Este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación Alemana de Ciencias (DFG, Ro2327 / 6-1) a CRR Los autores desean agradecer a S. Durry y C. Rodrigo de asistencia técnica de expertos, y M. Dubbert (Laboratorio de Electrónica, Instituto Zoológico , Universidad de Colonia, Alemania) para obtener ayuda en la aplicación del controlador de la célula Pockels y el interruptor de HF.

<ol>
	<li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+Na++imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons.">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li><li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+Na++signals+in+spines+and+dendrites.">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li><li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+new+fluorescent+Na++indicator+CoroNa+Green:+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na++imaging.">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li><li>Lamy, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probing+of+sodium+dynamics+in+neurons+and+astrocytes.">Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes.</a> NeuroImage. 58, 572-578 (2011).</li><li>Lasser-Ross, N., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+voltage+and+synaptically+activated+sodium+transients+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells.</a> Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).</li><li>Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission.">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li><li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mismatch+between+the+Na++flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment.">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).</li><li>Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na++imaging+reveals+little+difference+in+action+potential-evoked+Na++influx+between+axon+and+soma.">Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma.</a> Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).</li><li>Denk, W., Piston, D., Webb, W., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 445-458 (1995).</li><li>Jaffe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds+in+the+cilia+of+olfactory+sensory+neurons.">Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation.">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices.">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium.">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li><li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Ca(2+)+and+Na(+)+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation.">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li><li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na/K+pump+current+and+[Na](i)+in+rabbit+ventricular+myocytes:+Local+[Na](i)+depletion+and+Na+buffering.">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li><li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells.">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li><li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mobility+in+muscle+cells.">Ionic mobility in muscle cells.</a> Science. 166, 1297-1298 (1969).</li><li>Palma-Cerda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+caged+neurotransmitter+analogs+selective+for+glutamate+receptor+sub-types+based+on+methoxynitroindoline+and+nitrophenylethoxycarbonyl+caging+groups.">New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups.</a> Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).</li><li>Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405+nm:+photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li><li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+light+modulator+microscopy.">Spatial light modulator microscopy.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).</li></ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses. Los autores recibieron apoyo financiero que permite publicación de acceso abierto por Rapp optoelectrónicos (Wedel, Alemania), que produce un instrumento utilizado en el artículo de vídeo. La compañía no ha estado involucrada en los experimentos ni en el manejo de los datos ni en la escritura manuscrita.

El presente estudio muestra que SBFI es muy adecuado para formación de imágenes de dos fotones de los transitorios de sodio intracelulares en pequeños compartimentos celulares. Tiene que tenerse en cuenta, sin embargo, que la eficiencia cuántica de SBFI es más bien baja 15 y relativos cambios en la concentración de sodio son bastante pequeñas con actividad fisiológica. Por lo tanto, la medición de alta resolución de los transitorios de Na + en los procesos de finos es una tarea relativamente tedioso, y binning o promediación de varios ensayos puede ser necesario para obtener señales satisfactorios. Además, la cinética de los transitorios de sodio son sorprendentemente lenta, por lo que es obligatorio para grabar durante períodos de tiempo prolongados. Esta observación se corresponde con los de estudios anteriores, donde la caries monoexponencial de los transitorios de sodio en las dendritas neuronales y en los astrocitos se caracteriza por constantes de tiempo grandes descomposición en el intervalo de 10 segundos a temperatura ambiente 1,2,6. Por lo tanto los transitorios de sodio parecen ejercer un momento co mucho más lentourse y mucho más grandes constantes de tiempo de decaimiento, en comparación con los transitorios de calcio 16. Ponga a un lado estos inconvenientes, las imágenes de sodio ha demostrado ser una herramienta valiosa para la investigación de las propiedades fisiológicas de subdominios neuronales. Por ejemplo, las imágenes de sodio puede servir para controlar la actividad sináptica excitatoria en o cerca de las sinapsis activas. Debido esencialmente de sodio no está tamponada 8,17, transitorios de sodio inducida por la actividad están relacionadas linealmente a una amplia gama de la liberación de glutamato sináptico de glutamato o exógenamente aplicados. Ellos por lo tanto, representan indicadores directos e imparciales de la actividad glutamatérgica neuronal. Además, colorantes indicadores de sodio presentan una alta K d &#39;s (de SBFI K d está en el intervalo de 25 mM 1). Incluso en las concentraciones de colorante intracelulares relativamente altas usadas para lograr el brillo suficiente (generalmente 0,5-1 mM), el alto K d &#39;s implica que los propios tintes no actúan como amortiguadores para sodium. En consecuencia, no distorsionan el curso amplitud ni el tiempo de los transitorios de sodio, que es siempre una preocupación cuando tintes sensibles al calcio se introducen en las células 18. Por lo tanto, se puede suponer que las señales detectadas representan una buena medida de los cambios &quot;reales&quot; en sodio intracelular. Su evolución en el tiempo lento implica entonces que la velocidad para la difusión intracelular de sodio en las neuronas es mucho menor que anteriormente supone 19. Un requisito fundamental para la exitosa ejecución de los experimentos que abordan las propiedades de las vías de transmisión y de afluencia de sodio sinápticos excitatorios en espinas y dendritas es la inducción de una activación rápida y muy localizada de estructuras postsinápticas. Esto se puede conseguir mediante la aplicación rápida y local de glutamato o agonistas de glutamato en la vecindad directa de una columna o una dendrita por la fotolisis de flash de compuestos enjaulados. Fotólisis flash hace dama no mecánicamentege el tejido, está libre de artefactos de movimiento y está bien establecido para la investigación de cuestiones relacionadas (por ejemplo, la señalización de calcio local). El diámetro de la mancha uncaging fue de 1,5 micras en el plano xy. Uncaging cerca de una señal de sodio dendritas espinosas inducidas en las dos espinas y la dendrita padres. Considerando que las señales tendían a ser más grande en las espinas más cercanos al lugar uncaging, las amplitudes en la dendrita de los padres y espinas más lejos todavía eran bastante similares a aquellos en proximidad directa de la mancha uncaging. Uncaging se realizó durante 300 mseg durante el cual corrientes hacia el interior aumentaron en amplitud. Glutamato Uncaged podría haber difundido en el tejido durante el mismo período de tiempo, la activación de los receptores ionotrópicos de glutamato y la entrada de sodio en las regiones dendríticas y espinas más lejos del punto uncaging. Un problema intrínseco que se produce cuando se utiliza un láser UV para la fotólisis de compuestos enjaulados administrados a través de la solución de baño de célulases &#39;de filtrado interno&#39;. Debido a la alta tasa de absorción de la jaula, la luz UV se atenúa fuertemente a lo largo del camino desde el objetivo a la zona de estimulación 20,21. Una manera posible de evitar esto es la perfusión local con la jaula que se limita sólo a la zona de estimulación, lo que disminuye, además, la cantidad de compuesto necesaria enjaulado a un mínimo. En comparación con uncaging mediada por escaneo láser UV, cerca de infra-rojo de dos fotones uncaging 22 es espacialmente más precisa, principalmente debido a la precisión de la estimulación se incrementa en el eje z. Por otro lado, debido a la sección transversal pequeña de las jaulas comúnmente utilizados para longitudes de onda más largas como se emplea con excitación de dos fotones, ya sea una alta concentración del compuesto enjaulado o muy alta, se necesitan intensidades de luz potencialmente fototóxicas. Además, uncaging de dos fotones requiere una inversión mucho mayor en el equipo; entre otros, un láser IR adicional, más los componentes ópticos necesarios, se necesitan. Tanto SBFI y MNI-glutamato son excitables en el rango de longitud de onda idénticas. Esto puede conducir a una interdependencia involuntaria de láser UV uncaging y SBFI o láser de formación de imágenes IR y MNI-glutamato, lo que resulta en el blanqueo de SBFI por el flash uncaging y / o un uncaging continua de glutamato por el haz IR. Sin embargo, como se muestra en la Figura 6C, ni un destello UV por sí mismo ni la formación de imágenes de múltiples fotones causado tales efectos recíprocos en las condiciones experimentales. Sistemas UV en flash similar a la descrita aquí se utilizan de forma rutinaria en muchos otros laboratorios y pueden con relativa facilidad pueden incorporar en cualquier microscopio de imagen multi-fotón existente. Ofrece la ventaja de que el haz de láser para la fotólisis se puede colocar libremente en el campo de visión. Además, el sistema permite un reposicionamiento rápido y automatizado del haz de láser y el volumen de liberación, respectivamente, en el campo de visión durante un experimento. Our modificación simplifica y mejora el posicionamiento preciso del punto uncaging, de modo que los marcos de la formación de imágenes de software pueden servir para ajustar los marcos de imagen y uncaging congruentemente. Tomados en conjunto, de células enteras patch-clamp de sodio y de formación de imágenes multi-fotón en dendritas y espinas de las neuronas centrales, combinada con un procedimiento modificado para uncaging UV-inducida por la luz de glutamato, permite la activación fiable y focal de receptores de glutamato en el tejido. De este modo, puede servir para analizar las propiedades de la transmisión sináptica excitatoria y de señales de sodio en las neuronas postsinápticas en el tejido intacto.

Las recientes mejoras en técnicas microscópicas, tales como la microscopía de luz multi-fotón han permitido el estudio de parámetros morfológicos y fisiológicos de las células del cerebro en el tejido intacto con alta resolución espacial y temporal. Combinado con la electrofisiología, estas técnicas son ampliamente utilizados para analizar las señales eléctricas relacionadas con la actividad de las neuronas, así como las señales de calcio concomitantes en pequeños compartimentos subcelulares, es decir, en finas dendritas y espinas dendríticas. Además de los transitorios de calcio, la actividad sináptica también induce señales de sodio en las dendritas y espinas, las propiedades de las que son en gran parte inexplorado. Tales señales pueden ser analizados mediante formación de imágenes de dos fotones de sodio intracelular ([Na +] i), que permite la medición en línea de [Na +] i transitorios por períodos prolongados sin blanqueo tinte significativa o foto-daño 1,2. Para imágenes de i [Na +] </sub&gt;, sólo unos pocos colorantes indicadores químicos están disponibles, por ejemplo, Corona Verde o Asante Natrium Verde 3,4. La sonda fluorescente más comúnmente utilizado para obtener imágenes de Na + es isoftalato de benzofurano (SBFI) de unión de sodio. Es un radiométrica, colorante UV excitada similar a la conocida colorante sensible al calcio fura-2 y se ha empleado para formación de imágenes convencional Na + en muchos tipos de células (por ejemplo, 5,6). Hay diferentes posibilidades de excitar el colorante y la recogida de su fluorescencia. Si se requiere alta resolución temporal (es decir, una velocidad de fotogramas de imagen de alta) en combinación con la información espacial, SBFI puede ser excitado con una lámpara de arco de xenón o un diodo (LED) dispositivo emisor de luz de alta potencia y su emisión detectada con una carga de alta velocidad dispositivo-junto (CCD) 7,8 cámara. Para la resolución espacial máxima profundidad en el tejido, la microscopía de barrido láser multi-fotón es el método de elección 9. El efficie cuántica relativamente bajancy de SBFI requiere concentraciones relativamente altas de tinte (0,5-2 mM), y la carga directa de la forma de membrana impermeable de SBFI a través de un microelectrodo agudo 10 o parche pipeta 1. Usando SBFI, trabajo anterior realizado en cortes de tejido agudos de hipocampo de roedores demostró transitorios sodio relacionados con la actividad en las dendritas y espinas de las neuronas piramidales CA1 que son causadas principalmente por el influjo de sodio a través de receptores ionotrópicos NMDA 1,2. Para el estudio de las propiedades de dichas señales de sodio locales en más detalle, la activación específica de los receptores postsinápticos por aplicación de agonistas de los receptores es un método muy adecuado de elección. Para imitar la actividad presináptica y la liberación del transmisor, la aplicación debe ser relativamente breve y centrado para permitir la estimulación local. Esto, sin embargo, resulta ser bastante difícil en el tejido intacto. Aplicación de presión local de agonistas de los receptores utilizando una pipeta con punta fina permite ap muy focalplicatura, pero alberga el riesgo potencial para producir el movimiento de la estructura de interés (por ejemplo, como una dendrita o espinas dendríticas), y por lo tanto dificulta la proyección de imagen de alta resolución. La idoneidad de la iontoforesis de sustancias neuro-activo depende de sus propiedades eléctricas y las altas amplitudes de corriente puede producir artefactos celulares también. Una forma de soslayar estos obstáculos es el empleo de compuestos foto-activado y su fotólisis flash. Básicamente, dos principios diferentes se utilizan para la foto-activación de sustancias enjaulados: I) de campo amplio de flash fotólisis 11 y II) uncaging focal empleando módulos de análisis en combinación con el láser 12. Si bien en todo el campo de flash fotólisis se utiliza para activar las regiones más grandes de interés, por ejemplo, una célula entera, se emplea uncaging focal para estimular específicamente pequeños compartimentos celulares. En el presente estudio se demuestra un procedimiento para de células enteras patch-clamp y multi-pformación de imágenes de sodio Hoton en las dendritas y espinas de las neuronas centrales, combinada con un procedimiento modificado para uncaging inducida por luz UV de glutamato, que permite la activación fiable y focal de receptores de glutamato en el tejido.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:239px;">Hadrware/Software Component</td>
			<td style="width:231px;">Manufacturer</td>
			<td style="width:183px;">Type</td>
			<td style="width:487px;">Comment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>1405059</td>
			<td>75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Camera</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>ProgRes MF</td>
			<td>IR-DIC compatible camera</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>Huygens Pofessional X11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fiber optic spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>USB 4000</td>
			<td>Miniature fiber optic spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Filter tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cenrifugal filter, 0.2 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging software</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR beam power controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td>Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR laser</td>
			<td>SpectraPhysics</td>
			<td>Mai-Tai VF-N1S</td>
			<td>fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR power monitor</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Micromanipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>PCS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Microscope/Imaging System</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>BX51WI/FV300</td>
			<td>Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">ND filter wheel</td>
			<td>Newport</td>
			<td>50Q04AV.2</td>
			<td>UV fused silica, optical density 0.05-2.0</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Objective</td>
			<td>Nikon Instruments Europe</td>
			<td>NIR Apo 60x/1.0w</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>NPI Electronic</td>
			<td>PDES-DXH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>350-80 LA-BK</td>
			<td>EOM, used as fast switch and for power adjustment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell driver</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M302-RM</td>
			<td>High voltage differential amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>LS6ZM2</td>
			<td>ALMgF2-coated BeCu blades</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter driver</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>Uniblitz VCM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Slicer / Vibratome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Uncaging software</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser&#160;</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>DL-355/10</td>
			<td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser scanning system</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA 40</td>
			<td>Galvanometric scanning system</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Name of Compound</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CNQX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">SBFI K+ Salt</td>
			<td>Teflabs</td>
			<td>OO32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">NMI-caged-L-Glutamate</td>
			<td>Torcis</td>
			<td>1490</td>
			<td>Caged glutamatereleased upon UV absobtion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons

Microscopía de fluorescencia Multi-fotón ha permitido el análisis de parámetros morfológicos y fisiológicos de las células del cerebro en el tejido intacto con alta resolución espacial y temporal. Combinado con la electrofisiología, se utiliza ampliamente para estudiar las señales de calcio relacionados con la actividad en pequeños compartimentos subcelulares tales como dendritas y espinas dendríticas. Además de los transitorios de calcio, la actividad sináptica también induce señales de sodio postsinápticos, las propiedades de los cuales son sólo marginalmente entendidos. Aquí se describe un método para su conjunto de células patch-clamp combinado y de imagen de sodio multi-fotón en celulares dominios micro de las neuronas centrales. Además, se introduce un procedimiento modificado para la ultra-violeta (UV) uncaging inducida -light de glutamato, que permite la activación fiable y focal de receptores de glutamato en el tejido. Para este fin, las grabaciones de células enteras se realizaron en Cornu Ammonis subdivisión 1 (CA1) neuronas piramidales en cortes de tejido agudos de lahipocampo del ratón. Las neuronas se llenaron con el colorante fluorescente SBFI sensible al sodio a través del parche pipeta, y multi-fotón de excitación de SBFI permitieron la visualización de las dendritas y espinas adyacentes. Para establecer uncaging focal inducida por UV, varios parámetros, incluyendo la intensidad de luz, volumen afectado por el haz uncaging UV, el posicionamiento de la viga así como la concentración del compuesto enjaulado fueron probados y optimizados. Nuestros resultados muestran que la perfusión local con glutamato enjaulado (MNI-glutamato) y su focal resultado-UV uncaging en corrientes hacia el interior y los transitorios de sodio en las dendritas y espinas. Transcurso de tiempo y la amplitud de las dos corrientes de entrada y las señales de sodio se correlacionan con la duración del impulso de uncaging. Además, nuestros resultados muestran que las señales intracelulares de sodio están bloqueados en presencia de bloqueadores para los receptores de glutamato ionotrópicos, lo que demuestra que están mediadas por la entrada de sodio, aunque esta vía. En resumen, nuestro método proporciona una herramienta fiable para lainvestigación de señales intracelulares de sodio inducida por la activación del receptor en el tejido cerebral focal intacto.

En el presente estudio, se demuestra un procedimiento para la microscopía de múltiples fotones de la dinámica de sodio celulares con el fluorescente SBFI colorante dependiente del sodio en las neuronas piramidales CA1 del ratón aguda cortes de tejido del hipocampo. Por otra parte, nos muestran cómo combinar esta técnica de imagen con uncaging basado escaneo láser de compuestos neuro-activa (por ejemplo, glutamato enjaulado) y su precisión extrema a la micro-dominios celulares. Cargando neuronas con SBFI a través de la pipeta patch-permitieron la visualización de toda la célula incluyendo finas dendritas y espinas adyacentes mediante el empleo de excitación multi-fotón (Figura 6A, B, D y la Figura 7a). <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. señales de sodio y corrientes sinápticas inducidas por el flash fotólisis de glutamato enjaulado. (A) Maximimagen de proyección al de una neurona piramidal CA1 cargado con SBFI a través de la pipeta de parche (PP). El cuadro indica el área que se muestra ampliada en B. LP indica la posición y orientación de la pipeta para perfusión local de glutamato enjaulado. (B) de alta potencia de proyección máxima de una pila de secciones ópticas de una dendrita con espinas dendríticas adyacentes. Las pilas de secciones ópticas se sometieron z-alineación y deconvolución. La cruz roja indica que la región de orientación del haz uncaging. La línea de puntos naranja delimita la región de interés de la que se registró la emisión de fluorescencia. El cuadro indica el área que se muestra ampliada en D. (C) A la izquierda: la señal de sodio (fila superior) y somática corriente de entrada (fila inferior) inducida por el flash fotólisis de glutamato enjaulado (indicado por el flash de color amarillo). La línea roja representa un ajuste de los datos experimentales. El área gris representa el período en el que el flash uncaging (300mseg) obstruyó la obtención de imágenes de fluorescencia SBFI Derecha:. Sin pre-perfusión con glutamato enjaulado, la misma UV-flash ni evocó un cambio en la emisión de SBFI, ni una corriente hacia el interior (D) Izquierda:. Imagen de alta potencia de la dendrita y adyacentes espinas según lo delineado en B. Junto, la misma imagen con valores de gris invertidos. Las líneas punteadas indican las regiones de interés en la que se registró la emisión de fluorescencia. La cruz roja indica la localización del haz de uncaging Derecha:. Transitorios de sodio inducida por la radiación UV-flash fotólisis de glutamato enjaulado. Azul traza: señales de sodio en la dendrita; trazo rojo: la respuesta de tres espinas adyacentes al lugar uncaging promedio; verde rastro: la respuesta de tres espinas distantes promedio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para una versión más grande de esta figura.</a> Después de la perfusión local con enjauladoglutamato, la aplicación de un UV-flash cerca de una dendrita resultó en una disminución transitoria en la emisión de fluorescencia de SBFI, lo que refleja un aumento en la concentración de sodio intracelular (Figura 6C, D y la Figura 7B). Al mismo tiempo, una corriente hacia el interior se registró en el soma (Figura 6C y la Figura 7B). El aumento de la duración del destello UV resultó en el aumento de las amplitudes tanto de la provocada corrientes hacia el interior y las señales de sodio (datos no mostrados), lo que indica que el sistema estaba dentro de su rango dinámico y que las respuestas ni uncaging ni celulares se saturaron. Aplicación de un UV-flash de idéntica duración o más para rebanadas que no habían sido pre-perfundido con glutamato enjaulado, nunca provocó cambios en la fluorescencia SBFI ni corrientes hacia el interior, lo que indica que estas señales se deben a la uncaging de glutamato (Figura 6C). Por otra parte, estos resultados muestran que u no se observa la interdependencia de los componentes Imaging- y uncagingnder nuestras condiciones experimentales. Señales de sodio también puede ser detectada en las espinas dendríticas (Figura 6D). Mientras que no trató de lograr la estimulación de una sola columna sólo con uncaging glutamato, amplitudes máximas tendían a ser ligeramente superior en las espinas cerca del lugar uncaging, mientras que las espinas mostraron más lejos cambios de fluorescencia prácticamente idénticas a la dendrita padres (Figura 6D). Finalmente, se estudió la vía para la entrada de sodio en dendritas y espinas en respuesta a uncaging de glutamato. Para este fin, empleamos CNQX y APV, que son bloqueadores selectivos para los receptores de glutamato de sodio-permeable, ionotrópicos de la AMPA- y NMDA-subtipo, respectivamente. Nuestros resultados muestran que las señales de sodio intracelular inducida por glutamato y las corrientes provocadas somáticas se omitieron en la presencia de estos bloqueadores (Figura 7B). Tras lavado de los bloqueadores, las señales se recuperaron. Esto demuestra That uncaging de glutamato activa los receptores de glutamato ionotrópicos en las neuronas piramidales de CA1, que median el flujo de sodio en las dendritas y espinas, lo que resulta en los transitorios de sodio intracelular y corrientes hacia el interior. <img alt="Figura 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" /> Figura 7. perfil farmacológico de señales de sodio evocados y corrientes hacia el interior. (A) SBFI lleno de CA1 neurona piramidal con parche pipeta (PP) unido a la soma (B) Izquierda:. Transitoria de sodio y la corriente somática inducida por la foto-activación de glutamato enjaulado en una dendrita y espinas adjuntos Centro:. Perfusión con el bloqueadores de los receptores de glutamato ionotrópicos CNQX y APV inhibe tanto la señal de sodio y la corriente hacia el interior inducida por uncaging Derecha:. Tras lavado de los bloqueadores, las señales se restauran. Los represen línea rojact que un ajuste de los datos experimentales. El área gris representa el período en el que el flash uncaging (300 ms) obstruyó la obtención de imágenes de fluorescencia SBFI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para una versión más grande de esta figura.</a>

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Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Se describe la combinación de focal foto-activación inducida por UV de compuestos neuroactivos con células enteras patch-clamp y las imágenes de múltiples fotones de los transitorios de sodio intracelulares en dendritas y espinas de las neuronas del hipocampo en cortes de tejido agudas del cerebro de ratón.

Multi-fotón intracelular de sodio Imaging Combinado con Desembalado focal UV-mediada de glutamato en las neuronas CA1 Piramidal

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K vistas.  Heinrich Heine University Düsseldorf.  Se describe la combinación de focal foto-activación inducida por UV de compuestos neuroactivos con células enteras patch-clamp y las imágenes de múltiples fotones de los transitorios de sodio intracelulares en dendritas y espinas de las neuronas del hipocampo en cortes de tejido agudas del cerebro de ratón. 