etanol al 95% durante 15 min y luego en etanol al 70% durante 1 min y después en etanol al 50% durante 1 min. </li><li> Colocar los portaobjetos en agua destilada durante 2 min, refrescar el agua destilada y el lugar en durante 1 min. Luego coloque los portaobjetos en solución de tinción (60 ° C) fo 10 minutos y lavar dos veces en agua destilada durante 1 min. </li><li> Colocar los portaobjetos en etanol al 95% durante 2 min. Luego colocarlos en etanol al 100% durante 5 min, actualice el 100% de etanol y colocarlos en durante 2 min. Luego cubrir los portaobjetos con medio de montaje. </li><li> Análisis: Escanear las diapositivas y analizar el volumen de infarto indirecta por el método Swanson 14 para corregir el edema: (Área isquémica) = (área de la corteza del lado contralateral) - (área de la corteza no isquémica del lado ipsilateral) (Figura 4). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Donnan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke.">Stroke.</a> Lancet. 371, 1612-1623 (2008).</li><li>Di Carlo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+stroke+in+Europe:+A+collaborative+study+of+population-based+cohorts.+ILSA+Working+Group+and+the+Neurologic+Diseases+in+the+Elderly+Research+Group.+Italian+Longitudinal+Study+on+Aging.">Frequency of stroke in Europe: A collaborative study of population-based cohorts. ILSA Working Group and the Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Italian Longitudinal Study on Aging.</a> Neurology. 54, 28-33 (2000).</li><li>Hacke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombolysis+with+alteplase+3+to+4.5+hours+after+acute+ischemic+stroke.">Thrombolysis with alteplase 3 to 4.5 hours after acute ischemic stroke.</a> N. Engl. J. Med. 359, 1317-1329 (2008).</li><li>Jauch, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+early+management+of+patients+with+acute+ischemic+stroke:+a+guideline+for+healthcare+professionals+from+the+American+Heart+Association/American+Stroke+Association.">Guidelines for the early management of patients with acute ischemic stroke: a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association.</a> Stroke. 44, 870-947 (2013).</li><li>Longa, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats.">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20, 84-91 (1989).</li><li>Engel, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+stroke+in+mice+-+middle+cerebral+artery+occlusion+with+the+filament+model.">Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model.</a> J. Vis. Exp. (47), e2423 (2011).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rat+model+of+thrombotic+focal+cerebral+ischemia.">A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 17, 123-135 (1997).</li><li>Tamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat:+1.+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion.">Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).</li><li>Chen, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+focal+ischemic+stroke+in+the+rat:+reproducible+extensive+cortical+infarction.">A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction.</a> Stroke. 17, 738-743 (1986).</li><li>Tureyen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infarct+volume+quantification+in+mouse+focal+cerebral+ischemia:+a+comparison+of+triphenyltetrazolium+chloride+and+cresyl+violet+staining+techniques.">Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques.</a> J. Neurosci. Methods. 139, 203-207 (2004).</li><li>Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+focal+stroke:+size,+mechanism,+and+purpose.">Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose.</a> NeuroRx. 2, 396-409 (2005).</li><li>Howells, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+strokes+for+different+folks:+the+rich+diversity+of+animal+models+of+focal+cerebral+ischemia.">Different strokes for different folks: the rich diversity of animal models of focal cerebral ischemia.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 30, 1412-1431 (2010).</li><li>Schallert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+plasticity+and+assessment+of+forelimb+sensorimotor+outcome+in+unilateral+rat+models+of+stroke,+cortical+ablation,+parkinsonism+and+spinal+cord+injury.">CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).</li><li>Swanson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semiautomated+method+for+measuring+brain+infarct+volume.">A semiautomated method for measuring brain infarct volume.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 10, 290-293 (1990).</li><li>Kitano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhalational+anesthetics+as+neuroprotectants+or+chemical+preconditioning+agents+in+ischemic+brain.">Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 27, 1108-1128 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+intravenous+recombinant+tissue+plasminogen+activator+on+ischemic+stroke+lesion+size+measured+by+computed+tomography.+NINDS;+The+National+Institute+of+Neurological+Disorders+and+Stroke+(NINDS)+rt-PA+Stroke+Study+Group.">Effect of intravenous recombinant tissue plasminogen activator on ischemic stroke lesion size measured by computed tomography. NINDS; The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) rt-PA Stroke Study Group.</a> Stroke. 31, 2912-2919 (2000).</li><li>Sowell, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cortical+change+across+the+human+life+span.">Mapping cortical change across the human life span.</a> Nat. Neurosci. 6, 309-315 (2003).</li><li>Brott, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+acute+cerebral+infarction:+lesion+size+by+computed+tomography.">Measurements of acute cerebral infarction: lesion size by computed tomography.</a> Stroke. 20, 871-875 (1989).</li><li>Hacke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant'+middle+cerebral+artery+territory+infarction:+clinical+course+and+prognostic+signs.">Malignant' middle cerebral artery territory infarction: clinical course and prognostic signs.</a> Arch. Neurol. 53, 309-315 (1996).</li><li>Majid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+vulnerability+to+permanent+focal+cerebral+ischemia+among+3+common+mouse+strains.">Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains.</a> Stroke. 31, 2707-2714 (2000).</li><li>Liesz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boosting+regulatory+T+cells+limits+neuroinflammation+in+permanent+cortical+stroke.">Boosting regulatory T cells limits neuroinflammation in permanent cortical stroke.</a> J. Neurosci. 33 (44), 17350-17362 (2013).</li><li>Liesz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+lymphocyte+trafficking+shields+the+brain+against+deleterious+neuroinflammation+after+stroke.">Inhibition of lymphocyte trafficking shields the brain against deleterious neuroinflammation after stroke.</a> Brain. 134, 704-720 (2011).</li><li>Jones, B. J., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rotarod+suitable+for+quantitative+measurements+of+motor+incoordination+in+naive+mice.">A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice.</a> Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 259, 211 (1968).</li><li>Bouet, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesive+removal+test:+a+sensitive+method+to+assess+sensorimotor+deficits+in+mice.">The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice.</a> Nat. Protoc. 4, 1560-1564 (2009).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+test+for+detecting+long-term+sensorimotor+dysfunction+in+the+mouse+after+focal+cerebral+ischemia.">A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia.</a> J. Neurosci. Methods. 117, 207-214 (2002).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+in+situ+thromboembolic+stroke+and+reperfusion.">Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion.</a> Stroke. 38, 2771-2778 (2007).</li><li>Farr, T. D., Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+impairments+in+skilled+reaching+in+the+mouse+(Mus+musculus)+after+a+focal+motor+cortex+stroke.">Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke.</a> Stroke. 33, 1869-1875 (2002).</li><li>Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonocclusion+and+spontaneous+recanalization+rates+in+acute+ischemic+stroke:+a+review+of+cerebral+angiography+studies.">Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies.</a> Arch. Neurol. 59, 1870-1873 (2002).</li></ol>

Los autores no tienen intereses en conflicto a revelar.

El presente protocolo describe el modelo de accidente cerebrovascular experimental de distal, MCAO permanente mediante electrocoagulación transcraneal - el llamado &quot;modelo de coagulación&quot;. Este modelo se ha convertido mientras tanto en uno de los modelos animales utilizados con mayor frecuencia en la investigación experimental de carrera 12. En comparación con otros modelos de isquemia focal cerebral, el modelo de coagulación tal como se presenta en este video tiene la ventaja de un tiempo de funcionamiento muy corto de aproximadamente 10 minutos cuando se lleva a cabo por un científico entrenado. Por lo tanto, los tiempos de anestesia breves pueden ser alcanzados en este modelo, que es una característica favorable de un modelo de accidente cerebrovascular experimental debido a que el impacto de los anestésicos en la neuroprotección y accidente cerebrovascular resultado es bien conocido-15. Por otra parte, como se ha descrito previamente por Carmichael et al. 11, que corroboran que el volumen del infarto resultante y después de la localización distal de coagulación permanente MCA corresponde a lesiones cerebrales isquémicas en la mayoría de los humanosaccidentes cerebrovasculares en proporción con el tamaño del cerebro. Derrame cerebral humana es en general de pequeño tamaño, con lesiones de aproximadamente 5 a 15% del hemisferio, con base en estudios de población anteriores y los ensayos clínicos por imágenes de 16-18, en contraste con las lesiones de accidente cerebrovascular extensas con edema cerebral a la compresión que se producen en menos del 10% de trazos clínica 19. De esta manera, las lesiones de accidente cerebrovascular en el territorio de la ACM de alrededor del 12% del hemisferio alcanzado por el modelo presentado puede ser considerado como un volumen de movimiento translacional relevante. Sin embargo, ha de tenerse en cuenta que diferentes cepas de ratón o protocolos de anestesia utilizados podrían afectar el volumen 20 de la lesión resultante. La mortalidad durante el período de observación después de la carrera de admisión en este modelo está prácticamente ausente. La mortalidad global de menos del 5% se compone principalmente de las muertes durante la operación debido a complicaciones anestésicas o sacrificio, porque llegar a los criterios de exclusión. Con el fin de justificar la baja variability de este modelo y su excelente reproducibilidad, sugerimos los siguientes criterios de exclusión: 1) Cualquier hemorragia subaracnoidea durante la operación. 2) El tiempo de funcionamiento más de 15 min. 3) La recanalización de la ACM después de dos intentos de electrocoagulación con sólo MCAO transitoria. Además, los animales deben ser examinados todos los días después de MCAO (comportamiento fisiológico básico, la apariencia de la piel y el peso corporal) para controlar el dolor, incomodidad o comportamiento de la enfermedad. Varias medidas podrían aplicarse para el análisis de los resultados de carrera como medida de moteado láser, la resonancia magnética, pruebas de comportamiento o el análisis histológico. En este protocolo proporcionamos ejemplos de métodos para el análisis de comportamiento y análisis de volumen de infarto. Varios de prueba para el análisis del comportamiento después de la isquemia cerebral focal se han desarrollado y utilizado en la investigación experimental accidente cerebrovascular. Pruebas adecuadas para la disfunción sensoriomotora utilizado anteriormente por nuestro grupo en este modelo de carrera que 21,22re la prueba de Rotarod 23, prueba de Etiqueta adhesiva 24, la prueba de la esquina 25 y la prueba del cilindro 13, que se demuestra en este vídeo. La prueba del cilindro representa consistentemente asimetría de motor en la fase aguda tras distal de la MCAO permanente y también detecta recuperan consecutivo de la función motora. A pesar de las evidentes ventajas, algunas limitaciones de este modelo de carrera tienen que ser tomadas en cuenta. En primer lugar, se necesita una trepanación del cráneo con el fin de coagular la arteria, produciendo de este modo un acceso potencial de infecciones peri-operativos del cerebro, aunque las infecciones bacterianas de la herida quirúrgica, músculo temporal o el cerebro en sí nunca han sido detectados por nosotros mismos o documentada por los demás utilizando este modelo. Por otra parte, el daño mecánico a la corteza durante la preparación y la coagulación no se puede excluir, pero puede ser limitado por cuidado de perforación y extracción del cráneo, humidificación constante de la zona quirúrgica y NE mínimo<html> electrocoagulación cessary (ver criterios de exclusión). Aunque el curso de la MCA como se representa en la Figura 2 se encuentra en la mayoría de los ratones C57BL / 6, se describe en el protocolo de la forma de proceder en las variaciones normales de la rumbo del buque para reducir al mínimo la variabilidad del modelo. Por otra parte, se sugiere el uso de múltiples (3 en el caso de bifurcación; 2 sin bifurcación de los MCA) sitios de oclusión para minimizar el riesgo de recanalización parcial de la MCA, que en nuestra experiencia es un factor importante para la variabilidad de este modelo. En términos de las pruebas de comportamiento, sólo déficits de comportamiento de menor importancia pueden ser detectados en las pruebas de comportamiento mencionados anteriormente-y regeneración funcional se pueden observar dentro de la primera semana después del accidente cerebrovascular. Por lo tanto, los sistemas de prueba más avanzados con mayor sensibilidad y parámetros de ensayo cualitativos como la prueba de alcanzar experto 27 podría ser más adecuado para detectar el resultado funcional a largo plazo en este modelo. ONTENIDO &quot;&gt; Finalmente, debido a la coagulación permanente de la MCA sin reperfusión se puede conseguir, que es una característica observada en un porcentaje sustancial de pacientes con accidente cerebrovascular debido a la lisis del coágulo espontánea o terapia 28. Sin embargo, un modelo de accidente cerebrovascular tromboembólico se ha descrito previamente 26 proporciona la opción por un modelo de carrera de cortesía con la reperfusión de la isquemia cerebral cortical. Tomados en conjunto, la alta reproducibilidad, la posible observación a largo plazo debido a la mortalidad mínima y el volumen del infarto en relación comparable y localización en los infartos humano distinguir el &quot;modelo de la coagulación&quot; como un modelo valioso para la investigación básica y traslacional accidente cerebrovascular.

El accidente cerebrovascular es la tercera causa más común de muerte y una de las principales razones de discapacidad en los adultos adquirida en los países desarrollados 1. Aproximadamente el 80% de esta enfermedad neurológica aguda es causada por la isquemia cerebral resultante de una obstrucción del flujo sanguíneo cerebral mientras que alrededor del 15% son causados ​​por una hemorragia intracerebral 2. A pesar de las investigaciones en curso, la administración intravenosa de activador tisular del plasminógeno es el único tratamiento farmacológico aprobado para el accidente cerebrovascular isquémico hasta ahora y sólo están disponibles para una minoría de pacientes con accidente cerebrovascular debido a la ventana de tiempo corto aprobado de 4,5 horas después del accidente cerebrovascular inicio 3,4. Dado que no existen modelos in vitro, que pueden modelar adecuadamente las complejas interacciones entre el cerebro, los vasos y los mecanismos fisiopatológicos sistémicos durante tiempos, los modelos animales son esenciales para la investigación del accidente cerebrovascular preclínica. Por lo tanto, varios modelos de accidente cerebrovascular isquémico se han desarrollado en una variabledad de especies. Uno de los modelos de accidente cerebrovascular más comúnmente utilizado es el &quot;modelo de filamento&quot;, donde un filamento de sutura se introduce transitoriamente en la arteria carótida interna y se envía hasta que la punta ocluye el origen de la arteria cerebral media (MCA), que resulta en una parada del flujo de sangre y el infarto cerebral posterior también regiones corticales subcorticales y en caso de oclusión prolongada 5,6. En modelos photothrombotic de accidente cerebrovascular isquémico, una oclusión fotoquímica del buque cortical irradiado se consigue después de la inyección de un fotosensibilizador que resulta en lesiones pequeñas, circunscritos localmente 7. La oclusión permanente de la MCA distal de las arterias lenticulostriatal se puede lograr mediante una ligadura de la arteria, su compresión transitoria o por 8,9 coagulación permanente. El infarto que resulta en este modelo afecta principalmente la neocorteza 10 debido a que la oclusión de la MCA en este modelo es distal a la lénticosarterias ulostriatal, que abastecen a los ganglios basales. Dado que la mayoría de las lesiones de accidente cerebrovascular humanos se encuentran en el territorio de la arteria cerebral media, todos los modelos de accidente cerebrovascular comunes parecen oclusiones de la ACM o una de sus ramas 11. El MCA es una de las principales arterias que proporciona suministro de sangre al cerebro; que nace de la arteria carótida interna, rutas a lo largo del surco lateral donde se ramifica y proyectos a los ganglios basales y las superficies laterales de los lóbulos frontal, parietal y lóbulos temporales, incluyendo el motor principal y la corteza sensorial. La derecha y la izquierda MCA se conectan a las arterias cerebrales anteriores y arterias comunicantes posteriores, que se conectan a las arterias cerebrales posteriores, creando el Círculo de Willis (Figura 1). Como se informó anteriormente por Carmichael et al. 11, infartos modelados por el Ar cerebral media distalmodelo de batería de oclusión (MCAO) en ratones abarcan alrededor del 10-15% del hemisferio, imitando así la mayoría de las lesiones de accidente cerebrovascular humanos que se encuentran en el territorio de la ACM cortical 11,12. En 1981, Tamura et al. Describe un modelo de coagulación transcraneal permanente, MCAO en ratas 8. Sin embargo, el modelo descrito por Tamura implicó una oclusión proximal de la MCA con el fin de eludir la bifurcación más distal de la arteria. Por lo tanto, el &quot;modelo de Tamura&quot; original induce no sólo las lesiones corticales, sino también del cuerpo estriado, similares a las lesiones obtenidos por el &quot;modelo de filamento&quot; 6. Aquí se describe el modelo de MCAO distal permanente mediante electrocoagulación transcraneal en ratones. Adicionalmente, informamos histológica relacionada y métodos funcionales para analizar el resultado del accidente cerebrovascular en este modelo. Todos los métodos se basan en los procedimientos operativos estándar desarrollados y utilizados en nuestros laboratorios.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="948">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Camera Canon Eos 500D</td>
			<td style="width:224px;">Canon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:324px;">optics: 18-55 mm; 30 fps; 640x480 video function</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Mirror</td>
			<td style="width:224px;">Kristallform</td>
			<td style="width:119px;">2677089</td>
			<td>30x30 cm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Transparent acrylic glass cylinder</td>
			<td style="width:224px;">H&#38;S Kunststofftechnik</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>diameter: 8 cm,&#160; height: 25 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Heating blanket</td>
			<td>FHC DC Temperature Controller</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Fine Scissors</td>
			<td style="width:224px;">FST</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Mayor Scissors</td>
			<td style="width:224px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">1410-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Forceps</td>
			<td style="width:224px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11616-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Cotons</td>
			<td style="width:224px;">NOBA Verbondmitel Danz</td>
			<td style="width:119px;">974116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Saline solution</td>
			<td style="width:224px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">131321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Bepanthen pomade</td>
			<td style="width:224px;">Bayer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:224px;">Abbot</td>
			<td style="width:119px;">B506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anesthesia system for isoflurane</td>
			<td>Drager</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Stereomikroskop&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Electrosurgical device</td>
			<td colspan="2">ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgieger&#228;t</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Drill</td>
			<td style="width:224px;">Proxxon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D-34343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Ketamine</td>
			<td style="width:224px;">Inresa Arzneimittel GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Xylacine</td>
			<td style="width:224px;">Albrecht</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5ml Syringe&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Phosphate Buffered Saline PH: 7,4</td>
			<td>Apotheke Innestadt Uni Munchen</td>
			<td style="width:119px;">P32799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Isopentane</td>
			<td style="width:224px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">59070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific CryoStarNX70</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Cresyl violet</td>
			<td>Sigma Life Science&#160;</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Life Science&#160;</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Ethanol 70%</td>
			<td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td>
			<td>521005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Ethanol 96%</td>
			<td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td>
			<td>522078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 99%</td>
			<td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td>
			<td style="width:119px;">ETO-5000-99-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Roti-Histokit mounting medium</td>
			<td style="width:224px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">6638.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">C57Bl/6J mice</td>
			<td style="width:224px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;">000664</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery

El accidente cerebrovascular es la tercera causa más común de muerte y la principal causa de discapacidad en los adultos adquirida en los países desarrollados. Opciones terapéuticas muy limitadas están disponibles para una pequeña proporción de los pacientes con ictus en fase aguda. La investigación actual está intensamente buscando nuevas estrategias terapéuticas y se está centrando cada vez más en la fase subaguda y crónica después del accidente cerebrovascular debido a que más pacientes podrían ser elegibles para las intervenciones terapéuticas en una ventana de tiempo prolongado. Estos mecanismos incluyen retraso importantes vías fisiopatológicas como la inflamación post-accidente cerebrovascular, la angiogénesis, la plasticidad neuronal y la regeneración. Para analizar estos mecanismos y evaluar posteriormente nuevos objetivos farmacológicos, se buscan modelos experimentales de accidente cerebrovascular con relevancia clínica, baja mortalidad y una alta reproducibilidad después. Por otra parte, los ratones son los mamíferos más pequeños en los que una lesión derrame cerebral focal puede ser inducido y para los que un amplio espectro de modelos transgénicos sedisponible. Por lo tanto, se describe aquí el modelo de ratón de transcraneal, coagulación permanente de la arteria cerebral media a través de electrocoagulación distal de las arterias lenticulostriatal, el llamado &quot;modelo de coagulación&quot;. El infarto que resulta en este modelo se encuentra principalmente en la corteza; el volumen de infarto relativa en relación con el tamaño del cerebro corresponde a la mayoría de los accidentes cerebrovasculares humanos. Por otra parte, el modelo cumple los criterios antes mencionados de la reproducibilidad y baja mortalidad. En este video se demuestra los métodos quirúrgicos de carrera de admisión en el &quot;modelo de la coagulación&quot; y presenta herramientas de análisis histológicos y funcionales.

Debido al corto tiempo y moderada daño cerebral anestesia, aproximadamente 10 min después de la transferencia a sus jaulas de todos los animales estaban despiertos, moviéndose libremente en la jaula y la interacción con compañeros de camada. La mortalidad durante la cirugía MCAO fue inferior al 5%, principalmente como resultado de una hemorragia subaracnoidea o anestesia incorrecta. La mortalidad durante el tiempo de observación 7 días después de la carrera de admisión se produce muy raramente en aproximadamente el 1-2% de los animales. En la serie de funcionamiento de 10 animales para este informe a todos los animales sobrevivieron a la operación y el período de observación de 7 días, ninguno de ellos tuvo que ser excluido debido a los criterios de exclusión. Déficits de comportamiento después de MCA coagulación fueron evaluadas por la prueba del cilindro uso pata 13 analizar la asimetría. En esta prueba, la relación de uso pata delantera izquierda y derecha independientes se mide en los puntos de tiempo indicados después de la carrera de inducción y se comparó con los valores de referencia obtenidos 24h antes de la MCAO (Figura 3B). Los animales presentaron un cambio significativo en el uso extremidad asimetría para la exploración de pared combinado en el cilindro de ensayo de 24 horas (1,72 ± 0,326, p &lt;0,05) y de 3 días (1,36 ± 0,17, p &lt;0,05) después de la MCAO. Aunque la relación mejoró durante la 1 semana de tiempo de observación, la asimetría del motor era todavía significativa 7 días después de la MCAO (1,35 ± 0,29, p &lt;0,05) en comparación con los valores basales. Se realizó volumetría del infarto utilizando secciones del cerebro coronales seriadas cresil violeta manchado 7 días después del golpe de inducción (Figura 4 B). La media de volumen del infarto fue de 15,4 mm 3, con lo que representa el 12% de un hemisferio cerebral (Figura 4C). La variabilidad de este modelo de accidente cerebrovascular es excepcionalmente bajo con una desviación estándar de aproximadamente 10%. El área de la lesión abarca el somatosensorial y la corteza motora con la menor afección de las estructuras subcorticales. Por otra parte, la localización del infartoárea es muy predecible con sólo la variabilidad mínima como se muestra en el diagrama de distribución esquemático (Figura 4D). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Representación esquemática del polígono de Willis. El círculo arterial de Willis está formado por las arterias cerebral media (MCA) y las arterias cerebrales anteriores (ACA) que se ramifican desde la arteria carótida interna (ACI), así como por la arterias cerebrales posteriores (ACP) y la arterias comunicantes posteriores (PComA). El MCA se ejecuta en el surco lateral donde se bifurca a la corteza cerebral. La rama MCA dominante suministrar la mayor parte de la corteza motora y parte de la corteza somatosensorial se ocluye de forma permanente por el modelo demostrado (arteria comunicante Acoma = anterior; BA = arteria basilar; Suca = cerebel Superiorarteria lar). <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig2highres.jpg" width="400" /> Figura 2. Vista transcraneal después de la eliminación del músculo temporal y vista esquemática de oclusión de la MCA. (A) Después de quitar el músculo temporal las arterias corticales pueden ser vistos a través del cráneo del ratón parcialmente translúcida (en ratones de 8-12 semanas de edad). La rama dominante MCA puede ser identificado en la parte rostral de la vista temporal, así como otras arterias corticales se ramifican desde el MCA y el PCA en la parte caudal. (B) Representación esquemática de la rama MCA dominante en su variante predominante con una bifurcación en la corteza temporal lateral después de la perforación de un agujero de trépano y la eliminación del cráneo. (C) Los cuadrados negros representan los sitios de coagulación MCA en proximales y distales de los lados de la bifurcación. Figura 3. Análisis de los déficit de comportamiento. (A) la configuración de prueba del cilindro: el ratón se coloca en un cilindro vertical y espejos se colocan detrás para registrar todos los movimientos utilizando una cámara de video (B) el uso Miembro Anterior asimetría se analizó mediante la prueba de cilindro.. Relaciones de izquierda / derecha del uso de la extremidad anterior independiente se calcularon 24 hr antes MCAO y en los puntos de tiempo indicados después del accidente cerebrovascular de inducción. N = 10, * p &lt;0,05 entre el punto de tiempo indicado y de referencia (control) de valor. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Volumétrico análisis del infarto y resultado del infarto después de MCAO distal. (A) Imagen representativa de una cresil violeta manchado sujetador coronalen la sección 7 días después de MCAO. La línea amarilla indica la selección de la corteza contralateral (derecho) y la línea roja es la selección de la corteza no infartada (manchado) del cerebro ipsilateral. El área pálida en el hemisferio izquierdo representa el área de tejido infartado. (B) el análisis del volumen del infarto de 10 cerebros (cada punto representando un cerebro individual) las 24 horas, 3 días y 7 días después de la coagulación MCA distal. La línea roja horizontal representa la media, las barras de error indican la desviación estándar. (C) Representante violeta de cresilo teñidas secciones cerebrales coronales cada 400 micras, con 7 días después de la MCA coagulación. (D) de distribución esquemática del tejido cerebral infartado 7 días después de la MCAO. Cada diapositiva muestra la información acumulada de la distribución del infarto (código de color, como se indica) en la sección dada en relación con el bregma (imagen modificada a partir de:. Liesz A et al, Brain, 2011; con permiso de Oxford University Press). &lt;a href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery at JoVE.com

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Varios modelos murinos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) son ampliamente utilizados en la investigación experimental cerebro. Aquí, nos demuestran el modelo de transcraneal permanente MCAO distal que produce infarto cortical consistente de un tamaño correspondiente a los daños impuesta por la mayoría de los accidentes cerebrovasculares isquémicos humanos.

Carrera Modelado en ratones: Coagulación permanente de la arteria cerebral media Distal

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

modeling-stroke-mice-permanent-coagulation-distal-middle-cerebral

Research

JoVE Journal

Medicine

36.5K vistas.  University Hospital Munich.  Varios modelos murinos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) son ampliamente utilizados en la investigación experimental cerebro. Aquí, nos demuestran el modelo de transcraneal permanente MCAO distal que produce infarto cortical consistente de un tamaño correspondiente a los daños impuesta por la mayoría de los accidentes cerebrovasculares isquémicos humanos. 