Name: isolating and using sections of bovine mesenteric artery and vein as a bioassay to test for vasoactivity in the small intestine
Uploaded: 2014-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine at JoVE.com

Os autores reconhecem Ryan Chaplin e Dr. Gregg Rentfrow da Universidade de Kentucky Meats Lab e do Departamento de Animal e Ciências da Alimentação de proporcionar oportunidades para coletar tecidos experimentais aqui utilizados.

Os procedimentos utilizados neste estudo não necessitam de aprovação da Universidade de Kentucky Animal Care e do Comitê Use porque há animais vivos foram usados. Antes da coleta de uma amostra aqui utilizada, todos os animais foram atordoados com um parafuso prisioneiro e sangrar. Este foi realizado em um abatedouro inspecionado pelo governo federal, da Universidade de Kentucky. Um representante oficial do USDA Food Safety Inspection Service e observado todas as atividades que lidavam com o animal vivo e manuseio da carcaça. 1 Preparação de Instrumentação <ol><li> Para minimizar a quantidade de tempo entre as colheitas das amostras de tecido para o início de uma experiência, montaram equipamentos e preparar tampões antes da recolha de tecidos experimental (ou, se o pessoal adicionais estão disponíveis, estas tarefas podem ocorrer simultaneamente). NOTA: Isto não só fornece a maior quantidade de tempo que o tecido permanece viável a realização de experiências, mas algunsexperimentos podem funcionar por longos períodos de tempo (ou há um desejo de completar várias experiências em um dia), portanto, é geralmente desejável para começar o mais cedo possível. </li><li> Ligue o computador associado, aquisições de dados de equipamentos, banho de água (para tampão (s)) e myograph unidade (s). Coloque o equipamento de calibração na unidade (s) myograph e ligue calor myograph (predefinido para 37,5 ° C) e deixe as unidades e equipamentos de calibração para aquecer para programar temperaturas. <ol><li> Abra um arquivo de configurações de software Chart previamente criado no computador e começar a correr (mas não a aquisição de dados). </li></ol></li><li> Aqueça o equipamento durante 10 minutos. <ol><li> Comece a aquisição de dados. </li><li> Zero todos os canais. </li><li> Verifique, e realizar a calibração (se necessário) em cada canal (4 canais por multimyograph) para padronizar o sinal elétrico fornecido a partir do transdutor de força respectivo associado a esse canal para uma força de 2 g fornecido por um peso certificado. </li><li> Após a calibração e uma conversão de unidades sejam concluídas, armazenar todos os dados subsequentes como gramas. Mudar de acordo com base em desejos de cada laboratório separado; o equipamento e software de permitir a utilização de outras unidades, tais como milinewtons e volts. </li></ol></li><li> Certifique-se de que as linhas de gás são livre de bloqueios e ligue fornecimento de gás (95% de O2 / 5% CO 2) para myograph (s) unidades. Continuamente gás Os tampões (nas câmaras myograph) durante todo o procedimento. </li><li> Preencha todas as câmaras myograph com etanol 70% e deixe de molho por 10 minutos, remover o etanol, e repita para uma segunda 10 min de molho. <ol><li> Após a remoção do etanol, enxaguar três vezes com água desionizada, seguido por três lavagens com tampão preparado (ver secção 2 para a preparação de tampão), deixando a terceira adição de tampão nas câmaras. NOTA: Neste ponto, o equipamento pode permanecer ociosa nesse estado até tampão e tecido são preparados e equipe está pronta para prosseguir com os experiment. </li></ol></li></ol> 2 Preparação de Buffers <ol><li> Prepara-se uma solução tampão de 1 L de solução de Krebs-Henseleit para o uso no transporte e processamento de amostras de tecidos, para atingir concentrações finais de 11,1 mM de D-glicose; 1,2 mM MgSO4; 1,2 mM de KH 2 PO 4; KCl 4,7 mM; NaCl 118,1 mM; 3,4 mM CaCl2; 24,9 mM de NaHCO 3. <ol><li> Misture 9,6 g de sais de Krebs em aproximadamente 900 ml de água desionizada sobre uma placa de agitação. </li><li> Misturar 0,373 g de cloreto de cálcio di-hidratado, seguido por bicarbonato de sódio a 2,1 g por L de solução tampão pretendida. </li><li> Solução tampão de gás durante 20 minutos com 95% O2 / 5% de CO 2. </li><li> Depois de gaseamento, ajustar o pH para 7,05 (filtração de tampão aumenta o pH; pH meta final deve ser 7,4) e ajustar o volume a 1 L. </li><li> Filtrar esterilizar tampão para um tampão de armazenamento de garrafas e limpo autoclavado 1 L mídia a 4 ° C até que esteja pronto para uso. </li></ol></li><li> Prepare separada de Krebs-Hsolução tampão enseleit para utilização em experiências myograph como descrito no passo 2.1 para o transporte de tampão de Krebs-Henseleit com compostos adicionais que se referem às experiências de contractilidade. NOTA: 2 L Tipicamente será suficiente para experiências descritas neste artigo, mas este volume pode necessitar de ser aumentada ou reduzida com base na duração da experiência, o número de câmaras myograph, e substituições de tampão (em relação ao número de adições de tratamento). <ol><li> Antes do passo de gaseificação (passo 2.1.3), adicionar 9,1 mg (por L de solução tampão a ser preparado) da desipramina-HCl para tamponar. </li><li> Prepara-se uma solução de propranolol-HCl 1,0 uM e adicionar 1 ml (por L de solução tampão a ser preparado) desta solução para a solução tampão de Krebs-Henseleit. Faça este tampão no dia da utilização e mantenha a temperaturas myograph operando (uma temperatura que produz uma temperatura de 37,5 ° C no myograph). NOTA: A desipramina é adicionado para inibir os mecanismos selectivos da recaptação de aminas biogênicase permitir a compensação de acréscimos experimentais do buffer que banham os vasos sanguíneos a ocorrer mais rapidamente. A adição de propranolol impede a ligação não específica de compostos de tratamento para β-adrenérgicos. </li></ol></li></ol> 3 Coleta e Preparação da vasculatura <ol><li> Tão rapidamente quanto possível, remover o tracto gastrointestinal a partir da carcaça. Uma vez que o animal não apresenta qualquer reflexo involuntário, retire a cabeça e esconder e, em seguida, levantar a carcaça verticalmente. A remoção das vísceras gastrointestinal (esôfago até o ânus) na carcaça deve ser concluído até o pessoal de matadouros aprovados (&lt;20 min de tempo de atordoamento). NOTA: Em quanto tempo, é geralmente limitada pela localização / instalação onde o trato intestinal está sendo coletado e de procedimentos operacionais padrão ou procedimentos mandato federal seguidos pelos funcionários do local. <ol><li> Na maioria das instalações, realizar manipulações do tracto gastrintestinal, num local distinto do tratamento da carcaça que está destinado a entrar na cadeia alimentar. Use uma localização próxima conveniente, onde o trato gastrointestinal podem ser tomadas e espalhar-se para o exame. </li></ol></li><li> Uma vez que o tracto gastrointestinal é espalhado, identificar o intestino delgado, a dobra de ligação ileocecal do intestino delgado ao ceco, e estendendo-se o flange do íleo proximal à prega ileocecal (Figura 1A). <ol><li> Usando um bisturi ou uma faca, muito levemente fazer uma incisão na membrana mesentérica no centro da flange ileal. Usando dois dedos indicadores, sem rodeios dissecar longe do tecido adiposo e conjuntivo expondo a vasculatura mesentérica (Figura 1B). </li></ol></li><li> Deste flange ou protuberância no mesentério intestinal, dissecar vários ramos (~ 2 cm de comprimento) dos feixes de artéria e veia mesentérica expostos que suportam esta parte do íleo (Figura 1C). <ol><li> Se ucantar uma pinça para agarrar tecido, tome cuidado para não captar diretamente ou puxe os vasos sanguíneos em tudo, removendo-os como qualquer tipo de alongamento pode causar danos e afetar negativamente o desempenho do tecido 14. Remoção do vaso sanguíneo é melhor realizado, por corte ao longo de cada extremidade da secção a ser removida e, em seguida, o corte ao longo ou paralelamente à secção agora isolado. Para maior facilidade, remova uma parte do tecido circundante, juntamente com os vasos para fornecer algum tecido para agarrar com um par de fórceps. </li><li> Com um par de fórceps, submergir amostra de tecido num tubo contendo tampão frio de Krebs-Henseleit gelada e armazenar em gelo até que o tratamento pode ocorrer no laboratório. </li></ol></li><li> Colocar a amostra de tecido sobre uma superfície de corte ou de uma placa de petri e submergir parcialmente em gelo frio de Krebs-Henseleit. <ol><li> Usando # 5 joalheiros fórceps, Noyes íris tesoura e ampliação lâmpada ou dissecar escopo (2,5 a ampliação 5.0X é suficiente), dissecar cuidadosamente afastado o connecti gordura e envolventeve tecidos e separar a artéria e veia. Identificando a abertura vaso em uma extremidade da secção e cuidadosamente compreender a fáscia em torno do vaso, com a pinça. </li><li> Fazer um corte com a tesoura paralela ao recipiente fazendo deslizar a ponta da tesoura por baixo da fáscia levantada. Após a incisão inicial, a gordura e os tecidos conjuntivos podem ser ainda isolada a partir do recipiente através da redução com um ou outro lado da tesoura. Certifique-se de que os vasos são tão limpas quanto possível, minimizando a quantidade de tempo que os navios passam no banco. </li><li> Voltar vasos sanguíneos para tubos de tampão Krebs-Henseleit fresco e armazenar a 4 ° C (amostras podem permanecer armazenadas por até 24 horas após a coleta e ainda produzir dados de contratilidade válidos). </li><li> Usando uma lâmina de barbear, vaso fatia a ser utilizado em myograph em número desejado de secções de 2 mm (isto é útil para usar um fatiador de tecidos para se obter secções transversais consistentes). </li><li> Examine cada seção em uma sco de dissecaçãope (ampliação 12,5X) para garantir que cada seção tem nenhuma anormalidade, ramos, válvulas ou dano superficial, inadvertidamente, feito durante a dissecção e limpeza. Substituir seção do navio, se houver qualquer anormalidade, filial, válvula, ou dano superficial. </li></ol></li><li> Armazenar aceitáveis ​​secções cortadas dos vasos submersos (em tampão de Krebs-Henseleit) em gelo ou a 4 ° C até pronto para montagem em câmaras myograph (geralmente &lt;30 minutos). </li><li> Suavemente montar o recipiente na myograph inserindo os suportes através do lúmen e aumentar a tensão (usando o microposicionador na myograph) tendo o cuidado de não esticar os navios acima de uma leitura de 2 a 3 g. </li><li> Uma vez que todas as câmaras são cobertos, aspirar o tampão de todas as câmaras e reabastecer com 5,0 ml de tampão e iniciar um temporizador de 15 minutos para começar o período de equilíbrio e experiência. </li></ol> 4. Experiment <ol><li> Equilibrar todas as seções da embarcação durante 1,5 horas para conseguir uma res estáveisting tensão de 1,0 g. <ol><li> Substituir o tampão de incubação Krebs-Henseleit a cada 15 min. </li><li> Durante o equilíbrio, ajustar constantemente a tensão nas seções dos vasos sanguíneos até 2 g e deixa-se relaxar para baixo para cerca de 0,80 g. Tente não permitir que os navios para relaxar demais (eles podem escorregar as montagens). Tente alcançar um linha de base estável da tensão, quando o recipiente contém 1 g de tensão sem a necessidade de ajustamento. </li></ol></li><li> Durante o equilíbrio, preparar uma solução aquosa 1,32 M de KCl para ser utilizado como uma referência. </li><li> Após a conclusão de um equilíbrio satisfatório, adicionar 500 mL de solução 1,32 M de KCl para se obter uma solução 0,12 M em 5,5 ml da solução que banha o navio. <ol><li> Após a adição de 1,32 M de KCl, não ajustar manualmente a tensão como a resposta máxima a partir desta adição é usada para avaliar a viabilidade do tecido e pode ser usado para normalizar os dados de tratamento (por exemplo, respostas a uma concentração de umgonist). </li><li> Substituir o tampão em 15 minutos de intervalo até que a tensão voltou ao valor inicial de 1,0 g. </li></ol></li><li> Depois da linha de base é atingido, mudar o tampão e, simultaneamente, iniciar um temporizador de um minuto. Faça isso para todas as câmaras em simultâneo para evitar um escalonamento de horários de início. <ol><li> Vortex o padrão a ser adicionado e preparar um comentário a câmara 1 durante a 1 min de contagem regressiva. </li><li> Adicionar as normas em 25 mL alíquotas de cada uma das câmaras, como os ditames experimentais (isto mantém o tratamento abaixo de 0,5% do volume total). </li><li> Quando foi adicionado o último padrão, comece a 9 min timer. </li><li> No final da incubação de 9 min padrão, remover o tampão contendo o tratamento das câmaras e adicionar 5,0 ml de tampão fresco, e iniciar o temporizador de 2,5 min. </li><li> Repita o passo 4.4.4. </li><li> No final da segunda lavagem 2.5 min, as câmaras de vácuo e adicionar tampão fresco, e inicia um temporizador de um minuto a contagem regressiva do início da Second adição de padrão. </li></ol></li><li> Continuar este ciclo para todos adições padrão do dia. </li><li> Durante a adição de padrão final e posterior 9 min de incubação preparar o composto de referência 1,32 M KCl para o fim da adição de dose de referência prazo de 500 mL. </li><li> Após o intervalo de 1 min após a adição de tratamento final, adicione o KCl e começar a 9 min timer. NOTA: A adição de KCl é confirmar a viabilidade do tecido na conclusão do experimento e é útil se a administração de um tratamento que resulta em resposta insignificante. </li><li> Ao final da incubação composto referência final 9 min, aspirar ou remover o tampão de todas as câmaras. Não adicione uma solução tampão nova. Concluir o experimento. </li><li> Salvar arquivo gráfico, remover seções dos vasos sanguíneos, e descartar adequadamente e siga o protocolo de limpeza (fornecido pelo fabricante e pode ser específico de laboratório) para equipamentos myograph. </li></ol>

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Menção do nome comercial, produto patenteado, ou equipamento especificado, não constitui uma garantia ou garantia pelo USDA e não implica a aprovação para a exclusão de outros produtos que podem estar disponíveis.

O desafio inicial no desenvolvimento deste bioensaio foi a criação de um local de coleta repetível para a vasculatura mesentérica. Consistência sítio da amostra é crítico, como algumas das funções do intestino pequeno, a mudança durante a progressão através do jejuno e do íleo, por conseguinte, o mesentério variar segundo um padrão semelhante. Os ramos ileais da artéria mesentérica e veia foram os mais facilmente identificados através de marcos anatômicos. Ao localizar o ceco e seguindo a dobra ileoc...

Alterações no fluxo sanguíneo para uma cama de tecido pode ter um grande impacto sobre a função do órgão. Uma função primária do intestino delgado é a absorção de nutrientes. O fluxo de sangue arterial para a superfície de absorção do intestino é necessária para a absorção de nutrientes e aumentar o fluxo sanguíneo para ajudar a absorção de nutrientes como digesta se move ao longo da superfície 1. A diminuição do fluxo de sangue pode causar uma redução na absorção de nutrientes devido a uma diminuição do gradiente transepitelial 2. Em adição aos nutrientes, o intestino delgado, podem também ser expostos a metabolitos secundários, drogas, toxinas ou que exercem um efeito sobre o fluxo sanguíneo localizado no mesentério. No caso de o animal ruminante, os compostos podem ser libertados a partir de um ingrediente alimentar (por exemplo, nutrientes, tais como aminoácidos, ou toxinas, tais como os alcalóides da cravagem do centeio) por meio de processos de fermentação do intestino anterior. Se estes compostos sobreviver ao metabolismo microbiano de fermentação ruminal, eles estão agora disponíveis para a absorçãoou interacção enquanto viajam através do tracto gastrointestinal do animal. Há um número de métodos diferentes disponíveis para medir o fluxo de sangue, in vivo (por exemplo, ultra-som Doppler, residindo medidores de fluxo de sangue, microesferas radiomarcados, e técnicas de diluição-indicador) que permitem a avaliação de vários cenários ou tratamentos experimentais. No entanto, para obter informações sobre as propriedades mecânicas ou farmacológicas do músculo liso vascular, métodos permaneceu limitado a navios de grande porte até Mulvany e Halpern 3 publicou um artigo descrevendo uma técnica usando o fio montado preparações anel vascular em um myograph. Desde o desenvolvimento da técnica, modificações continuam a ser feitos para os sistemas myograph associados que permitem uma variedade de aplicações diferentes, para avaliação de estruturas tubulares. O sistema também foi adaptado para utilizar hastes fixas para montagem de navios de maior porte 4, onde a perfusãotécnicas não são desejados. Por causa de diferenças nos vasos de diferentes origens anatômicas e distinções nas mesmas embarcações de diferentes espécies de animais, dados da embarcação e tipo de animais não podem ser facilmente extrapolados em diferentes recipientes ou na mesma embarcação em diferentes tipos de animais 5. Consequentemente, bioensaios separadas devem ser desenvolvidos e validados a qualquer momento estes aspectos são alterados. Recentemente, vários bioensaios foram realizados com estas tecnologias para uso em bovinos laterais da veia safena e artéria e veia ruminal 6,7. Este bioensaio foi desenvolvido especificamente para investigar os efeitos de que alcalóides da cravagem do centeio tem na vasculatura de suporte do intestino delgado. Foi relatado que 50-60% dos alcalóides alimentados aparecem no abomaso conteúdo, mas apenas 5% são recuperadas nas fezes 8. Strickland et al. 9 afirmou em uma revisão de alcalóides da cravagem do centeio, que sugg dados disponíveisest que o intestino delgado pode ser o local mais importante para a absorção ergopeptine. Eckert et al. 10 aspectos biofarmacêuticos avaliação de alcalóides da cravagem do centeio e afirmou que, assim que atravessar a barreira epitelial, alcalóides da cravagem do centeio, são transportados pelo sistema linfático para a veia subclávia ou via veia mesentérica e em sangue portal. Rhodes et al. 11 relataram uma diminuição do fluxo sanguíneo para duodeno e cólon em novilhos consumindo uma (alta alcalóide da cravagem do centeio) dieta rica infectadas pelo endófito. Usando o bioensaio artéria e veia ruminal direita, 12 Foote et al. Demonstraram que alcalóides da cravagem do centeio são vasoativas na vasculatura ruminal. Foote et al. 13 subsequentemente demonstrado in vivo de que a exposição do rúmen de alcalóides da cravagem do centeio resulta em uma diminuição do fluxo de sangue no rúmen epitelial. Esta diminuição no fluxo do sangue para a superfície de absorção do rúmen concomitante causou uma redução de nutrientes (ácido gordo volátil) de fluxo. Dada a quantity de alcalóides da cravagem do centeio que passam para o intestino delgado do intestino anterior; foi formulada a hipótese de que um efeito semelhante na vasculatura do intestino delgado e a absorção de nutrientes ocorreria. Isto exigiu o desenvolvimento do bioensaio artéria mesentérica e na veia do íleo proximal bovina.

<table><tbody><tr><td>Multi Myograph</td><td>Danish Myo Technologies</td><td>610M</td><td>A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Powerlab 8/sp</td><td>ADIntruments</td><td>ML785</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 7</td><td>ADInstruments</td><td>Version 7</td><td></td></tr><tr><td>Force Calibration Kit</td><td>Danish Myo Technologies</td><td>100055</td><td>Specific to DMT myographs</td></tr><tr><td>Bottle-top Filter</td><td>Nalgene</td><td>595-4520</td><td>0.22 &amp;#956;m pore size; 45 mm neck size</td></tr><tr><td>#5 Jewler&amp;rsquo;s Forceps</td><td>Miltex</td><td>555008FT</td><td>Any brand of forceps can be used</td></tr><tr><td>Noyes Iris Scissors</td><td>Miltex</td><td>18-1510</td><td>Any brand of scissors can be used</td></tr><tr><td>Dissecting Scope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Any brand of dissecting light microscope will suffice</td></tr><tr><td>Adjustable Tissue Matrice</td><td>Braintree Scientific</td><td>TM C12</td><td>This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly</td></tr><tr><td>Krebs-Hensleit Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3753-10x1L</td><td>It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house</td></tr><tr><td>Calcium chloride dehydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Desipramine-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3900-5G</td><td></td></tr><tr><td>Propranolol-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0884-1G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Scott Gross</td><td>UN3156</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating and using sections of bovine mesenteric artery and vein as a bioassay to test for vasoactivity in the small intestine

Sistemas gastrointestinal de mamíferos são constantemente expostos a compostos (desejáveis ​​e indesejáveis) que podem ter um efeito sobre o fluxo de sangue para ea partir desse sistema. Alterações do fluxo sanguíneo para o intestino delgado podem resultar em efeitos nas funções de absorção do órgão. Interesse particular em toxinas liberadas a partir de alimentos através de processos fermentativos e digestivos desenvolveu em ruminantes como uma área onde a eficiência produtiva pode ser melhorada. O vídeo associado a este artigo descreve um ensaio biológico in vitro desenvolvido para compostos de tela para vasoactividade em isolados secções transversais da artéria mesentérica bovina e veia utilizando um multimyograph. Uma vez que os vasos sanguíneos são montados e equilibrada no myograph, o próprio bioensaio pode ser usado: como ferramenta de triagem para avaliar a resposta contrátil ou vasoactividade de compostos de interesse; determinar a presença de tipos de receptores por receptores farmacologicamente alvo com agonista específicos; determinar o papel de um receptor com a presença de um ou mais antagonistas; ou determinar interações potenciais de compostos de interesse com antagonistas. Através de tudo isso, os dados são recolhidos em tempo real, de tecido recolhida a partir de um único animal pode ser exposto a um grande número de diferentes tratamentos experimentais (uma vantagem in vitro), e representa a vasculatura de cada lado do leito capilar para fornecer uma exacta imagem do que poderia estar acontecendo no aferentes e eferentes fornecimento de sangue apoiando o intestino delgado.

Os vasos sanguíneos utilizados para gerar os resultados incluídos foram coletadas de seis novilhos da raça Holandesa (425 ± 8 kg), com intervalo de três semanas. Um exemplo típico de um mesentérica resposta contráctil da veia ao KCl e adições crescentes na concentração de tratamento está apresentado na Figura 2. A magnitude da resposta pode variar um pouco com o tamanho do recipiente (correlacionado com o tamanho do animal dador), mas pode também ser influenciadas (negativamente) pelo manu...

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Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

O intestino delgado é freqüentemente expostos a toxinas que podem influenciar o fluxo sanguíneo e impactar negativamente a absorção de nutrientes. Usando uma artéria mesentérica e multimyograph e veia isolados, os compostos de interesse ou toxinas podem ser rastreados para a vasoactividade.

Isolando e com cortes de bovinos artéria e veia mesentérica como Bioassay teste para vasoactividade no intestino delgado

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

isolating-using-sections-bovine-mesenteric-artery-vein-as-bioassay-to

Research

JoVE Journal

Medicine

9.6K visualizações.  USDA-Agricultural Research Service.  O intestino delgado é freqüentemente expostos a toxinas que podem influenciar o fluxo sanguíneo e impactar negativamente a absorção de nutrientes. Usando uma artéria mesentérica e multimyograph e veia isolados, os compostos de interesse ou toxinas podem ser rastreados para a vasoactividade. 

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Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between 100-400 &mu;m in diameter function primarily in directing blood flow to various organs according to the overall requirements of the body. The rat mesenteric artery has a diameter greater than 100 &mu;m. The myography technique, first described by Mulvay and Halpern1, was based on the method proposed by Bevan and Osher2. The technique provides information about small vessels under isometric conditions, where substantial shortening of the muscle preparation is prevented. Since force production and sensitivity of vessels to different agonists is dependent on the extent of stretch, according to active tension-length relation, it is essential to conduct contraction studies under isometric conditions to prevent compliance of the mounting wires. Stainless steel wires are preferred to tungsten wires because of oxidation of the latter, which affects recorded responses3.The technique allows for the comparison of agonist-induced contractions of mounted vessels to obtain evidence for normal function of vascular smooth muscle cell receptors.
We have shown in several studies that isolated mesenteric arteries that are contracted with phenylyephrine relax upon addition of cumulative concentrations of extracellular calcium (Ca2+e). The findings led us to conclude that perivascular sensory nerves, which express the G protein-coupled Ca2+-sensing receptor (CaR), mediate this vasorelaxation response. Using an automated wire myography method, we show here that mesenteric arteries from Wistar, Dahl salt-sensitive(DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats respond differently to Ca2+e. Tissues from Wistar rats showed higher Ca2+-sensitivity compared to those from DR and DS. Reduced CaR expression in mesenteric arteries from DS rats correlates with reduced Ca2+e-induced relaxation of isolated, pre-contracted arteries. The data suggest that the CaR is required for relaxation of mesenteric arteries under increased adrenergic tone, as occurs in hypertension, and indicate an inherent defect in the CaR signaling pathway in Dahl animals, which is much more severe in DS.
The method is useful in determining vascular reactivity ex vivo in mesenteric resistance arteries and similar small blood vessels and comparisons between different agonists and/or antagonists can be easily and consistently assessed side-by-side6,7,8.

An automated myography method for force measurements in isolated mesenteric arteries is described. It employs a Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A to determine responses to phenylephrine and extracellular calcium. The method allows consistent determination of isometric responses to agonists in small vessels of diameters of 60 - 300 &mu;m, independently.

A contração da artéria mesentérica e Estudos Relaxamento Usando Miografia Fio Automated

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Medicina

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

Avaliando Miogênica Resposta e vasoactividade em artérias mesentéricas de resistência Usando Miografia Pressão

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying tissue compartments, restricting the transport of smaller molecules across the epithelium and almost completely prohibiting epithelial macromolecular transport. This selectivity is determined by the mucous gel layer, which limits the transport of lipophilic molecules and both the apical receptors and tight junctional protein complexes of the epithelium. In vitro cell culture models of the epithelium are convenient, but as a model, they lack the complexity of interactions between the microbiota, mucous-gel, epithelium and immune system. On the other hand, in vivo assessment of intestinal absorption or permeability may be performed, but these assays measure overall gastrointestinal absorption, with no indication of site specificity. Ex vivo permeability assays using &#34;intestinal sacs&#34; are a rapid and sensitive method of measuring either overall intestinal integrity or comparative transport of a specific molecule, with the added advantage of intestinal site specificity. Here we describe the preparation of intestinal sacs for permeability studies and the calculation of the apparent permeability (Papp) of a molecule across the intestinal barrier. This technique may be used as a method of assessing drug absorption, or to examine regional epithelial barrier dysfunction in animal models of gastrointestinal disease.

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or "intestinal sacs" as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.

Ex Vivo Intestinal Sacs para Avaliar mucosa Permeabilidade de modelos de doença gastrointestinal

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rat Assay Angiogenesis Mesentery

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Biologia

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

O Ex vivo Preparação microvasos isolada esquelético de Investigação da reatividade vascular

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Explorando Arterial Músculo Liso KV7 função dos canais de potássio utilizando electrofisiologia patch clamp e Miografia Pressão

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Invasive Hemodynamic Characterization of the Portal-hypertensive Syndrome in Cirrhotic Rats

This is a detailed protocol describing invasive hemodynamic measurements in cirrhotic rats for the characterization of portal hypertensive syndrome. Portal hypertension (PHT) due to cirrhosis is responsible for the most severe complications in patients with liver disease. The full picture of the portal hypertensive syndrome is characterized by increased portal pressure (PP) due to the increased intrahepatic vascular resistance (IHVR), hyperdynamic circulation, and increased splanchnic blood flow. Progressive splanchnic arterial vasodilation and increased cardiac output with elevated heart rate (HR) but low arterial pressure characterizes the portal hypertensive syndrome.
Novel therapies are currently being developed that aim to decrease PP by either targeting IHVR or increased splanchnic blood flow &#8212; but side effects on systemic hemodynamics may occur. Thus, a detailed characterization of portal venous, splanchnic, and systemic hemodynamic parameters, including measurement of PP, portal venous blood flow (PVBF), mesenteric arterial blood flow, mean arterial pressure (MAP), and HR is needed for preclinical evaluation of the efficacy of novel treatments for PHT. Our video article provides the reader with a structured protocol for performing invasive hemodynamic measurements in cirrhotic rats. In particular, we describe the catheterization of the femoral artery and the portal vein via an ileocolic vein and the measurement of portal venous and splanchnic blood flow via perivascular Doppler-ultrasound flow probes. Representative results of different rat models of PHT are shown.

Here we describe a detailed protocol for invasive measurements of hemodynamic parameters including portal pressure, splanchnic blood flow, and systemic hemodynamics in order to characterize the portal hypertensive syndrome in rats.

Caracterização hemodinâmica invasiva da síndrome hipertensiva-Portal em ratos cirrose

This is a detailed protocol describing invasive hemodynamic measurements in cirrhotic rats for the characterization of portal hypertensive syndrome. ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Isolamento de tubos endoteliais microvasculares de Artérias Rato Resistência

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.