The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), &#246;gonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsn&#228;mnd f&#246;r synskadade, Synfr&#228;mjandets forskningsfond and St Eriks &#246;gonsjukhus forskningsstipendier.

Este protocolo se realiza de acuerdo con las recomendaciones de la &quot;Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología&quot;. 1. Manipulación del huevo y la recogida de los ojos <ol><li> Almacene los huevos Leghorn blancas a 12-14 ° C durante no más de 1 semana. Si está disponible, utilice un enfriador de vino refrigerada para almacenar los huevos fertilizados. Nota: Las temperaturas más altas del almacén conducen a un desarrollo anormal de los embriones, mientras que las temperaturas más bajas aumenta la mortalidad. Tiempo de almacenamiento extendido aumenta tanto la mortalidad y el desarrollo anormal. </li><li> Incubar los huevos en un 37,5 ° C y 60% humidificado incubadora de huevos con suave balanceo a una frecuencia de 5 veces por 24 horas. </li><li> Retire los huevos incubados de la incubadora de huevos a la edad embrionaria deseado. Nota: La edad del embrión de pollo se determina como el tiempo de incubación y se denota como día embrionario (E) o como etapas (st), De acuerdo con la serie de etapas de desarrollo descritos por Hamburguesa y Hamilton 12. </li><li> Coloque los huevos seleccionados en la campana de flujo laminar. Limpiar la cáscara del huevo con etanol al 70% para evitar la contaminación del embrión. Nota: Llevar a cabo todos los procedimientos en condiciones asépticas con soluciones estériles <url> http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory&quot;lutions </url> e instrumentos. </li><li> Toque en el lado del huevo firmemente contra una superficie dura para abrir una grieta en el huevo. Coloque el contenido en un 100 mm placa de Petri. Use una pequeña cuchara para transferir el embrión a una placa de Petri de 35 mm que contiene precalentado (37 ° C) 1x PBS para evitar que el tejido de secado. </li><li> Coloque la placa de Petri de 35 mm que contiene el tejido embrionario en un microscopio de disección estereoscópica binocular en la campana de flujo laminar. Decapitar el embrión apretando el cuello con unas pinzas finas y descartar el cuerpo. </li><li> Utilice unas pinzas finas para hacer una incisión ªáspera la boca, ventral a la vista. Comenzando en el sitio de la incisión, rasgar el tejido que rodea todo el ojo. Pellizcar el nervio óptico y quitar el ojo intacto de la cuenca del ojo. Recoge tanto el ojo izquierdo y derecho desde el mismo embrión para su uso, ya sea como el control o el ojo tratado. </li><li> Use una cuchara pequeña para transferir los ojos a una nueva placa de Petri de 35 mm que contiene precalentado (37 ° C) 1x PBS. </li></ol> 2. Preparación de toda la retina explantes <ol><li> Utilice unas pinzas finas para retirar todo el tejido alrededor del ojo incluyendo la anlage escleral. Nota: El tejido se separará fácilmente dejando la retina en el cuerpo vítreo y la lente con el epitelio de pigmento intacta (Figura 1A-B). </li><li> Utilice unas pinzas finas pellizcar una pequeña incisión en el epitelio pigmentario en la parte dorsal del ojo sin dañar la retina neural (Figura 1C). </li><li> Utilice unas pinzas finas para arrancar suavemente abra la starti epitelio pigmentariong en el sitio de incisión, dejando la lente y toda la retina unido al cuerpo vítreo (Figura 1D). Mantener el ojo en caliente (37 ° C) 1x PBS para facilitar la eliminación del epitelio pigmentario. Nota: El epitelio de pigmento puede ser difícil de eliminar, en particular, a lo largo del cuerpo ciliar alrededor de la pupila, en la región anterior del ojo, ya lo largo de la fisura coroides. Por lo tanto, algunos de epitelio pigmentario se puede dejar en la retina neural (Figura 1E-F). </li></ol> 3. El tratamiento de toda la retina explantes <ol start="1"><li> Electroporación de explantes de retina enteros Nota: La electroporación de los explantes de retina enteros puede realizarse directamente después de la etapa 2. <ol><li> Preparar medio de cultivo que contiene 1: 1 DMEM: F12 mezcla de nutrientes, 10% de FBS, 10 U / ml de penicilina estreptomicina, 5 mg / ml de insulina, y 2 mM L-glutamina. </li><li> Corte un 1,5 ml desechables cubeta de plástico (12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm) (o cualquier pequeño recipiente capaz de contener la solución de 300-400 l) aproximadamente 8 mm de la parte inferior usando una sierra de hoja fina. </li><li> Diluir el plásmido de ADN de elección en 1xDPBS a una concentración final de 0,1 mg / l. </li><li> Encienda los parámetros electroporador y set de 15 V para ST20 - ST25 (E3-E4) retina y 20 V para ST26 - ST27 (E5) retina. Ajuste los pulsos repeticiones de 5 pulsos de 50 ms de pulso de longitud con intervalos de 1 seg. Utilice un generador de impulsos que puede ser controlado por un pedal en el suelo como se necesitarán ambas manos para sostener los electrodos en su lugar. </li><li> Conecte dos paleta en forma de (, diam circular plana. 4 mm) electrodos de platino (Figura 2A) a la toma de salida del generador de impulsos. Nota: Los electrodos de platino utilizados en este protocolo fueron hechas por el taller de la universidad. Los electrodos fueron hechas de placa de platino de 0,1 mm &quot;rondelles&quot; (grado de platino: 950 Pt / 5 Cu). La conexión de 0,8 mm wire se aisló utilizando un tubo de plástico. </li><li> Transferir cuidadosamente todo el explante de la retina desde el paso 2.3 a la cubeta (o recipiente pequeño equivalente) usando una pipeta Pasteur de polietileno con la punta cortada para adquirir el tamaño adecuado punta de apertura para el explante de la retina. Evite el uso de puntas de pipeta como la retina tiende a unir a la de plástico y desgarrar. </li><li> Utilice una pipeta 100 l para eliminar suavemente todo el 1x PBS que rodea el explante teniendo cuidado de no tocar la retina la retina para evitar que se rompa. </li><li> Añadir solución de plásmido 100 l a la cubeta para cubrir todo el explante de la retina. Presione suavemente el explante de la retina con pinzas si flota a la cima. El uso de fórceps o electrodos de situar el objetivo hacer frente a cualquier un lado de la cubeta y el nervio óptico hasta el fondo de la cubeta. </li><li> Coloque el electrodo positivo en frente de la lente y el electrodo negativo detrás de la retina (Figura 2A), sin tocar el tejido. </li><li>Aplique la corriente presionando el pedal. Compruebe si hay burbujas en los electrodos que indican la descarga con éxito. </li><li> Usar una pipeta de 100 l para eliminar toda la mezcla de plásmido a partir de la cubeta sin dañar la retina. La mezcla de plásmido puede ser reutilizado tres a cinco veces. </li><li> Llenar la cubeta con precalentado (37 ° C) 1x PBS. El uso de fórceps para desprender suavemente el explante de la retina de la pared de la cubeta. Después de la electroporación la retina a veces se cubrió con burbujas, lo que hace que se adhiera a la pared de la cubeta. </li><li> Utilice la pipeta Pasteur de polietileno para transferir todo el explante de la retina en una placa de 24 pocillos que contenía 1 ml precalentado (37 ° C) medio de cultivo por pocillo. Incubar un explante de la retina por pocillo. </li><li> Incubar el explante de la retina a 37 ° C en un agitador rotatorio, con una velocidad constante de 50 rpm, dentro de un incubador de células con 5% de CO 2 durante 24 horas. La rotación es asegurar la máxima exposición al medio y para prevent adherencia de la retina a la parte inferior de la placa de 24 pocillos. </li><li> Continúe con el paso 4. </li></ol></li><li> El tratamiento de los explantes de retina enteras con reactivos químicos Nota: El tratamiento químico de los explantes de retina enteros puede realizarse directamente después de la etapa 2. <ol><li> Preparar medio de cultivo que contiene 1: 1 DMEM: F12 mezcla de nutrientes, 10% de FBS, 10 U / ml de penicilina estreptomicina, 5 mg / ml de insulina, y 2 mM L-glutamina. </li><li> Use una cuchara pequeña para transferir el explante de la retina desde el paso 2.3 en una placa de 24 pocillos que contenía 1 ml precalentado (37 ° C) medio de cultivo por pocillo. Incubar un explante de la retina por pocillo. </li><li> Incubar toda la retina explante durante 60 min a 37 ° C en un agitador rotatorio, con una velocidad constante de 50 rpm, dentro de un incubador de células con 5% de CO 2 antes de añadir un reactivo químico o vehículo. </li><li> Preparar la solución química, por ejemplo Cdk1 / 2 inhibidor III, un inhibidor de la progresión de la fase M-13, en una finalconcentración de 30 mM en DMSO. </li><li> Retire la placa de 24 pocillos, que contiene todo el explante de la retina, de la incubadora celular. Añadir 10 l de reactivo químico o el vehículo (DMSO) directamente al medio de la retina, resultando en una concentración final de 300 nM Cdk1 / 2 inhibidor III en 0,01% de DMSO. Girar manualmente la placa de 24 pocillos para permitir una distribución uniforme del reactivo químico o vehículo en la solución. </li><li> Incubar los explantes de retina a 37 ° C en un agitador rotatorio, con una velocidad constante de 50 rpm, dentro de un incubador con 5% de CO 2 durante el tiempo deseado (hasta 24 h). </li><li> Continúe con el paso 4. </li></ol></li></ol> 4. Fijación y Congelación de Whole Retina Eexplants <ol><li> Retire la placa de 24 pocillos que contiene el explante de la retina entera tratada de la incubadora celular. </li><li> Use una cuchara pequeña para transferir el explante de la retina a una placa de 24 pocillos que contienen 1 ml / pocillo helada paraformaldehído al 4% en 1xPBS. Incubate en hielo durante 15 min. </li><li> Use una cuchara pequeña para transferir todo el explante de la retina a una placa de 24 pocillos que contienen 1 ml / pocillo 1xPBS frío de hielo para lavar la retina. Incubar en hielo durante 10 min. </li><li> Use una cuchara pequeña para transferir todo el explante de la retina a una placa de 24 pocillos que contienen 1 ml / pocillo frío hielo sacarosa 30% en 1xPBS. Incubar en hielo durante 1-3 hr dependiendo del día embrionario de la retina. Para ST20 - ST25 (E3) retinas, se incuban durante 1 hora, retinas mayores necesitan más tiempo de incubación en sacarosa. </li><li> Use una cuchara pequeña para transferir todo el explante de la retina sobre una película de parafina con un contenido medio de montaje de aproximadamente 500 l de congelación criostato. Retire la mayor cantidad de sacarosa posible moviendo suavemente el explante de la retina en el medio de congelación utilizando la cuchara pequeña. </li><li> Transferir el explante de la retina a un molde de inclusión que contiene medio de congelación. Coloque el ojo para facilitar la futura seccionamiento. Ponga el molde de inclusión que contiene todo el explante de la retina en dry hielo hasta que el medio se congela sólido. Almacenar a -80 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Method. 24, 43-48 (2001).</li><li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+patterns+and+targets+of+dA1+interneurons+in+the+chick+hindbrain.">Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain.</a> J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).</li><li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina.">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+commitment+and+differentiation+in+explants+of+embryonic+rat+neural+retina.+Comparison+with+the+developmental+potential+of+dissociated+retina.">Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina.</a> Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+hairy+and+Enhancer+of+split+homolog+1+regulates+differentiation+of+retinal+neurons+and+is+essential+for+eye+morphogenesis.">Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis.</a> Neuro. 16, 723-734 (1996).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+explant+culture+of+the+embryonic+chicken+retina+with+long-term+preservation+of+photoreceptors.">Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors.</a> Exp eye re. 93, 556-564 (2011).</li><li>Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogenic+final+cell+cycle+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+regulated+by+the+DNA+damage+response+pathway.">The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway.</a> Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).</li><li>Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terminal+basal+mitosis+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+sensitive+to+cisplatin-induced+cell+cycle+arrest.">The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest.</a> Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).</li><li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis.">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

En este trabajo se presenta un protocolo detallado para la disección, la electroporación o tratamiento químico, y el cultivo de los explantes enteros retina de embriones de pollo. Este protocolo es fácil, rápido y permite tanto una alta tasa de éxito y reproducible resultados. Electroporación de explantes de retina enteros produce grandes áreas de células que expresan el constructo de gen de interés. Es fácil de colocar correctamente los electrodos y para expone...

La retina es parte del sistema nervioso central y es, con su relativa simplicidad y la arquitectura celular bien caracterizada, un modelo popular para estudiar el desarrollo del sistema nervioso central. El ojo del embrión de pollo es relativamente grande en comparación con el resto del embrión. Por tanto, es de fácil acceso en ovo de manipulaciones experimentales, tales como inyecciones o electroporación, y sirve como una excelente herramienta para adquirir conocimientos sobre las células de la retina y la biología del desarrollo in vivo. A pesar de estas ventajas importantes, la supervivencia de los embriones puede ser baja cuando los experimentos son invasivas como con electroporaciones, inyecciones repetidas, o manipulaciones experimentales combinados. La electroporación de plásmidos de ADN en el embrión de pollo in ovo es un importante y bien establecida técnica 1. Permite para el etiquetado de las neuronas, la localización del destino celular, así como tractos neuronales en el centro de nervous sistema y permite ectópico expresión génica para analizar la función de proteínas in vivo. La técnica ha sido utilizada para los estudios de tubo neural 2, hindbrain 3, 4 y la retina. Electroporación de retina embrionaria in ovo tiene algunas dificultades experimentales que están relacionados con la situación in vivo. La posición del ojo, debido a la plegado craneal del embrión, es relativamente cerca del corazón. Esta proximidad aumenta el riesgo de un paro cardíaco después de la electroporación, y el riesgo aumenta con la edad del embrión. Por otra parte, para acceder al ojo, es necesario abrir las membranas embrionarias, aumentando así el riesgo de sangrado, malformaciones y posterior viabilidad reducida. Al probar y optimizar un nuevo plásmido de ADN a menudo sin un resultado fenotípico conocido, estas limitaciones pueden disminuir la eficacia y el poder del método incluso para un experimentalista experimentado. Tal como se presenta en este protocolo, la cultura de la wexplante agujero retinal, que se define como a toda la retina neural con el epitelio de pigmento eliminado, es un método eficaz que complementa el enfoque en ovo. Inyecciones intraoculares de reactivos químicos son relativamente fáciles de realizar in ovo. Sin embargo, la concentración eficaz y exacta de los reactivos inyectados dentro de la retina neural puede ser difícil de controlar totalmente. El volumen inyectado puede variar debido a las fugas y el sitio exacto de la inyección puede afectar tanto a la distribución del reactivo dentro del ojo y de la difusión a través del cuerpo vítreo. La variabilidad tendrá importantes implicaciones para la interpretación de los resultados cuando es decir, se determina una curva dosis-respuesta para un inhibidor de la enzima; particularmente si el efecto es pequeño y la ventana temporal del efecto es estrecho. Por otra parte, un solo ojo puede ser utilizado de cada embrión cuando se realiza en experimentos in ovo debido a los posibles efectos sistémicos a través del torrente sanguíneosobre el ojo contralateral. Coincidente edad es importante a la hora de estudiar el desarrollo y la variabilidad individual entre tratados y los embriones de control pueden conducir a la variabilidad experimental adicional. Por estas razones, un ex ovo método basado en explantes de retina de embriones de pollo fue desarrollado, en el que la retina neural puede ser expuesto a un uniforme y controlada condición experimental in vitro. El presente protocolo fue desarrollado en base a protocolos anteriores 5-9. Explantes de retina de la etapa (st) 20 (días embrionarias [E] 3) a ST31 (E7) embriones de pollo fueron disecados, culta y electroporación con una concentración de ADN plásmido definido o expuestos a un medio que contiene una concentración definida de un reactivo químico. El protocolo que aquí se presenta ha sido implementado con éxito en publicaciones recientes, utilizando varios reactivos químicos diferentes, incluyendo los reguladores de la vía de daño en el ADN, como KU55933, SB 218078 y NSC 109555 ditosylate, y el ciclo celular, tal como Cdk1 / 2 inhibidor III 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="859">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1xPBS (tablet)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>18912-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10xDPBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14080-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL disposable plastic cuvette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8495V01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D7039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-1998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Solveco</td>
			<td>1054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/2 inhibitor III</td>
			<td>217714</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300nM in 0.01% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Platina, custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro square porator ECM 830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>0108-5-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium NEG50</td>
			<td>Cellab, Sweden</td>
			<td>6502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP expressing DNA plasmid (pZGs)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany</td>
			<td>8204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium ProLong Gold with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1214P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way embedding mold&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphoHistone 3 (PH3)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td>Dilution 1/4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum electrodes (custom made from &#34;rondelles&#34;)</td>
			<td>Sargenta</td>
			<td>390-R (rondeller)</td>
			<td>Dia: 4mm, 0.1 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platimun electrodes&#160;</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY700P4L</td>
			<td>Dia: 4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-2853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spoon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>231-2151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>443815S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Leghorn eggs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Local supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wine cooler</td>
			<td>WineMaster 24, Caso, Berlin Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments

La retina es un buen modelo para el sistema nervioso central en desarrollo. El gran tamaño del ojo y lo más importante la accesibilidad para las manipulaciones experimentales en ovo / in vivo hace que el pollo retina embrionaria un modelo experimental versátil y muy eficiente. Aunque la retina de pollo es fácil dirigirse in ovo mediante inyecciones intraoculares o la electroporación, la concentración eficaz y exacta de los reactivos dentro de la retina puede ser difícil de controlar completamente. Esto puede ser debido a las variaciones de la zona de inyección exacta, la fuga desde el ojo o desigual difusión de las sustancias. Además, la frecuencia de malformaciones y mortalidad después de manipulaciones invasivos tales como la electroporación es bastante alta. Este protocolo describe un ex ovo técnica para el cultivo de explantes de retina enteros a partir de embriones de pollo y proporciona un método para la exposición controlada de la retina a los reactivos. El protocol describe cómo diseccionar, experimentalmente manipular y explantes de cultivo enteros de la retina a partir de embriones de pollo. Los explantes pueden cultivarse durante aproximadamente 24 h, y ser sometidos a diferentes manipulaciones tales como la electroporación. Las principales ventajas son que el experimento no es dependiente de la supervivencia del embrión y que la concentración del reactivo introducido se puede variar y controlado con el fin de determinar y optimizar la concentración efectiva. Además, la técnica es rápida, barata y junto con su alta tasa de éxito experimental, se asegura reproducible resultados. Cabe destacar que sirve como un excelente complemento para los experimentos realizados in ovo.

Este protocolo describe la preparación (Figura 1A-F) y el cultivo de los explantes de retina enteros a partir de embriones de pollo. Este protocolo se ha usado con éxito para explantes de retina a partir de embriones enteros de ST20 (E3) a ST31 (E7). La electroporación de plásmidos de ADN en explantes de retina enteros permite para el etiquetado y el rastreo de las células progenitoras de la retina o sobre-expresión de diferentes productos génicos. Para los experiment...

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Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Este protocolo describe un método para diseccionar, experimentalmente manipular y explantes de cultivo completo de la retina a partir de embriones de pollo. Los cultivos de explantes son útiles cuando alta tasa de éxito, la eficacia y reproducibilidad son necesarios para probar los efectos de plásmidos para la electroporación y / o sustancias de reactivos, es decir, inhibidores enzimáticos.

Los explantes de retina enteras de pollo embriones para Tratamientos electroporación y Reactivos Químicos

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K vistas.  Uppsala University.  Este protocolo describe un método para diseccionar, experimentalmente manipular y explantes de cultivo completo de la retina a partir de embriones de pollo. Los cultivos de explantes son útiles cuando alta tasa de éxito, la eficacia y reproducibilidad son necesarios para probar los efectos de plásmidos para la electroporación y / o sustancias de reactivos, es decir, inhibidores enzimáticos. 

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Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Cultura de embriones de ratón explantes cocleares y Gene Transfer por electroporación

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, fluid and nutrient supply). Consequently both the nervous and vascular systems develop alongside each other and share striking similarities in their branching architecture. Here we report embryonic manipulations that allow us to study the simultaneous development of neural crest-derived nervous tissue (in this case the enteric nervous system), and the vascular system. This is achieved by generating chicken chimeras via transplantation of discrete segments of the neural tube, and associated neural crest, combined with vascular DiI injection in the same embryo. Our method uses transgenic chickGFP embryos for intraspecies grafting, making the transplant technique more powerful than the classical quail-chick interspecies grafting protocol used with great effect since the 1970s. ChickGFP-chick intraspecies grafting facilitates imaging of transplanted cells and their projections in intact tissues, and eliminates any potential bias in cell development linked to species differences. This method takes full advantage of the ease of access of the avian embryo (compared with other vertebrate embryos) to study the co-development of the enteric nervous system and the vascular system.

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Here we report dual labeling of neural crest cells and blood vessels using chickGFP neural tube intraspecies grafting combined with intra-vascular DiI injection. This experimental technique allows us to simultaneously visualize and study development of the NCC-derived (enteric) nervous system and the vascular system, during organogenesis.

Etiquetado Dual De Las Células De La Cresta Neural Y Los Vasos Sanguíneos Dentro De Los Embriones De Pollo Usando ChickGFP Injerto De Tubo Neural Y Carbocianina Tinte DiI Inyección

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de<em&gt; En Ovo</em&gt; Micro-electroporación

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de Células vivas imágenes de microscopía multifotónica

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that the chicken embryo is an effective research model for studying basic biological functions of auditory system development. More recently, the chicken embryo has become particularly valuable in studying gene expression, regulation and function associated with hearing. In ovo electroporation can be used to target auditory brainstem regions responsible for highly specialized auditory functions. These regions include the chicken nucleus magnocellularis (NM) and nucleus laminaris (NL). NM and NL neurons arise from distinct precursors of rhombomeres 5 and 6 (R5/R6). Here, we present in ovo electroporation of plasmid-encoded genes to study gene-related properties in these regions. We show a method for spatial and temporal control of gene expression that promote either gain or loss of functional phenotypes. By targeting auditory neural progenitor regions associated with R5/R6, we show plasmid transfection in NM and NL. Temporal regulation of gene expression can be achieved by adopting a tet-on vector system. This is a drug inducible procedure that expresses the genes of interest in the presence of doxycycline (Dox). The in ovo electroporation technique &#8211; together with either biochemical, pharmacological, and or in vivo functional assays &#8211; provides an innovative approach to study auditory neuron development and associated pathophysiological phenomena.

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditory brainstem neurons of avians and mammals are specialized for fast neural encoding, a fundamental process for normal hearing functions. These neurons arise from distinct precursors of embryonic hindbrain. We present techniques utilizing electroporation to express genes in the hindbrain of chicken embryos to study gene function during auditory development.

En Ovo electroporación en el tronco encefálico auditivo del pollo

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

Expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en embriones aviares utilizando la electroporación de ARNm

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

Aislamiento y diferenciación de los mioblastos primarios de los explantes musculares esqueléticos de ratón

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...