Los autores reconocen Ryan Chaplin y el Dr. Gregg Rentfrow de la Universidad de Kentucky Meats Lab y el Departamento de Ciencia Animal y de alimentos para proporcionar oportunidades para recoger tejidos experimentales utilizadas en este documento.

Los procedimientos utilizados en este estudio no requieren la aprobación de la Universidad de Kentucky Cuidado de Animales y el empleo Comisión porque no se utilizaron animales vivos. Antes de la recolección de cualquier muestra utilizada en este documento, todos los animales fueron aturdidos con perno cautivo y se desangraron. Esto se llevó a cabo en una instalación de matadero inspección federal en la Universidad de Kentucky. Un representante oficial de la Seguridad e Inspección de los Alimentos del USDA observó todas las actividades que se ocupan de los animales vivos y la manipulación de la canal. 1 Preparación de Instrumentación <ol><li> Para minimizar la cantidad de tiempo entre las colecciones de muestras de tejido para el inicio de un experimento, fije el equipo y preparar tampones antes de recoger el tejido experimental (o si el personal adicionales están disponibles, estas tareas pueden ocurrir simultáneamente). NOTA: Esto no sólo proporciona la mayor cantidad de tiempo que el tejido permanece viable para llevar a cabo experimentos, pero algunosexperimentos pueden correr durante largos períodos de tiempo (o si hay un deseo de completar múltiples experimentos en un día), por lo tanto, suele ser conveniente empezar tan pronto como sea posible. </li><li> Encienda el ordenador asociado, equipos adquisiciones de datos, baño de agua (para el tampón (s)) y myograph unidad (s). Coloque el equipo de calibración en la unidad (s) myograph y encienda el calor myograph (predefinido a 37,5 ° C) y permitir que las unidades y equipos de calibración para calentar para preestablecer las temperaturas. <ol><li> Abra un archivo de configuración de software gráfico creado anteriormente en el equipo y empezar una carrera (pero no la adquisición de datos). </li></ol></li><li> Caliente el equipo durante 10 minutos. <ol><li> Iniciar la adquisición de datos. </li><li> Cero todos los canales. </li><li> Compruebe, y llevar a cabo la calibración (si es necesario) en cada canal (4 canales por multimyograph) para estandarizar la señal eléctrica suministrada desde el transductor de fuerza respectiva asociada a ese canal a una fuerza de 2 g suministrada por un peso certificado. </li><li> Una vez completados calibración y una conversión de unidades, almacenar todos los datos posteriores como gramos. Cambie en consecuencia sobre la base de los deseos de cada laboratorio independiente; el equipo y el software permiten el uso de otras unidades, tales como miliNewtons y voltios. </li></ol></li><li> Asegúrese de que las líneas de gas están libres de obstrucciones y abra el suministro de gas (95% O 2/5% CO 2) a Myograph (s) unidades. Gas continuamente todos los tampones (en las cámaras Myograph) durante todo el procedimiento. </li><li> Rellene todas las cámaras Myograph con etanol al 70% y en remojo durante 10 minutos, retirar el etanol, y repita para un segundo 10 minutos en remojo. <ol><li> Tras eliminación del etanol, enjuáguese la boca tres veces con agua desionizada, seguido de tres lavados con tampón preparada (vea la Sección 2 para la preparación de buffer), dejando la tercera adición de tampón en las cámaras. NOTA: En este punto, el equipo puede permanecer inactivo en este estado hasta que se preparan búfer y el tejido y el personal está listo para proceder con los experiment. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de tampones <ol><li> Preparar una solución tampón de 1 L de Krebs-Henseleit para su uso en el transporte y procesamiento de muestras de tejido para alcanzar concentraciones finales de 11,1 mM de D-glucosa; 1.2 mM MgSO4; 1.2 mM KH 2 PO 4; KCl 4,7 mM; NaCl 118,1 mM; 3,4 mM CaCl 2; 24,9 mM NaHCO3. <ol><li> Mezclar 9,6 g de sales de Krebs en aproximadamente 900 ml de agua desionizada sobre una placa de agitación. </li><li> Mezclar en 0,373 g de cloruro de calcio deshidratado seguido de 2,1 g de bicarbonato de sodio por litro de tampón deseado. </li><li> Gas solución tampón durante 20 minutos con 95% de O2 / 5% de CO 2. </li><li> Después de gasificación, ajustar el pH a 7,05 (filtración de tampón aumenta el pH; pH objetivo final debe ser 7.4) y ajustar el volumen de 1 L. </li><li> Filtrar esterilizar tampón en una botella y almacén intermedio de medios 1 L autoclave limpio a 4 ° C hasta que esté listo para su uso. </li></ol></li><li> Preparar separada Krebs-Hsolución tampón enseleit para su uso en experimentos Myograph como se describe en el paso 2.1 para el transporte tampón de Krebs-Henseleit con compuestos adicionales que se refieren a los experimentos de la contractilidad. NOTA: Por lo general 2 L será suficiente para los experimentos descritos en este artículo, pero puede necesitar este volumen para aumentar o disminuir según la duración del experimento, el número de cámaras Myograph y reemplazos de amortiguamiento número (en relación con las adiciones de tratamiento). <ol><li> Antes de la etapa de gasificación (paso 2.1.3), añadir 9,1 mg (por L de tampón está preparado) de desipramina-HCl para amortiguar. </li><li> Preparar una solución de propranolol-HCl 1,0 M y añadir 1 ml (por L de tampón está preparado) de esta solución a la solución de tampón de Krebs-Henseleit. Hacer este tampón el día de uso y mantener a temperaturas Myograph operativo (una temperatura que produce una temperatura de 37,5 ° C en el myograph). NOTA: La desipramina se añade para inhibir los mecanismos selectivos de la recaptación de aminas biógenasy permitir la limpieza de adiciones experimentales de la memoria intermedia de baño de los vasos sanguíneos que se produzca más rápidamente. La adición de propranolol evita que la unión no específica de compuestos de tratamiento para β-adrenérgicos receptores. </li></ol></li></ol> 3. Recogida y preparación de la vasculatura <ol><li> Tan pronto como sea posible, retire el tracto gastrointestinal de la canal. Una vez que el animal ya no exhibe ningún reflejo involuntario, quitar la cabeza y ocultar y levante la carcasa verticalmente. La eliminación de las vísceras gastrointestinal (esófago hasta el ano) de la canal debe ser completado por el personal de matadero autorizado (&lt;20 min de tiempo de aturdimiento). NOTA: ¿Qué tan pronto, es generalmente limitada por la ubicación / instalación donde ésta se obtiene el tracto intestinal desde y procedimientos operativos estándar o procedimientos por mandato federal, seguidos por los personal de la instalación. <ol><li> En la mayoría de instalaciones, llevar a cabo manipulaciones del tracto gastrointestinalen un lugar separado de la transformación de la canal que está destinado a entrar en el suministro de alimentos. Utilice las inmediaciones conveniente que el tracto gastrointestinal se puede tomar y hacia fuera para su examen. </li></ol></li><li> Una vez que el tracto gastrointestinal se extendió a cabo, identificar el intestino delgado, el pliegue ileocecal que conecta el intestino delgado al intestino ciego, y la brida que se extiende ileal proximal al pliegue ileocecal (Figura 1A). <ol><li> Usando un bisturí o cuchillo, muy ligeramente hacer una incisión en la membrana mesentérica en el centro de la brida ileal. El uso de dos dedos índices, sin rodeos diseccionar la grasa y el tejido conectivo exponer la vasculatura mesentérica (Figura 1B). </li></ol></li><li> De esta brida o protuberancia en el mesenterio intestinal, diseccionar múltiples ramas (~ 2 cm de longitud) de los haces de la arteria y la vena mesentérica expuestos que apoyan esta porción del íleon (Figura 1C). <ol><li> Si ucantar unas pinzas para agarrar el tejido, tenga cuidado de no captar directa o tirar de los vasos sanguíneos en absoluto, mientras que la eliminación de ellos como cualquier tipo de estiramiento puede dañar y afectar negativamente el rendimiento de tejido 14. Eliminación de los vasos sanguíneos se realiza mejor, cortando a través de cada extremo de la sección que ser eliminado y luego cortar junto o en paralelo a la sección de ahora aislado. Para facilitar, eliminar parte del tejido circundante, junto con los vasos para proporcionar un poco de tejido para captar con un par de fórceps. </li><li> Con un par de pinzas, sumerja muestra de tejido en un tubo que contiene hielo frío tampón de Krebs-Henseleit y almacenar en hielo hasta el procesamiento puede ocurrir en el laboratorio. </li></ol></li><li> Coloque la muestra de tejido sobre una superficie de corte o en una placa de Petri y sumerja parcialmente en hielo frío de Krebs-Henseleit. <ol><li> Utilizando # 5 joyeros fórceps, tijeras iris Noyes, y de aumento de la lámpara o la disección de alcance (2,5 a magnificación 5.0X es suficiente), diseccionar cuidadosamente lejos la connecti grasa y rodeacinco tejidos y separar la arteria y la vena. La identificación de la abertura del recipiente en un extremo de la sección y comprender cuidadosamente la fascia que rodea el recipiente con los fórceps. </li><li> Hacer un corte con las tijeras paralela al recipiente deslizando la punta de la tijera debajo de la fascia elevada. Después de la incisión inicial, la grasa y los tejidos conectivos se pueden separar más lejos de la embarcación mediante la reducción de cada lado con las tijeras. Asegúrese de que los vasos son tan limpias como sea posible y reducir al mínimo la cantidad de tiempo que los buques pasan en el banquillo. </li><li> Volver vasos sanguíneos para tubos de fresco tampón de Krebs-Henseleit y se almacenan a 4 ° C (muestras pueden permanecer almacenado durante un máximo de 24 horas después de la recolección y todavía producir datos válidos de la contractilidad). </li><li> Utilizando una hoja de afeitar, buque rebanada que se utilizará en myograph en número deseado de secciones de 2 mm (que es útil usar una máquina de cortar el tejido para obtener secciones transversales consistentes). </li><li> Examine cada sección bajo un sco de disecciónpe (ampliación 12.5X) para asegurar que cada sección tiene ninguna anormalidad, ramas, válvulas, o daños superficiales inadvertidamente hecho durante la disección y la limpieza. Reemplazar la sección de recipiente de si hay alguna anormalidad, rama, válvula, o daño superficial. </li></ol></li><li> Secciones Tienda aceptables rodajas de buques (sumergidos en tampón Krebs-Henseleit) en hielo oa 4 ° C hasta que esté listo para el montaje en cámaras Myograph (generalmente &lt;30 min). </li><li> Montar suavemente el recipiente en la myograph mediante la inserción de los soportes a través del lumen y aumentar la tensión (utilizando el microposicionador en el myograph) teniendo cuidado de no estirar los vasos por encima de un 2 a 3 g lectura. </li><li> Una vez que todas las cámaras están cubiertos, aspire el búfer de todas las cámaras y vuelva a llenar con 5,0 ml de tampón y se iniciará un temporizador de 15 minutos para comenzar el período de equilibrio y el experimento. </li></ol> 4. Experimento <ol><li> Equilibrar todas las secciones de los vasos durante 1,5 horas para lograr una res establesting tensión de 1,0 g. <ol><li> Vuelva a colocar el tampón de incubación Krebs-Henseleit cada 15 min. </li><li> Durante el equilibrado, constantemente ajustar la tensión en las secciones de los vasos sanguíneos hasta 2 g y se deja relajar hasta aproximadamente 0,80 g. Trate de no permitir que los vasos se relajen demasiado (que pueden salirse de las monturas). Trate de lograr una tensión de línea de base estable, donde el buque tiene 1 g de tensión sin necesidad de ajuste. </li></ol></li><li> Durante el equilibrado, preparar una solución acuosa 1,32 M de KCl para ser utilizado como una referencia. </li><li> Tras la finalización de un equilibrio satisfactorio, añadir 500 l de la solución de KCl 1,32 M para dar lugar a una solución 0,12 M en la solución de 5,5 ml de bañar el recipiente. <ol><li> Después de la adición de la M KCl 1,32, no ajustar la tensión manualmente como la respuesta máxima de esta adición se utiliza para evaluar la viabilidad del tejido y se puede utilizar para normalizar los datos de tratamiento (por ejemplo, las respuestas a una concentración de ungonist). </li><li> Vuelva a colocar la memoria intermedia en intervalos de 15 minutos hasta que la tensión ha vuelto al valor basal de 1,0 g. </li></ol></li><li> Una vez que se alcanza la línea de base, cambiar el tampón y comenzar simultáneamente un temporizador de 1 min. Haga esto para todas las cámaras al mismo tiempo para evitar un escalonamiento de las horas de inicio. <ol><li> Vortex el estándar que se añade y preparar un comentario para cámara 1 durante la cuenta regresiva 1 min. </li><li> Añadir las normas en 25 ml de alícuotas a cada cámara como los dictados del experimento (esto mantiene el tratamiento por debajo del 0,5% del volumen total). </li><li> Cuando se ha añadido la última norma, iniciar un temporizador 9 min. </li><li> Al final de la incubación estándar de 9 min, eliminar el tampón que contiene el tratamiento de las cámaras y añadir 5,0 ml de tampón fresco, e iniciar el temporizador de 2,5 min. </li><li> Repita el paso 4.4.4. </li><li> Al final del segundo enjuague 2,5 minutos, aspirar las cámaras y añadir tampón nuevo, y comenzar un temporizador de 1 minuto la cuenta atrás del inicio de la segundad adición estándar. </li></ol></li><li> Continuar este ciclo para todos adiciones estándar del día. </li><li> Durante la adición norma final y la posterior incubación 9 min preparar el compuesto de referencia M KCl 1,32 para una final de la adición de dosis de referencia de ejecución de 500 l. </li><li> Tras el intervalo de 1 min después de la adición tratamiento final, añadir el KCl y iniciar un temporizador 9 min. NOTA: La adición de KCl es para confirmar la viabilidad del tejido a la conclusión del experimento y es útil si la administración de un tratamiento que resulta en respuesta insignificante. </li><li> Al concluir el 9 min de incubación compuesto de referencia final, aspire o eliminar el tampón de todas las cámaras. No añadir tampón fresco. Concluir el experimento. </li><li> Guarde el archivo gráfico, eliminar secciones de los vasos sanguíneos y disponer de forma adecuada, y seguir el protocolo de limpieza (proporcionado por el fabricante y pueden ser específicas de laboratorio) para el equipo myograph. </li></ol>

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La mención de su nombre comercial, producto patentado, o equipo especificado no constituye una garantía o garantía por el USDA y no implica la aprobación de la exclusión de otros productos que pueden estar disponibles.

El desafío inicial en el desarrollo de este bioensayo fue el establecimiento de un punto de recogida repetible para la vasculatura mesentérica. Consistencia sitio de la muestra es crítica, ya que algunas de las funciones del cambio del intestino delgado durante la progresión desde el yeyuno a través del íleon y en consecuencia el mesenterio varían en un patrón similar. Las ramas ileales de la arteria mesentérica y la vena son los más fácilmente identificados a través de puntos de referencia anatómicos. Al u...

Las alteraciones en el flujo de sangre a un lecho de tejido pueden tener un gran impacto en la función del órgano. Una función principal del intestino delgado es la absorción de nutrientes. Se requiere el flujo de sangre arterial a la superficie de absorción del intestino para absorción aumenta y el flujo sanguíneo de nutrientes para ayudar en la absorción de nutrientes como la digesta se mueve a lo largo de la superficie 1. Una disminución en el flujo sanguíneo puede causar una reducción en la absorción de nutrientes debido a una disminución en el gradiente transepitelial 2. Además de los nutrientes, el intestino delgado también puede estar expuesto a metabolitos secundarios, drogas o toxinas que ejercen un efecto sobre el flujo de sangre localizada en el mesenterio. En el caso de que el animal rumiante, los compuestos pueden ser liberados de un pienso (por ejemplo, nutrientes tales como aminoácidos, o toxinas tales como alcaloides del cornezuelo del centeno) a través de procesos fermentativos del intestino anterior. Si estos compuestos sobreviven el metabolismo microbiano de la fermentación ruminal, que ahora están disponibles para la absorcióno la interacción a medida que viajan a través del tracto gastrointestinal del animal. Hay un número de diferentes métodos disponibles para medir el flujo sanguíneo in vivo (por ejemplo, el ultrasonido Doppler, medidores de flujo de sangre mora, microesferas radiomarcadas, y técnicas de indicador de dilución) que permiten la evaluación de diversos escenarios o tratamientos experimentales. Sin embargo, para obtener información con respecto a las propiedades mecánicas o farmacológicas de músculo liso vascular, los métodos fueron limitadas a los grandes buques hasta Mulvany y Halpern 3 publicaron un artículo que describe una técnica que utiliza alambre montado preparaciones anillo vascular en un myograph. Desde el desarrollo de esta técnica, las modificaciones se siguen realizando a los sistemas Myograph asociados que permiten una variedad de aplicaciones diferentes para la evaluación de las estructuras tubulares. El sistema también se ha adaptado para utilizar varillas fijas para el montaje de los buques más grandes 4, donde la perfusióntécnicas no son deseados. Debido a diferencias en los vasos de diferentes orígenes anatómicos y distinciones en los mismos buques de diferentes especies de animales, datos de buque y tipo de animal no puede ser fácilmente extrapolado a través de diferentes embarcaciones o el mismo recipiente en diferentes tipos de animales 5. En consecuencia, los bioensayos separados deben ser desarrollados y validados en cualquier momento se cambian estos aspectos. Recientemente, varios bioensayos se han desarrollado con estas tecnologías para el uso en el ganado lateral vena safena derecha y la arteria y la vena ruminal 6,7. Este bioensayo se desarrolló para investigar específicamente los efectos que tienen los alcaloides del ergot en la vasculatura de soporte del intestino delgado. Se informó de que el 50-60% de alcaloides alimentados aparece en el contenido del abomaso, pero sólo el 5% se recuperó en las heces 8. Strickland et al. 9 declaró en una revisión de los alcaloides del cornezuelo de centeno, que PV datos disponiblesest que el intestino delgado puede ser el sitio más importante para la absorción Ergopeptine. Eckert et al. 10 aspectos biofarmacéuticos crítica de alcaloides del cornezuelo de centeno y afirmaron que una vez que cruzan la barrera epitelial, alcaloides del cornezuelo de centeno se transporten, bien por el sistema linfático a la vena subclavia o por medio de la vena mesentérica y en la sangre portal. Rhodes et al. 11 reportó una disminución del flujo sanguíneo hacia el duodeno y el colon en novillos que consumen una (alta de alcaloides del cornezuelo de centeno) dieta alta endofito infectadas. Usando el bioensayo de la arteria y la vena ruminal derecho, Foote et al. 12 demostraron que los alcaloides del ergot son vasoactivos en la vasculatura ruminal. Foote et al. 13 posteriormente demostraron in vivo que la exposición a los alcaloides del cornezuelo de centeno ruminal resultados en un rumen disminución del flujo sanguíneo epitelial. Esta disminución en el flujo sanguíneo a la superficie de absorción del rumen de forma concomitante causó una reducción en nutrientes (ácidos grasos volátiles) de flujo. Dada la quantity de alcaloides del cornezuelo de centeno que pasan en el intestino delgado del intestino anterior; se planteó la hipótesis de que se produzca un efecto similar en la pequeña vasculatura intestinal y la absorción de nutrientes. Esto requirió el desarrollo de la bioensayo arteria mesentérica y vena ileal proximal bovina.

<table><tbody><tr><td>Multi Myograph</td><td>Danish Myo Technologies</td><td>610M</td><td>A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Powerlab 8/sp</td><td>ADIntruments</td><td>ML785</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 7</td><td>ADInstruments</td><td>Version 7</td><td></td></tr><tr><td>Force Calibration Kit</td><td>Danish Myo Technologies</td><td>100055</td><td>Specific to DMT myographs</td></tr><tr><td>Bottle-top Filter</td><td>Nalgene</td><td>595-4520</td><td>0.22 &amp;#956;m pore size; 45 mm neck size</td></tr><tr><td>#5 Jewler&amp;rsquo;s Forceps</td><td>Miltex</td><td>555008FT</td><td>Any brand of forceps can be used</td></tr><tr><td>Noyes Iris Scissors</td><td>Miltex</td><td>18-1510</td><td>Any brand of scissors can be used</td></tr><tr><td>Dissecting Scope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Any brand of dissecting light microscope will suffice</td></tr><tr><td>Adjustable Tissue Matrice</td><td>Braintree Scientific</td><td>TM C12</td><td>This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly</td></tr><tr><td>Krebs-Hensleit Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3753-10x1L</td><td>It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house</td></tr><tr><td>Calcium chloride dehydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Desipramine-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3900-5G</td><td></td></tr><tr><td>Propranolol-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0884-1G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Scott Gross</td><td>UN3156</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating and using sections of bovine mesenteric artery and vein as a bioassay to test for vasoactivity in the small intestine

Sistemas digestivo de los mamíferos están constantemente expuestos a compuestos (deseables e indeseables) que pueden tener un efecto sobre el flujo de sangre hacia y desde ese sistema. Los cambios en el flujo de sangre al intestino delgado puede resultar en efectos en las funciones de absorción del órgano. Especial interés en las toxinas liberadas de los piensos a través de procesos fermentativos y digestivos en rumiantes ha desarrollado como un área donde las eficiencias productivas se podrían mejorar. El vídeo asociado con este artículo se describe un bioensayo in vitro desarrollado para seleccionar compuestos para vasoactividad en aislados secciones transversales de la arteria mesentérica bovina y la vena utilizando un multimyograph. Una vez que los vasos sanguíneos se montan y se equilibraron en el myograph, el propio bioensayo se puede utilizar: como una herramienta de detección para evaluar la respuesta contráctil o vasoactividad de compuestos de interés; determinar la presencia de tipos de receptores por la orientación farmacológicamente receptores con agonista específicos; determinar el papel de un receptor con la presencia de uno o más antagonistas; o determinar las posibles interacciones de los compuestos de interés con los antagonistas. A través de todo esto, se recogen datos en tiempo real, el tejido recogido de un solo animal puede ser expuesto a un gran número de diferentes tratamientos experimentales (una ventaja in vitro), y representa la vasculatura a cada lado de la cama capilar para proporcionar una precisa imagen de lo que podría estar sucediendo en la aferente y eferente suministro de sangre apoyar el intestino delgado.

Los vasos sanguíneos que se usa para generar los resultados incluidos se obtuvieron de 6 novillos Holstein (425 ± 8 kg) dentro de un intervalo de 3 semanas. Un ejemplo de un típico mesentérica respuesta contráctil a KCl vena y adiciones crecientes de tratamiento en la concentración se presenta en la Figura 2. La magnitud de la respuesta variará algunos con el tamaño de la embarcación (correlacionada con el tamaño del animal donante), pero puede también ser influido (negativamente) por un mane...

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Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

El intestino delgado se expone frecuentemente a las toxinas que pueden influir en el flujo sanguíneo y afectar negativamente a la absorción de nutrientes. El uso de una arteria multimyograph y mesentérica y la vena aislados, compuestos o toxinas de interés puede ser examinado para vasoactividad.

El aislamiento y uso de las Secciones de bovino mesentérica arteria y la vena como un bioensayo para la Prueba de Vasoactividad en el intestino delgado

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

isolating-using-sections-bovine-mesenteric-artery-vein-as-bioassay-to

Research

JoVE Journal

Medicine

9.7K vistas.  USDA-Agricultural Research Service.  El intestino delgado se expone frecuentemente a las toxinas que pueden influir en el flujo sanguíneo y afectar negativamente a la absorción de nutrientes. El uso de una arteria multimyograph y mesentérica y la vena aislados, compuestos o toxinas de interés puede ser examinado para vasoactividad. 

Video: Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between 100-400 &mu;m in diameter function primarily in directing blood flow to various organs according to the overall requirements of the body. The rat mesenteric artery has a diameter greater than 100 &mu;m. The myography technique, first described by Mulvay and Halpern1, was based on the method proposed by Bevan and Osher2. The technique provides information about small vessels under isometric conditions, where substantial shortening of the muscle preparation is prevented. Since force production and sensitivity of vessels to different agonists is dependent on the extent of stretch, according to active tension-length relation, it is essential to conduct contraction studies under isometric conditions to prevent compliance of the mounting wires. Stainless steel wires are preferred to tungsten wires because of oxidation of the latter, which affects recorded responses3.The technique allows for the comparison of agonist-induced contractions of mounted vessels to obtain evidence for normal function of vascular smooth muscle cell receptors.
We have shown in several studies that isolated mesenteric arteries that are contracted with phenylyephrine relax upon addition of cumulative concentrations of extracellular calcium (Ca2+e). The findings led us to conclude that perivascular sensory nerves, which express the G protein-coupled Ca2+-sensing receptor (CaR), mediate this vasorelaxation response. Using an automated wire myography method, we show here that mesenteric arteries from Wistar, Dahl salt-sensitive(DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats respond differently to Ca2+e. Tissues from Wistar rats showed higher Ca2+-sensitivity compared to those from DR and DS. Reduced CaR expression in mesenteric arteries from DS rats correlates with reduced Ca2+e-induced relaxation of isolated, pre-contracted arteries. The data suggest that the CaR is required for relaxation of mesenteric arteries under increased adrenergic tone, as occurs in hypertension, and indicate an inherent defect in the CaR signaling pathway in Dahl animals, which is much more severe in DS.
The method is useful in determining vascular reactivity ex vivo in mesenteric resistance arteries and similar small blood vessels and comparisons between different agonists and/or antagonists can be easily and consistently assessed side-by-side6,7,8.

An automated myography method for force measurements in isolated mesenteric arteries is described. It employs a Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A to determine responses to phenylephrine and extracellular calcium. The method allows consistent determination of isometric responses to agonists in small vessels of diameters of 60 - 300 &mu;m, independently.

Contracción de la arteria mesentérica y Estudios de relajación con miografía cable automático

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Investigación

Medicina

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

Evaluar Miogénica Respuesta y Vasoactividad En arterias mesentéricas Resistencia Usando Miografía Presión

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying tissue compartments, restricting the transport of smaller molecules across the epithelium and almost completely prohibiting epithelial macromolecular transport. This selectivity is determined by the mucous gel layer, which limits the transport of lipophilic molecules and both the apical receptors and tight junctional protein complexes of the epithelium. In vitro cell culture models of the epithelium are convenient, but as a model, they lack the complexity of interactions between the microbiota, mucous-gel, epithelium and immune system. On the other hand, in vivo assessment of intestinal absorption or permeability may be performed, but these assays measure overall gastrointestinal absorption, with no indication of site specificity. Ex vivo permeability assays using &#34;intestinal sacs&#34; are a rapid and sensitive method of measuring either overall intestinal integrity or comparative transport of a specific molecule, with the added advantage of intestinal site specificity. Here we describe the preparation of intestinal sacs for permeability studies and the calculation of the apparent permeability (Papp) of a molecule across the intestinal barrier. This technique may be used as a method of assessing drug absorption, or to examine regional epithelial barrier dysfunction in animal models of gastrointestinal disease.

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or "intestinal sacs" as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.

Ex Vivo intestinal Sacs para evaluar la permeabilidad de la mucosa en modelos de enfermedad gastrointestinal

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rata mesenterio ensayo angiogénesis

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Biología

Targeting the Rat's Small Bowel: Long-Term Infusion into the Superior Mesenteric Artery

The superior mesenteric artery can be cannulated in humans through minimally invasive radiological catheterization of the femoral or axillary artery. SMA cannulation is more difficult in rats due to small anatomical dimensions. The aim of the study is to describe a surgical technique for cannulation of the SMA in rats to perform long-term infusion of drugs into the SMA vascular bed in unrestricted animals, which will result in a high rate of catheter patency after the post surgical recovery for 24 hours. 
To avoid the risk of SMA thrombosis or bleeding from direct access, a proximal branch of the SMA is isolated, ligated distally and cannulated with a 0.25 mm polyurethane capillary tube whose tip is advanced close to the origin of the SMA from the aorta. The cannula is then tunnelled subcutaneously to the back of the animal's neck and through the skin via an artificial valve. The external portion of the cannula is inserted in a semi-rigid support system and connected to the continuous infusion pump outside the cage where the rat is free to move. 
Correct positioning of the cannula was demonstrated by post-surgical angiography and autopsy findings. Catheter patency after 24 hours of saline infusion into the SMA region was assured in most rats by the total discharge of the pump and recognition of a functional cannula for blood sampling or saline infusion.

Access for long-term infusion in the superior mesenteric artery (SMA) of rats is a surgical procedure that consists of cannulation of a proximal branch of the SMA. The cannula exits from the abdominal wound and is tunneled through the subcutaneous space back to the interscapular fold.

Dirigido al intestino delgado de la rata: infusión a largo plazo en la arteria mesentérica superior

The superior mesenteric artery can be cannulated in humans through minimally invasive radiological catheterization of the femoral or axillary artery. SMA ...

Bioingeniería

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

Evaluación de mecanismos de Control Vascular utilizando microscopia Video de arterias de resistencia aislada de ratas

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Exploración del músculo liso arterial KV7 función del canal de potasio mediante electrofisiología Patch Clamp y miografía presión

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Invasive Hemodynamic Characterization of the Portal-hypertensive Syndrome in Cirrhotic Rats

This is a detailed protocol describing invasive hemodynamic measurements in cirrhotic rats for the characterization of portal hypertensive syndrome. Portal hypertension (PHT) due to cirrhosis is responsible for the most severe complications in patients with liver disease. The full picture of the portal hypertensive syndrome is characterized by increased portal pressure (PP) due to the increased intrahepatic vascular resistance (IHVR), hyperdynamic circulation, and increased splanchnic blood flow. Progressive splanchnic arterial vasodilation and increased cardiac output with elevated heart rate (HR) but low arterial pressure characterizes the portal hypertensive syndrome.
Novel therapies are currently being developed that aim to decrease PP by either targeting IHVR or increased splanchnic blood flow &#8212; but side effects on systemic hemodynamics may occur. Thus, a detailed characterization of portal venous, splanchnic, and systemic hemodynamic parameters, including measurement of PP, portal venous blood flow (PVBF), mesenteric arterial blood flow, mean arterial pressure (MAP), and HR is needed for preclinical evaluation of the efficacy of novel treatments for PHT. Our video article provides the reader with a structured protocol for performing invasive hemodynamic measurements in cirrhotic rats. In particular, we describe the catheterization of the femoral artery and the portal vein via an ileocolic vein and the measurement of portal venous and splanchnic blood flow via perivascular Doppler-ultrasound flow probes. Representative results of different rat models of PHT are shown.

Here we describe a detailed protocol for invasive measurements of hemodynamic parameters including portal pressure, splanchnic blood flow, and systemic hemodynamics in order to characterize the portal hypertensive syndrome in rats.

Caracterización hemodinámica invasiva del síndrome de hipertensión Portal en cirróticos ratas

This is a detailed protocol describing invasive hemodynamic measurements in cirrhotic rats for the characterization of portal hypertensive syndrome. ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Pressure myograph systems are exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized to a suitable transmural pressure. The near physiological condition achieved in pressure myography permits in-depth characterization of intrinsic responses to pharmacological and physiological stimuli, which can be extrapolated to the in vivo behavior of the vascular bed. Pressure myograph has several advantages over conventional wire myographs. For example, smaller resistance vessels can be studied at tightly controlled and physiologically relevant intraluminal pressures. Here, we study the ability of 3rd order mesenteric arteries (3-4 mm long), preconstricted with phenylephrine, to vaso-relax in response to acetylcholine. Mesenteric arteries are mounted on two cannulas connected to a pressurized and sealed system that is maintained at constant pressure of 60 mmHg. The lumen and outer diameter of the vessel are continuously recorded using a video camera, allowing real time quantification of the vasoconstriction and vasorelaxation in response to phenylephrine and acetylcholine, respectively.
	To demonstrate the applicability of pressure myography to study the etiology of cardiovascular disease, we assessed endothelium-dependent vascular function in a murine model of systemic hypertension. Mice deficient in the &alpha;1 subunit of soluble guanylate cyclase (sGC&alpha;1-/-) are hypertensive when on a 129S6 (S6) background (sGC&alpha;1-/-S6) but not when on a C57BL/6 (B6) background (sGC&alpha;1-/-B6). Using pressure myography, we demonstrate that sGC&alpha;1-deficiency results in impaired endothelium-dependent vasorelaxation. The vascular dysfunction is more pronounced in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice, likely contributing to the higher blood pressure in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice. 
	Pressure myography is a relatively simple, but sensitive and mechanistically useful technique that can be used to assess the effect of various stimuli on vascular contraction and relaxation, thereby augmenting our insight into the mechanisms underlying cardiovascular disease.

In pressure myography, an intact small segment of a vessel is mounted onto two small cannulas and pressurized to a suitable luminal pressure. Here, we describe the method to measure vasorelaxation response of the mouse 3rd order mesenteric arteries in c57 and sGC&alpha;1-/- mice using pressure myography.

La evaluación de la resistencia murino Función Arterial Utilizando miografía Presión

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusión Técnica de investigar Reglamento de Microvessel Permeabilidad en Rata Mesenterio

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...