Cultivo primario de baja densidad fácil y reproducible utilizando existencias congeladas de neuronas embrionarias del hipocampo

Las reservas congeladas de neuronas embrionarias de rata están listas para usar, y no se requieren técnicas avanzadas para cultivar las células. Esta técnica es muy fácil y no necesita ningún permiso para la experimentación con animales, la organización de animales preñados cronometrados o la disección de embriones. Las neuronas pueden cultivarse en otros vasos de cultivo y aplicarse para otros tipos de experimentos.

Por ejemplo, placas de matriz de microelectrodos para experimentos electrofisiológicos. Comience por recubrir una microplaca de 96 pocillos con 100 microlitros de poli-L-lisina por pocillo. A continuación, incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados.

Al final de la incubación, retire la solución de poli-L-lisina. Lave los platos dos veces con agua esterilizada y una vez con un medio de cultivo fresco sin suplementos. Coloque los platos para que se sequen.

Los platos secos se pueden envolver y almacenar hasta por un mes a cuatro grados centígrados. Para comenzar la siembra celular, agregue 50 microlitros del medio de cultivo a cada pocillo en las placas recubiertas. Llene los pozos periféricos con 200 microlitros de agua esterilizada e incube la placa durante una hora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.

Retire el vial criogénico de la neurona del tanque de nitrógeno líquido y colóquelo en un bloque de calor de 37 grados centígrados para descongelar parcialmente su contenido. Usando una pipeta de un mililitro con una punta de diámetro ancho, transfiera lentamente el contenido de los viales gota a un tubo estéril de 50 mililitros. Enjuague el vial criogénico vacío con un mililitro de medio de cultivo a temperatura ambiente.

Transfiera la solución de enjuague al tubo de 50 mililitros que contiene la suspensión celular. A continuación, agregue nueve mililitros del medio de cultivo a temperatura ambiente gota a gota en el tubo de 50 mililitros, lo que hace que el volumen sea de 11 mililitros. Después de contar las células con un hemocitómetro, transfiera la suspensión celular a un reservorio.

Ahora, utilizando una pipeta multicanal con puntas de diámetro ancho, dispense la suspensión celular con un recuento final de 1,0 veces 10 a las cuatro celdas por pocillo en la placa recubierta de 96 pocillos. Incubar las neuronas durante una o dos horas a 37 grados centígrados bajo 5% de dióxido de carbono. Luego, reemplace el medio de cultivo con 100 microlitros de medio de cultivo precalentado e incube nuevamente en las mismas condiciones.

Después de cuatro días in vitro, añadir citosina beta-D-arabinofuranósido a la concentración final de 0,2 micromolar por pocillo para reducir el crecimiento de las células gliales. Vuelva a colocar la placa en la incubadora. Después de 21 días in vitro, tratar las células con los medicamentos de interés.

Para mantener un control positivo, trate las células con 100 micromolares de glutamato por pocillo durante 10 minutos a 37 grados centígrados antes de la fijación. Antes de realizar estudios inmunocitoquímicos, fijar las células durante 20 minutos reemplazando la solución de cultivo con 100 microlitros de paraformaldehído en cada pocillo. Después de la fijación, lave los pocillos dos veces con 250 microlitros de solución salina tamponada con fosfato por pocillo durante cinco minutos cada uno.

En el presente estudio, las neuronas se desarrollaron normalmente sin intercambiar el medio de cultivo durante tres semanas. La inmunohistoquímica reveló espinas dendríticas positivas para drebrina a lo largo de las dendritas positivas para MAP2. Se observó la reducción dependiente de la dosis de las densidades de racimos de drebrina contra la estimulación del glutamato.

El trasplante de la suspensión celular antes de que se caliente demasiado es muy importante. La adición gota a gota del medio de cultivo también es crucial para evitar cambios repentinos en la osmolaridad.