Los autores agradecen al Dr. Paul Janmey en la Universidad de Pennsylvania para el suministro de las líneas celulares utilizadas en este trabajo. QW también reconoce JF Byfield y Evan Anderson por sus discusiones interesantes sobre las técnicas de AFM.

1. Calibrar la constante del resorte del voladizo <ol><li> Cargar el voladizo en el AFM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Es necesario limpiar el soporte voladizo con etanol antes de cualquier experimento. Esto ayudará a limitar la contaminación bacteriana de la cultura durante las mediciones de AFM. </li><li> Calibrar InvOLS (Inverse Sensibilidad palanca óptica). Este parámetro describe la cantidad de respuesta de fotodiodo (voltios) por nanómetro de deflexión voladizo. </li><li> Cargar un portaobjetos de vidrio limpio en la etapa de la muestra, a continuación, instalar la cabeza AFM y ajustar el haz de láser y la alineación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Enganche la punta del AFM en el portaobjetos de vidrio. </li><li> Con el piezo retirado, vuelva a alinear el espejo a una lectura fotodiodo -2 V. Realizar una medición espectroscopia de fuerza con un punto de disparo (respuesta máxima fotodiodo) de 2 V. </li><li> Con el piezo retirado, vuelva a alinear el espejo a una lectura fotodiodo -2 V. Realizar una force medición espectroscopía con un punto de disparo (respuesta máxima fotodiodo) de 2 V. Nota: Los valores de tensión aquí son específicos para el Asilo de AFM. Este valor debe establecerse de acuerdo con las especificaciones establecidas por el fabricante. Después de la adquisición de datos es completa, hacer zoom en la región firme contacto de la curva de fuerza. Realizar un ajuste lineal a esta región para encontrar la pendiente, que estará en V / nm. El recíproco de este valor describe la sensibilidad óptica del conjunto voladizo-fotodiodo. </li><li> Cambiar la alineación del espejo a una desviación gratuita de 0 V. </li><li> Calibrar la constante de resorte en voladizo. Un método térmico-sintonía se utiliza para determinar la constante del resorte en voladizo 28. </li><li> Después de calibrar los InvOLS, elevar el escáner fuera de la etapa de la muestra de tal manera que no hay interacciones entre la punta y la muestra. </li><li> Comienza la captura de los datos térmicos. Durante este proceso, la vibración térmica de la viga en voladizo es Recorded. El software AFM analiza un espectro de potencia de una vibración y se representa en una ventana de datos térmicos tales. </li><li> Después de unos pocos segundos de adquisición de datos, realizar un ajuste para el segmento de datos centrada en la más baja-frecuencia (resonancia fundamental) pico para determinar la constante del resorte. </li></ol> 2. Carga de la muestra <ol><li> Instale el accesorio calentador del plato en el escenario AFM, si no está ya equipado. </li><li> Ajustar la temperatura a 37 ° C, y esperar 20 minutos para que el sistema alcance un equilibrio térmico estable. </li><li> Coloque la placa de cultivo en la etapa de AFM y fijarlo con la abrazadera suministrada con el calentador de plato. Es importante reducir al mínimo el tiempo entre la retirada de la placa de la incubadora y colocándolo en el escenario, para evitar el trauma a las células. Para las mediciones de más de 30 min, se debe utilizar CO 2 medio independiente para reemplazar el medio de cultivo normal. </li><li> Aplicar una pequeña gota de 37 ° C el medio de cultivo a la punta de tque AFM voladizo, y bajar la cabeza hasta la punta de AFM se acaba sumergido en líquido. </li><li> Uso de la cámara CCD vista superior, vuelva a alinear el haz de láser en el voladizo (la alineación en el líquido será diferente que en el aire, debido al cambio en el índice de refracción del medio). </li><li> Enganche la punta del AFM en una zona limpia de la placa de cultivo. </li><li> Realice la calibración de los InvOLS como se describe anteriormente, para la sensibilidad voladizo en el medio líquido. </li></ol> Nota: a) Si las células se cultivan en hidrogeles, la calibración de InvOLS se debe realizar de antemano contra la superficie inferior de una placa de cultivo lleno de medios de cultivo celular. Al cambiar a muestras de células, la atención especial se ha de pagar para no cambiar la alineación del haz láser con el voladizo. b) InvOLS tiene que ser recalibrado cada vez que hay un cambio en la alineación láser. c) También se recomienda tomar InvOLS como el promedio del valor de varias curvas de calibración, sesde cada calibración genera un diferente InvOLS. La variación en InvOLS es, sin embargo, pequeña en comparación con el valor medio. Por ejemplo, calibrar un DNP-10 cantilever Bruker con constante 0,06 N / m de líquido en 100 veces la primavera producir un valor InvOLS media de 66,3 nm / V, con una desviación estándar de sólo 0,5 nm / V. 3. Recopilación de curvas de fuerza de sangría célula <ol><li> Seleccione una celda para el sangrado. Con la ayuda del microscopio óptico, mover la etapa de posicionar el voladizo por encima de la celda de modo que la punta se encuentra en la región peri-núcleos. Ajuste preciso de la posición de voladizo se puede lograr mediante la aplicación de las compensaciones a las direcciones X e Y escáneres. Nota: El cantilever de AFM tiene que ser retirado de la superficie de la muestra mientras se mueve la etapa de la muestra para seleccionar una célula diana. Esto protege el voladizo de golpear en la muestra, ya que la superficie de la muestra puede no ser plana. </li><li> Cambiar a forzar el modo de Espectroscopía. Establezca la sangríacomprendida dentro de la gama de 1-10 m / seg, lo suficientemente bajas para evitar efectos hidrodinámicos. </li><li> Ajuste del punto de disparo de desviación, lo que limita la fuerza máxima de sangría para evitar daño a las células. Seleccionar la opción de activación relativa, que para corregir cualquier desviación en la señal de deflexión. La fuerza máxima de 2 nN es un buen punto de partida para la mayoría de las muestras. Este valor, sin embargo, debe ser ajustado de acuerdo a la rigidez de la muestra. Para las muestras suaves un valor más bajo se debe utilizar para evitar la sangría excesiva a la muestra. Para las muestras de rigidez un valor alto se debe utilizar para generar indentación medible. </li><li> Ajustar la distancia de la fuerza lo suficientemente grande como para asegurar que la punta estará totalmente separada de la célula entre las medidas de fuerza. Por lo general, la distancia de la fuerza se establece en 5 micras. </li><li> Dirige el AFM para tomar una sola curva de fuerza. </li><li> Recoge al menos tres curvas de fuerza en diferentes lugares en la región peri-núcleos de cada célula. Aunque es beneficioso tomar múltiplescurvas en cada celda de datos estadísticos fiables, teniendo demasiadas curvas de fuerza puede conducir a cambios en la rigidez celular debido a la tensión de la sonda de AFM. </li><li> Cuando la recolección de datos se completa, retire la punta, y repita los pasos 3.1 a 3.6 por tantas células como sea necesario para los buenos datos estadísticos sobre la rigidez celular bajo una cierta condición de muestra. Por lo general, las células 30 se miden para cada condición. </li></ol> Para caracterizar la distribución de la rigidez dentro de una sola célula, se aplica el modo de fuerza-mapa. En el modo de trabajo de ruta, establezca un tamaño de escaneado para incluir la región de interés, establecer una resolución adecuada, establecer los parámetros de sangría que las seleccionadas para las curvas de fuerza individuales, el AFM Luego de trama a través de la zona de muestreo definido y tomar curvas de fuerza individuales en cada pixel en la región de la muestra. 4. Análisis de Datos Las curvas de fuerza registrados se analizaron mediante un procedimiento de encargo MATLAB para calcular la rigidez de células. La siguiente es una breve descripción del procedimiento de MATLAB: <ol><li> El programa MATLAB identifica el punto de contacto coordina z0 y d0 (véase la Figura 1) utilizando un algoritmo adoptado de un método publicado por Lin et al 29.: </li><li> Para cada punto de datos de la curva de fuerza, lleve a cabo un ajuste lineal de los datos a la izquierda del punto de interés, y un modelo de Hertz encaja a la derecha (con el punto seleccionado como el punto inicial de contacto), hasta el conjunto máxima muesca (200-300 nm recomendado). </li><li> Para cada punto, se calcula el error RMS relativa de los dos ataques y la suma de estos valores. </li><li> El punto que alcanza el error de ajuste total mínima es seleccionado como el punto inicial de contacto. Nota: El tiempo de cálculo puede reducirse mediante la aplicación de una búsqueda de sección áurea-en lugar de escaneado linealmente toda la curva de la fuerza. </li><li> Muestra δ deformación y la sangría de la fuerza F se calcula como: <img alt="Ecuación 1"fo: content-width = &quot;3.073in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1.jpg&quot; /&gt; </li><li> Un ajuste de mínimos cuadrados se aplica para adaptarse a la F vs datos δ en la región de post-contacto, z ≥ z 0, para el modelo de Hertz para extraer el módulo de Young, E de la célula: <img alt="Ecuación 2" fo:content-width="2.773in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2.jpg" /> , Donde v es la relación de Poisson. Nota: Cuando δ es más de 10% del espesor de la muestra (altura de la celda), la rigidez de células medido se ve afectada por la rigidez del sustrato. El espesor de la región perinuclear es generalmente del orden de unos pocos micrómetros. Por lo tanto, sólo los primeros 200-300 nm de F-δ curva se ajustan al modelo de Hertz. </li></ol>

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A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+effect+on+RhoA+signaling+modulation+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells.</a> Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de indentación AFM tiene ventajas para caracterizar las propiedades mecánicas de las células vivas. Aunque menos sensible que la citometría de torsión magnético y pinzas ópticas, que puede medir fuerzas en el nivel picoNewton 32, el AFM puede detectar la fuerza de resistencia de las muestras que van desde decenas de pico-Newton a cientos de nano-Newton, comparable a la gama de la fuerza que se puede aplicar a las células utilizando una micropipeta 19. Este rango de la fuerza se a...

Las propiedades mecánicas, especialmente la rigidez, de células individuales y sus matrices extracelulares que rodean (ECM) son fundamentales para muchos procesos biológicos, incluyendo el crecimiento celular, la motilidad, la división, diferenciación, y la homeostasis del tejido. 1 Se ha demostrado que la rigidez mecánica de células está determinada principalmente por el citoesqueleto, especialmente las redes de actina y filamentos intermedios y otras proteínas asociadas con ellos. 2 Los resultados de ensayos mecánicos sobre en redes in vitro de actina y filamentos intermedios sugieren que la mecánica de células es dependiente en gran medida de la estructura del citoesqueleto y la pre-tensión en el citoesqueleto. 3-5 Rigidez de células vivas se considera entonces como un índice para evaluar la estructura del citoesqueleto 6, la actividad de la miosina 7 y muchos otros procesos celulares. Más importante aún, los cambios en las propiedades mecánicas de células también se encuentran a menudo para ser estrechamente asociadosocasionada por la diversas condiciones de enfermedad, tales como la formación de tumores y la metástasis 8-10 Control de la rigidez mecánica de las células vivas por lo tanto, puede proporcionar una nueva manera de controlar la fisiología celular;. para detectar y diagnosticar enfermedades 8;., y para evaluar la eficacia de los tratamientos farmacológicos 11 , 12 Múltiples métodos incluyendo microrheology partícula de seguimiento, 13-16 magnética citometría de torsión, 17 micropipeta aspiración 18,19 y microindentación 20-22 se han desarrollado para medir la elasticidad de las células. Partículas microrheology seguimiento rastrea las vibraciones térmicas de cualquiera de las partículas fluorescentes submicrométricos inyectados en células o marcadores de referencia dentro del citoesqueleto celular. 23 propiedades elásticas y viscosas de células se calculan a partir de los desplazamientos de partículas medidos utilizando el teorema de fluctuación-disipación. 14,23 Este método permite mediciones simultáneas de localespropiedades mecánicas con alta resolución espacial en distintos lugares de una célula. Sin embargo, la inyección de partículas fluorescentes en las células puede conducir a cambios en la función celular, la estructura del citoesqueleto, y por lo tanto la mecánica celular. El método de aspiración con micropipeta se aplica presión negativa en una micropipeta de diámetro varía de 1 a 5 micras para aspirar una pequeña pieza de membrana celular en la pipeta. Rigidez celular se calcula a partir de la presión negativa aplicada y la deformación de la membrana celular. 18 Este método, sin embargo, no puede detectar la distribución heterogénea de la rigidez a través de la célula. Citometría de torsión magnética (MTC) se aplica el campo magnético para generar par de torsión sobre perlas de súper paramagnéticas unidas a la membrana celular. 17 rigidez célula se deriva en este método a partir de la relación entre el par aplicado y la deformación de torsión de la membrana celular. Es difícil controlar la ubicación de perlas magnéticas en el método de MTC, y también es challenging para caracterizar la deformación de torsión con alta resolución. Microindentación se aplica un penetrador con una geometría bien definida para perforar en la célula. La fuerza de penetración y la indentación resultante en las células a menudo siguen la predicción del modelo de Hertz. Módulos de Young de las células se puede calcular a partir de las curvas de fuerza-indentación ajustándolas al modelo de Hertz. Este método ha sido ampliamente aplicado para probar las propiedades mecánicas de los tejidos y las células a pesar de sus limitaciones, tales como la incertidumbre en la determinación del punto de contacto, la aplicabilidad del modelo de Hertz, y el potencial para dañar físicamente las células. Entre los muchos dispositivos para microindentaion 20, el Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) está disponible comercialmente y se ha aplicado ampliamente para caracterizar las propiedades mecánicas de las células y tejidos vivos 21,24-27. En este trabajo se demuestra el procedimiento de utilizar un asilo MFP3D-Bio AFM para caracterizar la mecánica celular. AFM no enLY proporciona topografía de alta resolución de las células, pero también se ha aplicado ampliamente para caracterizar las propiedades mecánicas de las células del tejido. El principio de AFM indentación se ilustra en la Figura 1. El cantilever de AFM se aproxima a la célula desde unos pocos micrómetros más arriba; hace contacto con la célula; guiones la célula de modo que la deflexión voladizo alcanza un punto de consigna preseleccionado, y se aleja de la célula. Durante este proceso, la deflexión en voladizo se registra como una función de su ubicación, como se muestra en la Figura 1. Antes de hacer contacto con la célula, el voladizo se mueve en el medio sin ninguna desviación aparente. Cuando sangría en la célula, las curvas en voladizo y se incrementa la señal de deflexión. Los voladizos se modelan como vigas elásticas para que su desviación es proporcional a la fuerza aplicada a la célula. Al establecer la deflexión máxima en voladizo, la máxima magnitud de la fuerza aplicada a la muestra es limitada para evitar dNingún daño a las células. La porción de la curva de fuerza desde el punto B al punto C en la Figura 1, donde los guiones punta en la célula, se adaptan al modelo de hercios para extraer la rigidez celular. <img src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1highres.jpg"/> Figura 1. Ilustración de la AFM microindentación e interpretación de la curva de fuerza. El panel superior muestra el movimiento de la AFM voladizo accionada por el escáner piezoeléctrico. La ubicación vertical del voladizo z y la deflexión en voladizo señal d se registra durante el proceso. El voladizo se inicia desde el punto a, unos pocos micrómetros por encima de la celda. Al acercarse a la célula, la muestra δ indentación permanece en cero hasta que se alcanza el punto B, donde la punta entra en contacto con la célula. Las coordenadas del punto b en el diagrama son valores críticospara el análisis de datos, que se denota por (z 0, d 0&gt;). De B ​​a C, los guiones en voladizo en la célula hasta que la deflexión voladizo llega a un punto de ajuste, que se ajusta para que sea la relación entre la fuerza de penetración máxima al final del voladizo y la constante del resorte. Una vez que la señal de deflexión alcanza el valor máximo prefijado, el voladizo se retira entonces de la célula al punto d, donde a menudo ser tirado hacia abajo debido a la adhesión de la punta-de la muestra, se separa de la célula y vuelve a su ubicación inicial en el correo. El panel de la derecha ilustra la relación entre la indentación y la z grabada y la señal d. En en el panel inferior izquierdo es un gráfico de una curva representativa fuerza, la indentación máximo de un voladizo, de que la constante del resorte se mide a ser 0.07N / m, se ajusta para que sea 17 nm de manera que la fuerza máxima aplicada a la sangría muestra es 1,2 nN. Los puntos clave durante el sangrado se marcan.

<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>Atomic Force Microscope </td>
<td>Asylum Research</td>
<td>MFP3D-BIO</td>
</tr>
</tbody>
</table>

measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy

Las propiedades mecánicas de las células y la matriz extracelular (ECM) desempeñan papeles importantes en muchos procesos biológicos, incluyendo la diferenciación de células madre, la formación del tumor, y la cicatrización de heridas. Los cambios en la rigidez de las células y ECM son a menudo signos de cambios en la fisiología celular o enfermedades en los tejidos. Por lo tanto, la rigidez de células es un índice para evaluar el estado de los cultivos celulares. Entre la multitud de métodos aplicados para medir la rigidez de las células y tejidos, micro-indentación usando un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) proporciona una manera de medir de forma fiable la rigidez de las células vivas. Este método ha sido aplicado ampliamente para caracterizar la rigidez de micro-escala para una variedad de materiales que van desde superficies metálicas a los tejidos biológicos blandos y células. El principio básico de este método es para sangrar una célula con una punta de AFM de la geometría seleccionada y medir la fuerza aplicada a partir de la flexión del cantilever de AFM. Montaje de la curva fuerza-sangría para el modo de Hertzl para la geometría de la punta correspondiente puede dar mediciones cuantitativas de la rigidez del material. En este trabajo se demuestra el procedimiento para caracterizar la rigidez de las células vivas utilizando AFM. Se demuestran los pasos clave, incluyendo el proceso de calibración de AFM, la adquisición de la fuerza de la curva, y el análisis de datos mediante una rutina de MATLAB. También se discuten las limitaciones de este método.

La Figura 2a muestra tres curvas de fuerza representativas tomadas a partir de fibroblastos 3T3 cultivadas en la superficie de plástico, gel de poliacrilamida de los módulos de Young 3000 Pa y 17.000 Pa, respectivamente. Después de identificar cuidadosamente los puntos de contacto en las curvas, la fuerza de penetración en función de la deformación celular se representa en la Figura 2b. Bajo una fuerza de magnitud menor que 0,3 nN, una forma de pirámide guiones punta 3 micrómetr...

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Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Este documento demuestra un protocolo para caracterizar las propiedades mecánicas de las células vivas por medio de microindentación utilizando un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM).

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

39.6K vistas.  Worcester Polytechnic Institute. Este documento demuestra un protocolo para caracterizar las propiedades mecánicas de las células vivas por medio de microindentación utilizando un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM).

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Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Inmovilización de bacterias para tratamiento de imágenes de microscopía de fuerza atómica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Investigación

Bioingeniería

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

La cuantificación de las propiedades mecánicas de la glicocálix endotelial con la Microscopía de Fuerza Atómica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Un nuevo método para la localización de cuentas fluorescentes Reporter cerca de la superficie de la célula de la cultura para Microscopía de Fuerza de Tracción

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superficie de medición de potencial de bacterias usando Kelvin Sonda de Microscopía de Fuerza

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

En Mapping in situ de las propiedades mecánicas de biopelículas por partículas de seguimiento Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

El uso de la biología sintética para Ingeniero células vivas que interactúan con materiales programables

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Un milímetro a la flexión prueba sistema de la escala para medir las propiedades mecánicas de espículas de esponja marina

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Medición de la proteína sensible a la fuerza dinámica en células vivas usando una combinación de técnicas fluorescentes

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...