La investigación del virus de la hepatitis E se ha visto obstaculizada por la falta de un sistema de cultivo celular eficiente. Nuestras técnicas superan estas limitaciones allanando el camino hacia el diseño de fármacos y el desarrollo de vacunas. Con este protocolo, somos capaces de producir virus infecciosos de alto título de partículas HEV no envolventes y envolventes, facilitando la infección de una variedad de células.
La ejecución de este protocolo requiere acceso a una instalación de BSA-2 y experiencia con técnicas básicas de cultivo celular. Para linealizar el ADN plásmido, mezcle 10 microgramos del ADN de la plantilla con 10 microlitros de tampón y dos microlitros de la enzima de restricción Micrococcus luteus y ajuste el volumen final a 100 microlitros con agua. Luego incubar la solución durante una hora a 37 grados Celsius y confirmar la linealización del plásmido por electroforesis de gel de agarosa de acuerdo con los protocolos estándar.
Después del aislamiento y linealización del ADN plásmido, el éxito de la linealización se puede verificar comparando el ADN plásmido no digerido con el ADN plásmido digerido por electroforesis de gel. Para la transcripción in vitro del ADN del virus E de hepatitis E purificado y de longitud completa, mezcle dos microgramos de la plantilla de ADN linealizado con los reactivos adecuados y utilice agua sin núcleo para llevar el volumen final de la solución a 100 microlitros. Después de una mezcla minuciosa, incubar la solución durante dos horas a 37 grados centígrados.
Después de dos horas, agregue dos microlitros adicionales de ARN polimerasa T7 al tubo. A continuación, mezcle la reacción e incubar el tubo a 37 grados centígrados durante otras dos horas. Al final de la incubación, digiere la plantilla de ADN inicial con 7,5 microlitros de ADN con mezcla exhaustiva e incuba durante 37 grados Centígrados durante 30 minutos.
Después de la extracción, compruebe cuidadosamente la integridad del ARN y el rendimiento por electroforesis de gel de agarosa de acuerdo con los protocolos estándar. En el caso de la baja ANNa abundancy, se deben observar bandas distintas, en lugar de un frotis borroso. Algunos pasos requieren una ejecución rápida y, por lo tanto, una preparación exhaustiva.
Además, preste especial atención a la integridad del ARN y a la viabilidad celular. Para preparar las células cancerosas del hígado humano para la producción de virus de la hepatitis E derivada del cultivo celular, sembrar las células en 20 mililitros de DMEM completo en un plato de cultivo recubierto de colágeno de 15 centímetros e incubar a 37 grados centígrados hasta que alcancen el 90% de confluencia. Al final del cultivo, lavar las células con 10 mililitros de PBS antes de separarlas de la placa de cultivo celular con tres mililitros de 0.05%Trypsin-EDTA a 37 grados Celsius.
Resuspender las células separadas en 10 mililitros de DMEM completo y transferir las células a un tubo cónico de 50 mililitros para el recuento. Transfiera cinco veces 10 a las seis células a un nuevo tubo de 50 mililitros y lave las células dos veces con 35 mililitros de PBS por lavado. Después del segundo lavado, coloque las células sobre hielo sin quitar el sobrenadante.
Para la electroporación de las células diana, suplemento 384 microlitros de citomix con dos ATP milimolar y glutatión de cinco mililitros, posteriormente almacenar en hielo hasta su uso posterior. Sustituya cuidadosamente el sobrenadante por 400 microlitros completos de solución. Añadir cinco microgramos de ARN genómico viral purificado a las células y transferir la suspensión celular a una cubeta de cuatro milímetros para electroporación a 975 microfaradio y 270 voltios durante 20 milisegundos.
Después de la electroporación, utilice una pipeta Pasteur para transferir las células lo más rápido posible a 11 mililitros de DMEM completo y semillas de 10 mililitros de las células electroporadas en un plato de cultivo de 10 centímetros recubierto con colágeno. A continuación, añadir 1,3 veces 10 a las quintas células en 300 microlitros de medio uniformemente en un resbalón de cubierta en un pozo de una placa de 24 microtíteres recubierto de colágeno y colocar el plato y el plato en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas. Al día siguiente, reemplace el sobrenadante en el plato con 10 mililitros de DMEM fresco y devuelva el plato a la incubadora de cultivo celular durante seis días adicionales.
En el día cinco a siete, dependiendo de la densidad celular, realizar la tinción inmunofluorescente del control de transfección para permitir el cálculo del número de células que expresan la proteína diana de interés normalizada al número total de células. La electroporación exitosa puede ser monitoreada por tinción inmunofluorescente del control de transfección. La eficiencia de la transfección debe exceder 40%A de replicación deficiente mutante puede servir como un control negativo para confirmar la especificidad de la tinción.
Para cosechar partículas del virus de la hepatitis E derivadas del cultivo celular extracelular, el día seis, filtre el sobrenadante a través de una malla de 0,45 microlitros para eliminar cualquier residuo celular y almacenar el virus de la hepatitis E derivado del cultivo celular extracelular cosechado a cuatro grados Centígrados. Para la recolección de partículas del virus de la hepatitis E derivada del cultivo de células intracelulares, lave las células con PBS y desasocie las células con 1,5 mililitros de 0,05% de Tripppsin-EDTA a 37 grados centígrados. Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con 8,5 mililitros de DMEM y transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mililitros para centrifugación.
Añadir 1,6 mililitros de DMEM medio completo por electroporación a tubos de reacción individuales de dos mililitros y utilizar 800 microlitros del medio para resuspend las células, transfiriendo así las células a los tubos. Congele las células en nitrógeno líquido y, posteriormente, descongele las células sobre hielo tres veces antes de centrifugar a alta velocidad los lisatos resultantes durante 10 minutos a 10.000 g. A continuación, transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos sin molestar los pellets de desechos celulares durante menos 80 grados centígrados de almacenamiento.
Para evaluar los títulos de las existencias de virus de hepatitis E intra y extracelular de recién producido, se siembra dos veces 10 a las cuatro células por cada 100 microlitros de MEM por pozo en los 60 pozos centrales de una placa de microtíter de 96 pozos recubierta de colágeno y llene los pozos más exteriores con 100 microlitros de PBS por pozo. Después de 24 horas a 37 grados Celsius, agregue 50 microlitros de sobrenadante de partículas de virus extracelulares a la primera fila de células. Después de mezclar a fondo, diluir en serie el contenido del pozo seis veces a una concentración de uno a tres por pozo mediante la transferencia de 50 microlitros de sobrenadantes de la fila anterior a la siguiente de celdas duplicadas hasta la última fila de celdas.
Para infectar las células con partículas del virus de la hepatitis E derivadas del cultivo celular intracelular, agregue 25 microlitros del sobrenadante de partículas del virus intracelular a la fila superior de células y mezcle bien antes de diluir en serie las células seis veces a una proporción de uno a cinco con 25 microlitros de dilución duplicados como se ha demostrado. A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante siete días antes de la tinción inmunofluorescente de acuerdo con el protocolo en el manuscrito. Después de la incubación y la tinción inmunitaria, las placas se pueden analizar mediante microscopía de inmunofluorescencia.
Después de la inmunosuchación, el título final de las partículas intra y extracelulares se puede calcular utilizando la fórmula adecuada como se indica. Después de la infección celular diana con partículas del virus E derivadas del cultivo celular por dilución en serie, se pueden esperar titers entre uno por 10 y tres veces 10 a las seis unidades formadoras de enfoque por mililitro de las partículas de virus E derivadas del cultivo celular no envueltas. En cultivos infectados con partículas de virus de la hepatitis E derivadas del cultivo celular extracelular envueltas, se esperan títulos entre uno por 10 y uno por segundo y uno por 10 al cuarto foco formando unidades por mililitro.
Además, la relación entre las copias del genoma y las partículas de virus infecciosos intracelulares no envueltas es típicamente inferior a la observada para los cultivos infectados por partículas E de cultivo celular extracelular, lo que sugiere una mayor infectividad específica de la especie del virus de la hepatitis E no envuelta. La producción de partículas virales y la infección de células diana requieren un ciclo de vida viral completo, y pueden proporcionar nuevos conocimientos sobre las interacciones virus-huésped. Este protocolo se puede modificar para realizar la cinética de replicación o para producir partículas que se pueden utilizar en ensayos de infección.
La mayor parte de nuestra investigación actualmente depende de partículas infecciosas, tanto en el HEV envuelto como no envuelto. Y los artículos que utilizan nuestras técnicas se están publicando actualmente.
