Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione della Science Foundation tedesco (DFG, Ro2327 / 6-1) al CRR Gli autori desiderano ringraziare S. Durry e C. Roderigo per l&#39;assistenza tecnica di esperti, e M. Dubbert (Laboratorio di Elettronica, Zoological Institute , Università di Colonia, Germania) per l&#39;aiuto nella realizzazione del controllore di cella di Pockels e l&#39;interruttore HF.

<ol>
	<li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+Na++imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons.">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li><li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+Na++signals+in+spines+and+dendrites.">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li><li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+new+fluorescent+Na++indicator+CoroNa+Green:+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na++imaging.">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li><li>Lamy, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probing+of+sodium+dynamics+in+neurons+and+astrocytes.">Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes.</a> NeuroImage. 58, 572-578 (2011).</li><li>Lasser-Ross, N., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+voltage+and+synaptically+activated+sodium+transients+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells.</a> Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).</li><li>Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission.">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li><li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mismatch+between+the+Na++flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment.">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).</li><li>Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na++imaging+reveals+little+difference+in+action+potential-evoked+Na++influx+between+axon+and+soma.">Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma.</a> Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).</li><li>Denk, W., Piston, D., Webb, W., Pawley, J. 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Exp. , (2011).</li><li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation.">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices.">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium.">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li><li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Ca(2+)+and+Na(+)+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation.">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li><li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na/K+pump+current+and+[Na](i)+in+rabbit+ventricular+myocytes:+Local+[Na](i)+depletion+and+Na+buffering.">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li><li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells.">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li><li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mobility+in+muscle+cells.">Ionic mobility in muscle cells.</a> Science. 166, 1297-1298 (1969).</li><li>Palma-Cerda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+caged+neurotransmitter+analogs+selective+for+glutamate+receptor+sub-types+based+on+methoxynitroindoline+and+nitrophenylethoxycarbonyl+caging+groups.">New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups.</a> Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).</li><li>Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405+nm:+photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li><li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+light+modulator+microscopy.">Spatial light modulator microscopy.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano senza interessi in competizione. Gli autori hanno ricevuto un sostegno finanziario che consenta di pubblicazione Open Access da Rapp optoelettronico (Wedel, Germania), che produce uno strumento utilizzato in questo articolo il video. La società è stata né coinvolta negli esperimenti, né nella gestione dei dati, né nella scrittura manoscritto.

Il presente studio dimostra che SBFI è adatto per due fotoni di imaging di transitori di sodio intracellulari in piccoli compartimenti cellulari. Va tenuto presente, tuttavia, che l&#39;efficienza quantica di SBFI è piuttosto bassa 15 e relativi cambiamenti nella concentrazione di sodio è piuttosto piccola con attività fisiologica. Pertanto, la misurazione ad alta risoluzione di transitori Na + nei processi sottili è un compito relativamente noioso, e binning o media di diversi studi può essere necessario per ottenere segnali soddisfacenti. Inoltre, la cinetica di transienti sodio sono sorprendentemente lento, rendendo obbligatoria registrare per periodi di tempo prolungati. Questa osservazione corrisponde a quelle in studi precedenti, in cui il decadimento monoesponenziale dei transitori di sodio in dendriti neuronali e in astrociti è stata caratterizzata da grandi costanti di tempo di decadimento dell&#39;ordine di 10 secondi a temperatura ambiente 1,2,6. Transitori di sodio sembrano quindi esercitare un tempo molto più lento coUrse e molto più grandi costanti di tempo di decadimento rispetto ai transienti di calcio 16. Mettere da parte questi inconvenienti, l&#39;imaging di sodio dimostra di essere un valido strumento per lo studio delle proprietà fisiologiche dei sottodomini neuronali. Ad esempio, l&#39;imaging di sodio può servire per monitorare l&#39;attività sinaptica eccitatoria in o vicino alla sinapsi attive. Poiché il sodio è essenzialmente non tamponato 8,17, transitori sodio attività indotte sono linearmente correlate a una vasta gamma di rilascio di glutammato sinaptico o esogena glutammato applicati. Essi rappresentano quindi indicatori diretti e imparziali di attività glutamatergico neuronale. Inoltre, indicatore di sodio coloranti presentano s &#39;alta K d (di SBFI K d è nel range di 25 mm 1). Anche a concentrazioni relativamente alte di colorante intracellulari utilizzati per raggiungere la luminosità sufficiente (di solito 0,5-1 mM), l&#39;elevato K d &#39;s implica che i coloranti stessi non agiscono come buffer per sodium. Di conseguenza, essi non distorcano l&#39;ampiezza né il tempo corso di transitori di sodio, che è sempre una preoccupazione quando coloranti calcio-sensibili vengono introdotti nelle cellule 18. Si può pertanto ritenere che i segnali rilevati rappresentano una buona misura delle variazioni &quot;reale&quot; in sodio intracellulare. Il loro decorso lento quindi implica che la velocità di diffusione intracellulare del sodio nei neuroni è molto più piccolo di quanto precedentemente ipotizzato 19. Un requisito fondamentale per la corretta esecuzione di esperimenti che riguardano le proprietà di eccitatori vie di trasmissione e afflusso di sodio sinaptiche nelle spine e dendriti è l&#39;induzione di una attivazione veloce e altamente localizzata di strutture post-sinaptici. Questo può essere ottenuta con l&#39;applicazione facile e locale di glutammato o glutammato agonisti nelle immediate vicinanze di una colonna vertebrale o un dendrite dalla fotolisi lampo di composti gabbia. Fotolisi Flash non dama non meccanicamentege il tessuto, è privo di artefatti da movimento ed è ben stabilito per lo studio di questioni connesse (ad esempio la segnalazione di calcio locale). Il diametro dello spot uncaging è stato di 1,5 micron nel piano xy. Uncaging quasi un segnale di sodio spinosi dendrite indotti in entrambe le spine e il dendrite genitore. Considerando che i segnali tendevano ad essere più grande di spine più vicini al posto uncaging, le ampiezze della dendrite genitore e spine più lontano erano ancora piuttosto simili a quelle nelle immediate vicinanze del punto uncaging. Uncaging è stata eseguita per 300 msec durante il quale le correnti interiori aumentate in ampiezza. Glutammato Uncaged avrebbe diffuso nel tessuto durante lo stesso periodo di tempo, l&#39;attivazione di recettori ionotropici del glutammato e afflusso di sodio sulle regioni dendritiche e le spine più lontano dal punto uncaging. Un problema intrinseco che si verifica quando si utilizza un laser UV per fotolisi di composti in gabbia somministrati attraverso la soluzione di balneazione cellulareè &#39;filtraggio interiore&#39;. A causa del tasso di assorbimento elevato della gabbia, la luce UV si attenua fortemente lungo la strada dall&#39;obiettivo al sito di stimolazione 20,21. Un modo pratico per evitare questo è perfusione locale con la gabbia che è limitato solo per il sito di stimolazione, che riduce inoltre la quantità di composto in gabbia necessaria al minimo. Rispetto al uncaging UV scansione laser-mediata, vicino-infrarossi a due fotoni uncaging 22 è spazialmente più precisa, soprattutto perché la precisione della stimolazione aumenta in asse z. D&#39;altra parte, a causa della piccola sezione di gabbie comunemente usati per le lunghezze d&#39;onda più lunghe come impiegati con eccitazione a due fotoni, sia una elevata concentrazione del composto in gabbia o molto elevato, richiedono intensità luminose potenzialmente fototossiche. Inoltre, due fotoni uncaging richiede un investimento molto maggiore nelle attrezzature; tra gli altri, un laser IR supplementare oltre ai componenti ottici richiesti, sono necessari. Sia SBFI e MNI-glutammato sono eccitabili nella gamma di lunghezze d&#39;onda identica. Questo può portare a una interdipendenza involontaria di laser UV uncaging e SBFI o laser per immagini IR e MNI-glutammato, con conseguente sbiancamento della SBFI dal flash uncaging e / o una uncaging continuo di glutammato dal fascio IR. Tuttavia, come mostrato nella Figura 6C, né un lampo UV per sé né la formazione immagine a più fotoni causato tali influenze reciproche nelle nostre condizioni sperimentali. Sistemi UV-in flash simili a quello qui descritto sono utilizzati di routine in molti altri laboratori e possono essere relativamente facilmente incorporati in nessuna microscopio di imaging multi-fotone esistente. Esso offre il vantaggio che il fascio laser per fotolisi può essere posizionato liberamente nel campo visivo. Inoltre, il sistema permette un riposizionamento rapido ed automatico del fascio laser e il volume di rilascio, rispettivamente, nel campo visivo durante un esperimento. Oumodifica r semplifica e migliora il posizionamento accurato dello spot uncaging, in modo che i frame del software di imaging possono servire per regolare fotogrammi di imaging e uncaging congruente. Nel loro insieme, whole-cell patch-clamp e l&#39;imaging di sodio multi-fotone in dendriti e spine dei neuroni centrali, unita ad una procedura modificata per uncaging UV-luce-indotta di glutammato, permette l&#39;attivazione affidabile e focale dei recettori del glutammato nel tessuto. Si può quindi servire per analizzare le proprietà di trasmissione sinaptica eccitatoria e segnali di sodio nei neuroni postsinaptici nel tessuto intatto.

Recenti miglioramenti nelle tecniche microscopiche leggeri quali microscopia multi-fotone hanno consentito lo studio dei parametri morfologici e fisiologici delle cellule cerebrali nel tessuto intatto con elevata risoluzione spaziale e temporale. Combinato con elettrofisiologia, queste tecniche sono ora ampiamente utilizzati per analizzare i segnali elettrici di attività legate sui neuroni e segnali di calcio concomitanti in piccoli compartimenti subcellulari, vale a dire in dendriti sottili e spine dendritiche. Oltre a transienti di calcio, attività sinaptica induce anche i segnali di sodio in dendriti e spine, le cui proprietà sono in gran parte inesplorate. Tali segnali possono essere analizzati da due fotoni di imaging di sodio intracellulare ([Na +] i) che permette la misurazione on-line di [Na +] i transienti per periodi prolungati senza significativo sbiancamento colorante o foto-danno 1,2. Per l&#39;imaging di i [Na +] </sub&gt;, a pochi coloranti indicatore chimico sono disponibili, ad esempio Corona Verde o Asante Natrium Verde 3,4. La sonda fluorescente più comunemente usato per Na + imaging è sodio-binding isoftalato benzofuran (SBFI). Si tratta di un raziometrica, colorante UV-eccitato simile al noto colorante calcio-sensibile fura-2 ed è stato impiegato per l&#39;imaging convenzionale Na + in molti tipi di cellule (ad esempio 5,6). Ci sono diverse possibilità di emozionanti del colorante e raccogliendo sua fluorescenza. Se è richiesta alta risoluzione temporale (cioè un frame rate elevato di imaging) in combinazione con le informazioni spaziali, SBFI può essere eccitato con una lampada allo xeno ad arco o un diodo dispositivo ad alta potenza di uscita della luce (LED) e la sua emissione rilevato con una carica ad alta velocità Dispositivo -coupled (CCD), fotocamera 7,8. Per la risoluzione spaziale massima profondità nel tessuto, microscopia a scansione laser multi-fotone è il metodo di scelta 9. Il relativamente basso efficie quantisticaNCY di SBFI richiede concentrazioni relativamente alte di colorante (0,5-2 mm), e il caricamento diretto del modulo membrana impermeabile di SBFI tramite un forte microelettrodo 10 o la patch pipetta 1. Utilizzando SBFI, precedenti lavori eseguiti in fettine di tessuto acute dell&#39;ippocampo roditori hanno dimostrato attività legate transitori di sodio in dendriti e spine dei neuroni CA1 piramidali che sono causati principalmente da afflusso di sodio attraverso ionotropici NMDA recettori 1,2. Per lo studio delle proprietà di tali segnali sodio locali in maggior dettaglio, l&#39;attivazione di specifici recettori postsinaptici di applicazione di agonisti del recettore è un metodo adatto di scelta. Per simulare l&#39;attività presinaptica e rilascio del trasmettitore, l&#39;applicazione dovrebbe essere relativamente breve e focalizzato per consentire la stimolazione locale. Questo, tuttavia, risulta essere molto impegnativo nel tessuto intatto. Applicazione di pressione locale di agonisti del recettore con una pipetta a punta fine permette di ap molto focaleplicatura, ma ospita il rischio potenziale per produrre il movimento della struttura di interesse (ad esempio, come un dendrite o spine dendritiche), e quindi ostacola imaging ad alta risoluzione. L&#39;idoneità di ionoforesi di sostanze neuro-attivi dipende dalle loro proprietà elettriche e alte ampiezze di corrente può produrre artefatti cellulari pure. Un modo per aggirare questi ostacoli è l&#39;impiego di composti foto-attivati ​​e la loro fotolisi del flash. Fondamentalmente, due principi differenti vengono utilizzati per la foto-attivazione di sostanze in gabbia: I) a largo campo del flash fotolisi 11 e II) uncaging focale impiegando moduli di scansione in combinazione con il laser 12. Mentre in tutto il campo del flash fotolisi viene utilizzato per attivare più grandi regioni di interesse, ad esempio, un intera cella, uncaging focale è impiegata per stimolare in particolare i piccoli compartimenti cellulari. In questo studio dimostriamo una procedura per whole-cell patch-clamp e multi-pImaging sodio Hoton in dendriti e spine di neuroni centrali, unita ad una procedura modificata per uncaging luce UV-indotta di glutammato, che permette l&#39;attivazione affidabile e focale dei recettori del glutammato nel tessuto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:239px;">Hadrware/Software Component</td>
			<td style="width:231px;">Manufacturer</td>
			<td style="width:183px;">Type</td>
			<td style="width:487px;">Comment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>1405059</td>
			<td>75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Camera</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>ProgRes MF</td>
			<td>IR-DIC compatible camera</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>Huygens Pofessional X11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fiber optic spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>USB 4000</td>
			<td>Miniature fiber optic spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Filter tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cenrifugal filter, 0.2 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging software</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR beam power controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td>Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR laser</td>
			<td>SpectraPhysics</td>
			<td>Mai-Tai VF-N1S</td>
			<td>fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR power monitor</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Micromanipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>PCS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Microscope/Imaging System</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>BX51WI/FV300</td>
			<td>Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">ND filter wheel</td>
			<td>Newport</td>
			<td>50Q04AV.2</td>
			<td>UV fused silica, optical density 0.05-2.0</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Objective</td>
			<td>Nikon Instruments Europe</td>
			<td>NIR Apo 60x/1.0w</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>NPI Electronic</td>
			<td>PDES-DXH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>350-80 LA-BK</td>
			<td>EOM, used as fast switch and for power adjustment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell driver</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M302-RM</td>
			<td>High voltage differential amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>LS6ZM2</td>
			<td>ALMgF2-coated BeCu blades</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter driver</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>Uniblitz VCM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Slicer / Vibratome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Uncaging software</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser&#160;</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>DL-355/10</td>
			<td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser scanning system</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA 40</td>
			<td>Galvanometric scanning system</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Name of Compound</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CNQX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">SBFI K+ Salt</td>
			<td>Teflabs</td>
			<td>OO32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">NMI-caged-L-Glutamate</td>
			<td>Torcis</td>
			<td>1490</td>
			<td>Caged glutamatereleased upon UV absobtion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons

Multi-fotone microscopia a fluorescenza ha permesso l&#39;analisi dei parametri morfologici e fisiologici delle cellule cerebrali nel tessuto intatto con elevata risoluzione spaziale e temporale. Combinato con elettrofisiologia, è ampiamente usato per studiare i segnali di calcio di attività legate in piccoli compartimenti subcellulari come i dendriti e spine dendritiche. Oltre a transienti di calcio, attività sinaptica induce anche i segnali di sodio post-sinaptici, le cui proprietà sono solo marginalmente comprensibili. Qui, descriviamo un metodo per combinato whole-cell patch-clamp e l&#39;imaging di sodio multi-fotone in micro domini cellulari dei neuroni centrali. Inoltre, si introduce una procedura modificata per l&#39;ultra-violetta (UV) uncaging-luce-indotta di glutammato, che consente l&#39;attivazione affidabile e focale dei recettori del glutammato nel tessuto. A tal fine, le registrazioni cellule intere sono state effettuate su Cornu Ammonis suddivisione 1 (CA1) neuroni piramidali in fettine di tessuto acute dellaippocampo di topo. I neuroni sono stati riempiti con il sodio-sensibile colorante fluorescente SBFI attraverso la patch-pipetta, e multi-fotone di eccitazione del SBFI consentito la visualizzazione dei dendriti e spine adiacenti. Per stabilire uncaging focale indotta da UV, diversi parametri tra cui l&#39;intensità della luce, volume interessato dal fascio uncaging UV, posizionamento del fascio così come la concentrazione del composto in gabbia sono stati testati e ottimizzati. I nostri risultati mostrano che la perfusione locale con glutammato in gabbia (MNI-glutammato) e il suo risultato UV-uncaging focale nelle correnti interiori e transitori di sodio in dendriti e spine. Naturalmente il tempo e l&#39;ampiezza delle due correnti attivo e segnali sodio correlano con la durata dell&#39;impulso uncaging. Inoltre, i nostri risultati mostrano che i segnali di sodio intracellulari sono bloccati in presenza di bloccanti per i recettori ionotropici del glutammato, dimostrando che essi sono mediati da afflusso di sodio se questo percorso. In sintesi, il nostro metodo fornisce uno strumento affidabile per laricerca di segnali di sodio intracellulari indotti da attivazione del recettore focale nel tessuto cerebrale intatto.

Nel presente studio, abbiamo dimostrato una procedura per la microscopia multi-fotone delle dinamiche di sodio cellulari con il colorante fluorescente SBFI sodio-dipendenti nei neuroni piramidali CA1 di topo acuta fettine di tessuto ippocampale. Inoltre, mostriamo come combinare questa tecnica di imaging con uncaging a base di laser-scanning di composti neuro-attiva (ad esempio glutammato in gabbia) e la sua precisione di targeting per cellulari micro-domini. Caricamento neuroni con SBFI attraverso la patch-pipetta permesso la visualizzazione di tutta la cellula compresi dendriti e spine sottili adiacenti impiegando multi-fotone di eccitazione (Figura 6A, B, D e Figura 7a). <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6 segnali di sodio e correnti sinaptiche indotte dal flash fotolisi del glutammato in gabbia. (A) MaximAl proiezione dell&#39;immagine di un neurone piramidale CA1 caricato con SBFI tramite la pipetta di patch (PP). La casella indica l&#39;area indicata ampliata nel B. LP indica la posizione e l&#39;orientamento della pipetta per perfusione locale di glutammato in gabbia. (B) ad alta potenza massima proiezione di una pila di sezioni ottiche di un dendrite con spine dendritiche adiacenti. Le pile di sezioni ottiche sottoposti z-allineamento e deconvoluzione. La croce rossa indica la regione di destinazione del fascio uncaging. La linea tratteggiata arancione delimita la regione di interesse da cui è stata registrata l&#39;emissione di fluorescenza. La casella indica l&#39;area indicata ampliata nel D. (C) A sinistra: il segnale di sodio (riga superiore) e somatica verso l&#39;interno di corrente (riga inferiore) indotta dal flash fotolisi del glutammato in gabbia (indicato dal lampo giallo). La linea rossa rappresenta un fit dei dati sperimentali. L&#39;area grigia rappresenta il periodo in cui il flash uncaging (300msec) ostruito l&#39;imaging di fluorescenza SBFI Destra:. senza pre-perfusione con glutammato in gabbia, la stessa UV-flash né evocato un cambiamento di emissione SBFI, né una corrente verso l&#39;interno (D) A sinistra:. Immagine ad alta potenza del dendrite e adiacente spine come delineata in B. Accanto, la stessa immagine con valori di grigio invertite. Le linee tratteggiate indicano le regioni di interesse in cui è stato registrato l&#39;emissione di fluorescenza. La croce rossa indica la localizzazione del fascio uncaging Destra:. Transienti sodio indotta da UV-flash fotolisi del glutammato in gabbia. Blu traccia: segnali di sodio nel dendrite; traccia rossa: risposta media da tre spine adiacenti al punto uncaging; traccia verde: risposta media da tre spine lontane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per una versione più grande di questa figura.</a> Dopo la perfusione locale con Cagedglutammato, applicando un UV-flash vicino ad un dendrite portato ad una diminuzione transitoria emissione di fluorescenza di SBFI, riflettendo un aumento della concentrazione di sodio intracellulare (Figura 6C, D e Figura 7B). Allo stesso tempo, una corrente verso l&#39;interno è stato registrato al soma (Figura 6C e Figura 7B). Aumentare la durata del flash UV ha portato ad aumentare ampiezze sia della suscitato verso l&#39;interno correnti e segnali di sodio (dati non mostrati), indicando che il sistema era ben all&#39;interno della sua gamma dinamica e che le risposte non uncaging né cellulari erano saturi. Applicazione di un UV-lampo di identica durata o più per sezioni che non sono state pre-perfusi con glutammato in gabbia, non ha provocato cambiamenti nel SBFI fluorescenza né correnti interiori, indicando che questi segnali sono dovuti alla uncaging di glutammato (Figura 6C). Inoltre, questi risultati mostrano che nessuna interdipendenza dei componenti imaging- e uncaging si osserva under nostre condizioni sperimentali. Segnali di sodio potrebbe essere rilevato anche in spine dendritiche (Figura 6D). Anche se non abbiamo tentato di ottenere la stimolazione di un singolo colonna vertebrale solo con glutammato uncaging, ampiezze di picco tendevano ad essere leggermente superiore a spine vicino al punto uncaging, considerando spine più lontano hanno mostrato variazioni di fluorescenza praticamente identiche come il dendrite genitore (Figura 6D). Infine, abbiamo studiato il percorso per afflusso di sodio nei dendriti e spine in risposta a uncaging di glutammato. A tal fine, abbiamo impiegato CNQX e APV, che sono bloccanti selettivi per i sodio-permeabili, recettori ionotropici del glutammato del AMPA- e NMDA-sottotipo, rispettivamente. I nostri risultati mostrano che i segnali sodio intracellulare indotta da glutammato e le correnti somatici stimolate sono stati omessi in presenza di questi bloccanti (Figura 7B). Al momento del wash-out dei bloccanti, i segnali sono riacquistato. Questo dimostra that uncaging di glutammato attiva i recettori del glutammato ionotropici sui neuroni piramidali CA1, che mediano l&#39;afflusso di sodio nei dendriti e spine, con conseguente transienti intracellulari di sodio e correnti verso l&#39;interno. <img alt="Figura 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" /> Figura 7 profilo farmacologico dei segnali di sodio evocate e delle correnti verso l&#39;interno. (A) SBFI pieno CA1 piramidale neuroni con la patch pipetta (PP) allegato al soma (B) A sinistra:. Transitorio di sodio e la corrente somatica indotta da foto-attivazione di glutammato in gabbia in un dendrite e spine collegate Center. Perfusione con l&#39; ionotropici bloccanti del recettore del glutammato CNQX e APV inibisce sia il segnale di sodio e la corrente verso l&#39;interno indotta da uncaging destra:. Su wash-out dei bloccanti, i segnali vengono ripristinati. I rappre linea rossats una misura dei dati sperimentali. L&#39;area grigia rappresenta il periodo in cui il flash uncaging (300 msec) ostruito l&#39;imaging di fluorescenza SBFI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per una versione più grande di questa figura.</a>

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Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Descriviamo la combinazione di focale indotta da UV foto-attivazione di composti neuro-attivi con whole-cell patch-clamp e multi-Photon Imaging di transitori di sodio intracellulari in dendriti e spine di neuroni ippocampali in fettine di tessuto acute del cervello di topo.

Multi-fotone intracellulare di sodio Imaging Combinato con UV-mediata uncaging focale di glutammato in neuroni piramidali CA1

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

multi-photon-intracellular-sodium-imaging-combined-with-uv-mediated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K Views.  Heinrich Heine University Düsseldorf.  Descriviamo la combinazione di focale indotta da UV foto-attivazione di composti neuro-attivi con whole-cell patch-clamp e multi-Photon Imaging di transitori di sodio intracellulari in dendriti e spine di neuroni ippocampali in fettine di tessuto acute del cervello di topo. 