We would like to thank the Texas Pierce&#8217;s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.

1. Cell Culture NOTA: Las líneas celulares Homalodisca vitripennis establecidos por el laboratorio del Dr. Wayne Hunter en el Servicio de Investigación Agrícola del USDA (Ft. Pierce, FL EE.UU.) se utilizan para iniciar una acción de laboratorio compuesto por etapas de células mixtas incluyendo fibroblastos y monocapas iniciales. <ol><li> Lleve a cabo los siguientes procedimientos en un entorno de laboratorio estéril mantenido a una temperatura de 20-24 ° C con 25 frascos de cultivo cm 2. </li><li> Cultivar y mantener culturas en 25 cm 2 frascos de cultivo de tejidos utilizando medio H2G + Saltamontes, un modificado medios abeja WH2 10 (Tabla 1). </li><li> Incubar frascos de cultivo a 24 ° C con ~ 53% de humedad. </li><li> Utilice un microscopio invertido con un aumento total de (TM) de 100X para controlar el crecimiento del cultivo, por ejemplo, comprobar si hay cualquier crecimiento celular anormal, monitorear todos los contaminantes potenciales, y comprobar el progreso de crecimiento a través de la callesuperficie tura. </li><li> Realizar un cambio de medio completo (medio de cultivo ~ 4 ml por matraz) cada 7 - 10 días sin perturbar la superficie de cultivo. </li><li> Pase culturas cuando la superficie de cultivo es de aproximadamente 80% cubierto por un crecimiento celular (confluente) usando 0,25% de tripsina que contiene ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para disociar las células. Añadir ~ 2 - 3 ml de tripsina a cada matraz de cultivo y exponer cultivo (s) a la enzima durante períodos cortos de tiempo (5 - 10 min) para lograr la disociación celular completa. </li><li> Añadir una cantidad igual de medio fresco al matraz de cultivo (s) (~ 2 - 3 ml) para detener la actividad enzimática y transferir toda la solución a un tubo cónico para centrifugación. </li><li> Precipitar las células por centrifugación a 4 ° C durante 6 min a 350 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante sin alterar el sedimento celular y añadir ~ 8 ml de medio fresco a cada tubo. Homogeneizar suavemente las células con una pipeta. </li><li> Culturas Split en una relación 1: 2 de 25 cm 2 frascos (~ 4 ml de soluti celularsobre por matraz) y se deja culturas recién pasado en reposo durante 48 horas para permitir que las células en suspensión se adhieran firmemente a la superficie del matraz. NOTA: El cultivo de células de 48 pocillos en placas de cultivo de tejido estériles con una superficie de crecimiento de 1 cm 2 también es posible y que se puede mantener en la misma manera que los frascos de cultivo con una reducción en el volumen de medio de cultivo a ~ 250 l. </li></ol> 2. Extracción Virus Total <ol><li> Homogeneizar cuerpos enteros de virus H. positivo vitripennis en tampón fosfato, pH ~ 7,2, con 0,02% de trihidrato de dietilditiocarbamato de sodio (DETCA) por agitación durante ~ 10 seg intervalos hasta que no haya más grandes masas de tejido presente. Extracto de virus a través de la centrifugación a 124.500 xg supervelocidad durante 4 horas a 4 ° C o 22.000 xg durante 16 horas a 4 ° C. Si se forma un precipitado en la parte superior, retírelo con un algodón estéril 11. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Recoger el precipitado ydisolver con 5 ml de 10 mM de tampón de fosfato (sin DETCA), pH ~ 7,2, que contiene 0,4% de ácido Na-desoxicólico y 4% de éter hexadecil polietilen glicol (Brij 52). <ol><li> Para mezclar bien el sedimento, eliminar el sedimento desde el lado del tubo y aplastar hasta en solución si es necesario. </li><li> Añadir más tampón fosfato 10 mM en ~ incrementos de 5 ml para ayudar a la pastilla entra en solución si es necesario y se combinan en 2 tubos de 11. </li></ol></li><li> Centrifugar la solución a 300 xg durante 15 min 11. </li><li> Eliminar el sobrenadante y pasar la solución a través de un filtro de 0,45 micras, y recoger el filtrado en un tubo de gran colección 11. </li><li> Transferencia de filtrado a una membrana de diálisis con un corte de peso molecular (MWCO) de 3,5 kD, usando pequeñas cantidades de tampón fosfato 10 mM (pH 7) que no contiene DETCA si es necesario 11. </li><li> Coloque la membrana de diálisis en un gran vaso lleno de ddH2O a 4 ° C. Cambie el ddH2O cada hora fo 5 - 6 horas, hasta que se forma un precipitado blanco en la membrana 11. </li><li> Recoger el virus purificado desde dentro de la membrana y someter la solución de virus 100% a una serie de dilución de 10 veces mediante la adición de 10 l de solución a 90 l de ddH 2 O. A continuación añadir 10 l de la dilución para otros 90 l de ddH2O hasta llegar a una dilución de 1: 100.000. </li><li> Solución de virus Conservar a -80 ° C. </li></ol> 3. replicación viral <ol><li> Se siembran las células en placas de cultivo de 48 pocillos y crecen todas las filas hasta que el crecimiento celular es el 80% de confluencia (aproximadamente 72 horas después de pase si las células están creciendo a una tasa promedio). </li><li> Inocular cada fila de células con el virus diluido en serie una vez que el crecimiento celular alcanza la confluencia, es decir, una fila de una dilución 1:10, una fila de una dilución 1: 100, etc, a excepción de la fila superior. Utilice la fila superior como un control y añadir 10 l de ddH2O a cada pocillo como control de volumen. <ol><li> Con el fin de establecer una concentración de células de línea de base de partida para la comparación con los recuentos de células experimentales, disociar y contar el primer pocillo de cada fila antes de la inoculación inicial de cualquier pozos en los cultivos con virus. </li></ol></li><li> Monitorear placas de cultivo cada 24 horas después de la inoculación viral para cualquier cambio de color en el medio que indica un cambio de pH y de cambios en la morfología celular. </li><li> Image una columna de la placa de ensayo en cada punto de tiempo, utilizando un microscopio invertido a 100X TM. </li><li> Retire todo el medio de la columna que se ha proyectado en cada punto de tiempo de 24 horas y almacenarlo a corto plazo a -20 ° C para la extracción de RNA y cuantificación viral o largo plazo a -80 ° C. </li><li> Disociar las células de los pocillos después de retirar el medio como se describió anteriormente en los pasos 1.6 a 1.9, utilizando sólo ~ 250 l de EDTA 0,25% tripsina y medio fresco para detener la actividad enzimática y ~ 250 l de medio fresco para volver a suspender la pelle celulart. </li><li> Añadir 10 l de 0,4% de tripano mancha azul a cada tubo que contiene las células para realizar recuentos de células después de la disociación celular para cada período de 24 horas durante una semana. Permita que la mancha se asiente por 10 minutos antes de realizar el recuento de células. <ol><li> Realizar el recuento de células dentro de 1 h de exposición a manchar o células viables comenzará a la absorción de manchas así como las células no viables. </li></ol></li><li> Agregar lentamente 10 l de la solución de células teñidas a cada lado de un hemocitómetro estándar utilizando una micropipeta. Deje que la solución que se ha tomado por la acción capilar para evitar burbujas de aire. </li><li> Contar el número de células viables (no teñidas) en ambos lados de la hemocitómetro (el equivalente de 4 cargos de las 16 plazas del hemocitómetro). Lleve a cabo el recuento de células de cada pocillo de la columna que se ha quitado. </li><li> La media de los recuentos de células de cada columna y utilizar la siguiente fórmula para obtener el número total de recuento de células: (número medio de células / 4) x factor de dilución = número de células x 10 <sup&gt; 4 ml. Esta es la densidad celular o el número de células viables en el cultivo. </li></ol> 4. Extracción del virus a partir de cultivos celulares <ol><li> Retire H. tratada vitripennis células de los frascos de cultivo como se ha descrito anteriormente en los pasos 1.6 a 1.8, utilizando sólo ~ 250 l de 0,25% EDTA tripsina y medio nuevo para detener la actividad enzimática. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Extracto de virus a partir de células de cultivo siguiendo el protocolo descrito anteriormente en los pasos 2.3 a 2.8. </li></ol> 5. extracción de RNA <ol><li> Extracto de ARN a partir de muestras de medio recogidos durante cada ensayo virus de una semana usando una extracción tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio diseñado para muestras líquidas por el protocolo del fabricante. </li><li> Tienda extrae muestras a -80 ° C. </li></ol> 6. RT-PCR <ol><li> Establecer normas virales para RT-PCR mediante la ejecución de PCR tradicional utilizando elpar de cebadores cebador HoCV RT-PCR 1 (adelante 5&#39;-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 &#39;, 5&#39;-revertir ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3&#39;) con el virus aislado de toda H. cuerpo vitripennis. </li><li> Asunto producto de la PCR a electroforesis en gel durante 60 min a 120 V en un gel de agarosa al 2% que contenía 0,1% de bromuro de etidio. </li><li> Escindir las bandas del gel y se purifica utilizando un kit de extracción de gel según el protocolo del fabricante. </li><li> Piscina todo extirpados y producto de gel purificado y purificar aún más por la precipitación básica etanol. Eluir el producto de precipitación en aproximadamente 30 l de Tris EDTA (TE) para aumentar la concentración total de la muestra. </li><li> Cuantificar el nivel de cDNA en muestras combinadas a través de espectrofotometría usando ajustes de longitud de onda 260/230 para la detección de ácido nucleico. </li><li> Lleve a cabo una serie de diez veces diluciones seriadas de la muestra purificada que van desde 57 ng / l a 57 ag / l (10 -18). Realizar la dilución en serie similar a la descrita in 2.8 con los ajustes realizados para la diferencia en los requisitos de concentración. </li><li> Determinar límites de detección de la serie de dilución mediante la realización de QRT-PCR utilizando un kit de QRT-PCR con una cuantificación fiable de las transcripciones de baja abundancia. NOTA: Las concentraciones virales inferiores a 5 x 10 -3 copias no son detectables. </li><li> Extracto de ARN de las muestras experimentales como se describe anteriormente en el paso 5.1 y cuantificar mediante espectrofotometría. </li><li> Normalizar todas las muestras extraídas a 5 ng / l usando agua libre de nucleasa. </li><li> Realizar qRT-PCR en todas las muestras, en los duplicados, como 25 reacciones mu l usando un kit de qRT-PCR de un solo paso con la capacidad de detectar bajo número de copias de la siguiente manera: 50 ° C para mantener 10 min; 95 ° C suspenso durante 5 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 30 s; fundir 50 a 99 ° C durante 5 segundos en cada paso. <ol><li> Hacer la mezcla maestra para que cada mezcla de reacción contiene 12,5 l de masters de 1xmezcla r, 1,0 l (0,3 M) de cebador directo, 1,0 l (0,3 M) de cebador inverso, 0,25 l de la transcriptasa inversa y cantidades variables de plantilla en base a los valores de normalización. </li><li> Llevar el volumen total de reacción de 25 l con agua libre de RNasa. </li><li> Incluir cinco concentraciones estándar en cada PCR se ejecutan con los siguientes números de copias: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4 y 5 x 10 -2 copias. Establecer el umbral para cada ejecución hasta justo debajo de una fluorescencia de 10x -2,5 para reducir el ruido durante la adquisición temprana en el comienzo de cada ejecución. </li></ol></li></ol> 7. Microscopía Confocal <ol><li> Se cultivan las células Homalodisca vitripennis en unas doce placas que contiene así cubreobjetos de vidrio que miden 18 mm de diámetro en cada pocillo. </li><li> Inocular una columna en la placa de cada 24 h durante un período de cuatro días, una vez se logra una monocapa. Asegúrese de que cada cCOLUMNA contiene también un control, una dilución baja viral (1:10) bien y una dilución viral alta (1: 100.000) también. Utilice soluciones de virus obtenidos en la etapa 2.8. </li><li> Quite todos los medios de comunicación en el quinto día y lavar las células dos veces con 1x PBS (pH 7.4). </li><li> Fijar las células con paraformaldehído al 4% frío a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Añadir 500 l de 1x tampón fosfato salino (PBS) a las células y se lavan durante 10 min a TA en un agitador a baja velocidad. Lavar las células tres veces. </li><li> Añadir 500 l de 0,1% de Triton X-100 a las células para permeabilizar ellos. Deje reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células de nuevo como se describió previamente en el paso 7.5. </li><li> Añadir 500 l de una solución al 5% de albúmina de suero bovino (BSA) para bloquear las células a TA. Deje reposar durante 2 horas y luego retire. </li><li> Diluir de stock rodamina faloidina-rojo conjugado (RCP) 1: 250 en 1X PBS que contenía 5% de BSA y añadir 250 l de la dilución a cada pocillo para manchas para F-actina. </li><li> Placa de cubierta de aluminio faceite para evitar que el tinte de blanqueo e incubar las células a 4 ° CO / N. </li><li> Retire la RCP después de 12 h de incubación y reemplazarlo con 250 l de 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (250 mg / ml) diluido en PBS 1x conteniendo 5% de BSA, para teñir los núcleos de las células . </li><li> Se incuban las células que contienen DAPI a TA durante 1 h. </li><li> Lavar las células tres veces con 1x PBS como se describe anteriormente en el paso 7.5. </li><li> Retire con cuidado los cubreobjetos de los pozos y montar a portaobjetos de microscopio utilizando un medio de montaje con un reactivo anti-fade. </li><li> Deje que los portaobjetos se sequen en lightproof cajas hasta que se observa bajo el microscopio confocal. Ver prepara diapositivas tan pronto como sea posible ya que los tintes pueden desvanecerse rápidamente. </li><li> Image células teñidas utilizando un sistema confocal equipado con un microscopio que contiene una lente de 63X (aceite) plan de apochromate. <ol><li> Establezca las longitudes de onda de láser a 543 ± 10 nm de excitación y 575 ± 10 nm de emisión para Rhoadmine phalloidin-rojo conjucated, Y 369 ± 10 nm de excitación y 450 ± 30 nm de emisión para DAPI. </li><li> Utilice ganancia idéntica y los ajustes establecidos fuera de para el detector para obtener todas las imágenes. </li><li> Procesar imágenes utilizando el software adecuado para el procesamiento de imágenes y la clasificación e importar imágenes deseado en un software de gestión de imágenes. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

El aumento de las preocupaciones en cuanto a la afluencia de especies agrícolas invasivas han llevado a una mayor demanda de nuevas metodologías para la defensa frente a plagas y patógenos emergentes. Un enfoque de la prevención y manejo de la enfermedad consiste en la gestión de vectores de patógenos y era el objetivo principal de este estudio. Economía desempeñan un papel vital en la decisión de producir este tipo de bioplaguicida para manejar vectores de patógenos en la agricultura debido a la aplicación p...

La chicharrita de alas cristalinas (Homalodisca vitripennis Germar 1821) ha sido identificado como el vector predominante de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), el agente causal de la enfermedad de la vid (PD) de Pierce en América del Norte 1. Gestión de la población de insectos se ha convertido rápidamente en el foco de la investigación para combatir esta devastadora problema para la industria de la viticultura en California y en todo el sur de Estados Unidos. Una de sentido positivo, el virus de ARN monocatenario perteneciente a la familia Dicistroviridae, Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) ha sido identificada en H. salvaje poblaciones vitripennis y demostrado que aumenta la mortalidad en las poblaciones 2-4, al tiempo que reduce la resistencia de los insectos a los insecticidas. Desarrollo de métodos para efectivamente trasera infectada H. vitripennis hasta la edad adulta en un entorno de laboratorio han sido difíciles porque <em&gt; H. vitripennis tienen diferentes necesidades nutricionales de una etapa específica que requieren una variedad de plantas huésped 5.8. Instalaciones específicas están obligados a H. vivo trasera vitripennis en los Estados Unidos; Por lo tanto, el cultivo de células es más económico y una alternativa viable, así como cada vez más vital para HoCV-01 de detección y la replicación 2,9. Mientras que los métodos básicos para el establecimiento de cultivos de células de H. vitripennis se describen, estos métodos aún no se han utilizado para la producción comercial de agentes de control biológico, tales como virus 2. El objetivo general de los siguientes procedimientos es producir una alta concentración de HoCV-01 adecuado para la utilización como agente de control biológico. La replicación viral requiere de una célula viva, que es la razón por cultivar con éxito y optimizar H. vitripennis culturas es vital para el progreso de la producción de los niveles rentables de virus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="595">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning&#160;cell culture flasks</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430168</td>
			<td>Surface area 25&#160;cm2, canted neck, cap (plug seal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Inverted microscope and camera</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA &#8226; 4Na per liter of Hanks&#8242; Balanced Salt Solution with phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M8937</td>
			<td>48 wells (TC treated with lid)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">DETCA&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>228680</td>
			<td style="width:167px;">Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning&#160;bottle-top vacuum filter system</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS431206</td>
			<td>Cellulose acetate membrane, pore size 0.45&#160;&#956;m, membrane area 54.5&#160;cm2, filter capacity 500&#160;mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Brij 52</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>388831</td>
			<td>Polyethylene glycol hexadecyl ether</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate buffer solution</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P5244</td>
			<td>Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">TRIzol LS&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A5304</td>
			<td>For electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E7637</td>
			<td>BioReagent, for molecular biology, powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiTect qRT-PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td>204243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148&#160;</td>
			<td>Reagent grade, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PBS&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P5368</td>
			<td style="width:167px;">Phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Rhodamine red-conjugated phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td>R415</td>
			<td>Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM510 Meta Confocal System&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM Zen 2007 Software</td>
			<td style="width:93px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grace&#8217;s Insect medium (supplemented, 1X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G8142</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-histidine monohydrate</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>H8125</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Medium 199 (10X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Medium 1066 (1X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0422</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salts (1X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>51322C</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamine (100X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MEM, amino acid mix (50X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>56419C</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1 M MgCl solution</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pen-Strep (w/ Glutamine)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G6784</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nystatin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>N6261</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>46305</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextrose</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

propagation of homalodisca coagulata virus-01 via homalodisca vitripennis cell culture

La chicharrita de alas cristalinas (Homalodisca vitripennis) es un insecto altamente vagile y polífagas encuentra en todo el suroeste de los Estados Unidos. Estos insectos son los vectores predominantes de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), una bacteria xilema limitado que es el agente causal de la enfermedad de Pierce (PD) de la vid. La enfermedad de Pierce es económicamente perjudicial; Por lo tanto, H. vitripennis se han convertido en un objetivo para las estrategias de manejo de patógenos. Un dicistrovirus identificado como Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) se ha asociado con un aumento de la mortalidad en H. poblaciones vitripennis. Debido a que se requiere una célula huésped para la replicación HoCV-01, cultivo celular proporciona un entorno uniforme para la replicación dirigida que es logísticamente y económicamente valiosa para la producción de biopesticida. En este estudio, un sistema para la propagación a gran escala de H. vitripennis células a través de cultivo de tejidos se desarrolló, providing un mecanismo de replicación viral. HoCV-01 se extrajo de insectos de todo el cuerpo y se usa para inocular H. cultivaron vitripennis células en diferentes niveles. El medio de cultivo se eliminó cada 24 h durante 168 h, ARN extraído y analizado con QRT-PCR. Las células se tiñeron con azul de tripano y se contaron para cuantificar la supervivencia celular usando microscopía de luz. Partículas de virus enteros se extrajeron hasta 96 h después de la infección, que fue el punto de tiempo determinado que antes de producirse el colapso total de cultivo celular. Las células también se sometieron a tinción fluorescente y vistos usando microscopía confocal para investigar la actividad viral en la F-actina apego y núcleos integridad. La conclusión de este estudio es que el H. vitripennis células son capaces de ser cultivadas y se utiliza para la producción en masa de HoCV-01 a un nivel adecuado para permitir la producción de un bioplaguicida.

La unión celular y el crecimiento se observó dentro de las 48 horas de paso en los dos frascos de cultivo de pequeños y grandes, a partir de cultivos primarios y pasajes continuos. Crecimiento y desarrollo de fibroblastos también se observó dentro de este marco de tiempo. Cuando frascos recién sembrados fueron perturbados antes de 48 horas, se produjo una disminución visible en la unión de las células, lo que lleva a las culturas de crecimiento más lento ya veces no sujeción o de crecimiento en absoluto. Las ...

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Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Aquí se presenta un protocolo para propagar células Homalodisca vitripennis y HoCV-1 in vitro. Se retiró el medio de HoCV-1 cultivos positivos y ARN extraído cada 24 h durante 168 horas. Supervivencia celular se cuantificó mediante tinción con azul de tripano. Partículas virales enteras fueron extraídos después de la infección. ARN extraído se cuantificó por QRT-PCR.

Propagación de<em&gt; Homalodisca coagulata virus-01</em&gt; A través de<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cultivo Celular

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

propagation-homalodisca-coagulata-virus-01-via-homalodisca

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

11.6K vistas.  University of Texas at Tyler.  Aquí se presenta un protocolo para propagar células Homalodisca vitripennis y HoCV-1 in vitro. Se retiró el medio de HoCV-1 cultivos positivos y ARN extraído cada 24 h durante 168 horas. Supervivencia celular se cuantificó mediante tinción con azul de tripano. Partículas virales enteras fueron extraídos después de la infección. ARN extraído se cuantificó por QRT-PCR. 

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Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Propagación del virus de la influenza en embrionados de pollo Huevos

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Investigación

Inmunología e Infección

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organoides como Modelo para Enfermedades Infecciosas: Cultura de Derechos Humanos y organoides estomacales murinos y microinyección de Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseosa Ensayo de unión que permite predecir la penetración de fármacos en la tuberculosis lesiones

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

Identificación de mediadores del Receptor de células T de señalización a través de la proyección de las bibliotecas del inhibidor químico

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for understanding the function of bacterial cells in the natural environment. Because of technological advances, various bacterial cell functions can be revealed at the single-cell level inside a confined space. GVs are spherical micro-sized compartments composed of amphiphilic lipid molecules and can hold various materials, including cells. In this study, a single bacterial cell was encapsulated into 10&#8211;30 &#956;m GVs by the droplet transfer method and the GVs containing bacterial cells were immobilized on a supported membrane on a glass substrate. Our method is useful for observing the real-time growth of single bacteria inside GVs. We cultured Escherichia coli (E. coli) cells as a model inside GVs, but this method can be adapted to other cell types. Our method can be used in the science and industrial fields of microbiology, biology, biotechnology, and synthetic biology.

We demonstrate single-cell culture of bacteria inside giant vesicles (GVs). GVs containing bacterial cells were prepared by the droplet transfer method and were immobilized on a supported membrane on a glass substrate for direct observation of bacterial growth. This approach may also be adaptable to other cells.

Cultivo celular bacteriano en el nivel de una sola célula dentro de las vesículas gigantes

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Purificación de preparaciones de vesícula extracelular de alto rendimiento lejos del virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Measurement of Pulse Propagation Velocity, Distensibility and Strain in an Abdominal Aortic Aneurysm Mouse Model

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 times of its original size. Clinical and experimental studies have shown that small aneurysms may rupture, while a subpopulation of large aneurysms may remain stable. Thus, in addition to the measurement of intraluminal diameter of the aorta, knowledge of structural traits of the vessel wall may provide important information to assess the stability of the AAA. Aortic stiffening has recently emerged as a reliable tool to determine early changes in the vascular wall. Pulse propagation velocity (PPV) along with the distensibility and radial strain are highly useful ultrasound-based methods relevant for assessing aortic stiffness. The primary purpose of this protocol is to provide a comprehensive technique for the use of ultrasound imaging system to acquire images and analyze the structural and functional properties of the aorta as determined by MILD, PPV, distensibility and radial strain.

This manuscript describes a detailed protocol for using high frequency ultrasound imaging to measure luminal diameter, pulse propagation velocity, distensibility and radial strain on a mouse model of abdominal aortic aneurysm.

Medición de la velocidad de propagación de pulsos, la distensión y la tensión en un modelo de ratón de aneurisma aórtico abdominal

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 ...

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune system during early development. The Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum) infection model has been well-established in studying host immune response against mycobacterial infection. It has been suggested that different macrophage cell death types will lead to the diverse outcomes of mycobacterial infection. Here we describe a protocol using intravital microscopy to observe macrophage cell death in zebrafish embryos following M. marinum infection. Zebrafish transgenic lines that specifically label macrophages and neutrophils are infected via intramuscular microinjection of fluorescently labeled M. marinum in either the midbrain or the trunk. Infected zebrafish embryos are subsequently mounted on low melting agarose and observed by confocal microscopy in X-Y-Z-T dimensions. Because long-term live imaging requires using low laser power to avoid photobleaching and phototoxicity, a strongly expressing transgenic is highly recommended. This protocol facilitates the visualization of the dynamic processes in vivo, including immune cell migration, host pathogen interaction, and cell death.

This protocol describes a technique for visualizing macrophage behavior and death in embryonic zebrafish during Mycobacterium marinum infection. Steps for the preparation of bacteria, infection of the embryos, and intravital microscopy are included. This technique may be applied to the observation of cellular behavior and death in similar scenarios involving infection or sterile inflammation.

Visualización de la muerte de células líticas de macrófagos durante la infección micobacteriana en embriones de pez cebra a través de la microscopía intravital

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Propagación del parásito microsporidiano Edhazardia aedis en mosquitos Aedes aegypti

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

Investigación de la calcificación de la válvula aórtica a través del aislamiento y cultivo de linfocitos T utilizando células alimentadoras de la capa de Buffy irradiada

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...