Funding for this work, GTK, TK, and JDM were provided by the Wisconsin Institute for Discovery and the Wisconsin Alumni Research Foundation.

1. Generación de Sellos elastoméricos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Para generar maestros de silicio de la estampillas PDMS, diseñar patrones de características de la fotomáscara el uso de software de diseño asistido por ordenador. <ol><li> Diseñar el primer patrón como una matriz de 20 x 20 de los anillos con 300 m de diámetro interior (ID) y 600 OD m con 1.200 m separación de centro a centro. </li><li> Diseñar el segundo patrón como una matriz de 20 x 20 con anillos de 600 micras ID y OD 900 m con 1200 micras separación de centro a centro. </li><li> Además, colocar 1 x 1 mm 2 marcas de referencia cuadrados en las cuatro esquinas de cada gama de diseño espaciados 1.200 m de centro a centro del patrón de esquina en un ángulo de 45 °. </li><li> Fabricar los maestros de silicio para su uso en este experimento con 1: 1 relaciones de aspecto, correlacionando a una profundidad característica de 300 micras usando técnicas de litografía estándar detallados en otra parte 15 o en colaboración con una fundición de microfluidos. NOTA: Característica profundidades inferiores a 100 micras pueden conducir a la deformación anormal de sellos antes de ponerse en contacto con superficies de sustrato. NOTA: Este protocolo comienza con tener maestros de silicio ya obtenidos con los patrones descritos de resina fotosensible, lo que requiere equipo especializado y habitaciones limpias para crear. Lo mejor es consultar con una instalación de fabricante o núcleo para crear estos maestros estampados. </li></ol></li><li> Maestros de silicio silanizar O / N de incubación con (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) vapor de triclorosilano. NOTA: Silano vapor es altamente tóxico y sólo debe ser manejado en una campana de humos química. </li><li> Crear réplicas inversa de los maestros de silicio por la curación de una proporción de 10: 1 de PDMS pre-polímero y agente de PDMS en la parte superior de los maestros de silicio silanizadas curado en un plato de Petri S / N a 60 ° C. </li><li> Retire los sellos de PDMS de los maestros de silicio, y unir los sellos a acrilonitrilo butadieno estireno (ABS) soportes o cualquier otro material rígidos mediante pegamento. NOTA: El material de elección no tiene que ser transparente o biocompatible. Sin embargo, debe proporcionar una superficie plana para la interfaz con el utillaje robótico y una mayor rigidez que PDMS. </li></ol> 2. Preparación de cubreobjetos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Cubreobjetos de microscopio de enjuague (24 mm x 50 mm # 1) en tolueno, metanol y se somete a ultrasonidos en acetona durante 1 min antes de enjuagar con etanol y secado bajo una corriente suave de nitrógeno. NOTA: Manejar tolueno y acetona sólo en una campana de humos química. </li><li> Cubreobjetos Coat con ~ 3.5 nm de titanio (Ti), seguido de 18,0 nm de oro (Au) usando un evaporador de haz de electrones focalizado. NOTA: Este procedimiento es compatible con una variedad de sustratos recubiertos de oro como el silicio y el poliestireno. Mientras que es posible para generar estos en el sitio, los sustratos recubiertos de oro también están disponibles a través de proveedores comerciales. NOTA: Las capas de Ti debe ser al menos de 3 nm de espesor, mientras que las capas de Au sobre sustratos deben ser unt menos 5 nm de espesor y puede oscilar hasta el final a 1 mm de espesor dependiendo de las propiedades ópticas ideales del sustrato final 16,17. Sustratos no están obligados a ser ópticamente claro para la fabricación; sin embargo, se facilita el análisis microscópico de sustratos fabricados. </li><li> Enjuague cubreobjetos recubiertos de oro con etanol y se seca bajo nitrógeno suave inmediatamente antes del uso. </li></ol> 3. R-μCP de externo del anillo <ol style="margin-left: 40px;"><li> Antes de la I-μCP con el sistema de forma selectiva conforme brazo robot articulado (SCARA), calibrar los efectores de herramientas robóticos y sistemas de doble cámara de acompañamiento utilizando el software del sistema. NOTA: Estos implementos se representan en la Figura 1. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg" /> Figura 1. Sistema μCP R y Brazo robótico de herramientas. </strong&gt; (A) vista a gran escala de sistema R-μCP con todas las herramientas y accesorios, (a) de la tirada de vacío, (b) Baño de reactivo, (c) hacia abajo de la cámara, (d) fijación de anidación sello, (e) robótica herramienta. (B) Herramientas robóticas Robótica que representa (f) herramienta de grabado con punta de diamante y (g) la herramienta de succión neumática celebración de una (h) ABS respaldados por el sello PDMS. <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Colocar manualmente un sello PDMS con 600 ID micras y 900 micras OD sobresale anillos boca abajo en el accesorio de anidación sello. Colocar manualmente un coverslide recubierto de oro recién limpiada en la parte superior del mandril de vacío, que se muestra en la Figura 1A, e inmovilizarlo utilizando el vacío de laboratorio conectado. </li><li> Uso de los controles de robot, alinear la cámara que mira hacia abajo sobre el punto de centro de la coverslide recubierto de oro, como en la Figura 2A. NOTA: Este punto inicialmente se puede definir mediante una inspección visual y no requiere de una gran precisión, ya que el sello de PDMS es mucho larger que el portaobjetos recubierto de oro. </li><li> Instruya al brazo robótico para grabar cuatro de referencia &quot;X&quot; marcas en los vértices de un cuadrado con dimensiones de 3,8 mm por 3,8 mm se centraron en la coverslide recubierto de oro con la función de grabado con punta de diamante unido al brazo robótico. (Representado en la figura 2B; proceso automatizado) NOTA: Esto asegura las cuatro marcas de referencia están dentro de un marco visual de la cámara hacia abajo. </li><li> El uso de los robots de herramientas de succión neumática, pick-up y sostienen el PDMS sello 1 mm por encima del accesorio de anidación sello como en la figura 2C. (Proceso automatizado) </li><li> Uso de la cámara que mira hacia arriba y anillo de iluminación LED en la foto en la Figura 2D y E, visualizar marcas de referencia la plaza de la estampillas e identificarlas con el software de la cámara 10 veces con el fin de determinar X promedio del sello, Y y angular desplazamiento desde el centro de la eje de mecanizado del robot. (Proceso automatizado) </li><li> Como en <strong&gt; Figura 2A, utilizar la cámara que mira hacia abajo para visualizar y detectar marcas de referencia grabadas al agua fuerte de la coverslide 10 veces para determinar X de la coverslide promedio, ubicaciones de centros de Y y angular desplazamiento desde el centro del eje de las herramientas del robot. (Proceso automático). NOTA: Un cálculo interno se lleva a cabo por el software del sistema robótico para alinear con precisión el cubreobjetos de X, Y y ubicaciones de los centros compensaciones angulares en los futuros pasos R-μCP de sello y. </li><li> 3.8) Coloque el sello en un baño de alcanotiol iniciador de ATRP, bromoisobutirato ω-mercaptoundecyl (2 mM en etanol) como se muestra en la Figura 2F. (Proceso automatizado) </li><li> Retire el sello de la solución alcanotiol y colóquelo sobre una corriente de nitrógeno presurizado a 0,48 bar (5 psi) para evaporar el etanol como en la figura 2G. Después de 1 min aumentar la presión de la corriente de nitrógeno es de 1,03 bar (15 psi) para asegurar la sequedad uniforme. (Proceso automatizado) NOTA: secado incompleta dará lugar a la pérdida total o parcial del patrón de fidelidad. </li><li> Después del secado, mover el sello sobre la posición del centro calculado de la diapositiva recubierto de oro y lo baja a 100 micras incrementos mientras se controla la fuerza del motor del eje Z como se representa en la figura 2H. NOTA: Este es comunicada como par experimentado por el motor del eje Z y que se muestra en el software de guiado de robots. (Proceso automatizado) </li><li> Detener la reducción del sello una vez que se ha alcanzado la presión predeterminada de 79,2 kPa, y mantener contacto con el portaobjetos recubierto de oro durante 15 s. (Proceso automatizado) NOTA: Los valores de la presión aquí están optimizados para la altura de diseño de sellos y función actual. Si el diseño del sello se cambia, específicamente para sellos de alta relación de aspecto, sintonizar estos en consecuencia de un proceso de ensayo y error. </li><li> Retire lentamente el sello de la diapositiva recubierto de oro y colocar el sello de nuevo en el partido de anidación sello. (Proceso automatizado) </li></ol&gt; 4. SI-ATRP de PEGMEMA en micropatterned cubreobjetos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Suelte la presión de vacío que sostiene la coverslide microestructurada, y transferirla a un matraz Schlenk de 50 ml. Seal y desgasificar el matraz Schlenk utilizando una bomba de vacío. </li><li> Añadir 5,5 ml de mezcla de reacción que contiene el macromonómero ATRP PEGMEMA (208,75 mmol), agua (34,4 ml), metanol (43,8 ml), cobre (II) bromuro de (1 mmol), y 2 &#39;, 2-bipiridina (3 mmol) de el matraz de Schlenk. </li><li> Añadir 0,5 ml de ascorbato L-sodio (454,3 mM) en agua para iniciar la reacción, y permita que se continúe durante 16 horas a temperatura ambiente en atmósfera de gas inerte. NOTA: Después de la adición de ascorbato L-sodio, color de la reacción se desplazará desde el verde claro al marrón oscuro, como se muestra en la Figura 3A-B. NOTA: La reacción puede continuar más allá de 16 horas, pero no va a aumentar de manera significativa la duración de los cepillos de PEG. </li></ol><imgalt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52186 / 52186fig3highres.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Inicio de SI-ATRP. (A) Iniciación de la reacción y (B) posterior cambio de color después de la adición de ascorbato de L-sodio. Imagen (C) Microscopio de superficie coverslide microestructurada siguiente procedimiento SI-ATRP. Barra de escala 1 mm. <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li> Retire la coverslide microestructurada del matraz Schenk y enjuagar con etanol, agua, y etanol y se seca bajo una corriente suave de nitrógeno. NOTA: Después de SI-ATRP, modificaciones de la superficie debe ser visible para el ojo y puede ser fotografiado y analizado bajo un microscopio como en la Figura 3C. NOTA: Este es el método más simple para probar la precisión del ensayo, ya que evita la necesidad de inmunotinción los sustratos. </li></ol> 5. La funcionalización azida de Cadenas micropatterned PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque el coverslide microestructurada en un vial de 20 ml de reacción de vidrio. </li><li> Añadir 6 ml de N, N-dimetilformamida (DMF) que contiene 100 mM de azida de sodio al vial de reacción. Mantener esta reacción a 37 ° C durante 24 hr. NOTA: Manejar DMF sólo en una campana de humos química. Tenga precaución al pesando azida de sodio. </li><li> Al terminar, quitar el coverslide microestructurada del vial de reacción y enjuagar con etanol y después agua y se seca bajo una corriente de nitrógeno. </li></ol> 6. La pasivación de Cadenas bromo funcionalizado PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque coverslide micropatterned en 20 ml viales de reacción de vidrio. </li><li> Añadir 6 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) que contiene etanolamina 100 mM y trietilamina 300 mM al vial de reacción. Mantenga esta reacción a 40 ° C durante 24 horas. NOTA: Manejar DMSO, etanolamina, trietilamina y sólo en una campana de humos química. </li><li> Al finalizar eliminar el coversl microestructuradaide desde el vial de reacción, lavar con etanol y después agua y se seca bajo una corriente de nitrógeno. </li></ol> 7. R-μCP del anillo interiores y SI-ATRP de PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Llevar a cabo los pasos R-μCP como se describió anteriormente en los pasos 3.2 y 3.6 a 3.12, la sustitución de un sello de PDMS con 300 micras y 600 micras ID anillos OD que sobresale, de manera que los anillos con las características más pequeños se colocan en el interior de los anillos previamente micropatterned. NOTA: El umbral de presión para este sello es 132,0 kPa. Como se mencionó anteriormente, estos ajustes de presión están optimizados para las características de cupones se utilizan en este experimento. </li><li> Llevar a cabo los pasos SI-ATRP como se ha descrito anteriormente en los pasos 4.1 a 4.4. </li></ol> 8. El acetileno funcionalización de Cadenas micropatterned PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque coverslide microestructurada en un vial de 20 ml de reacción de vidrio. </li><li> Añadir 6 ml de DMSO que contiene 100 mMpropargilamina al vial de reacción. Mantener esta reacción a TA durante 24 h. NOTA: Manejar DMSO y propargilamina sólo en una campana de humos química. </li><li> Al finalizar eliminar el coverslide microestructurada del vial de reacción y enjuagar con etanol y después agua y se seca bajo una corriente de nitrógeno. </li></ol> 9. Cobre catalizada &quot;Haga clic en&quot; Biotinilación de acetileno Terminado Cadenas PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque coverslide microestructurada en un vial de 20 ml de reacción de vidrio. </li><li> Añadir 6 ml de sulfato de cobre (15 mM) / Tris [(1-bencil-1 H -1,2,3-triazol-4-il) metil] amina (TBTA, 30 mM) (1: 1 v / v de agua / DMF) que contiene 562 mM de azida-PEG 4-biotina conjugado al vial de reacción. Añadir 1,2 ml de ácido L-ascórbico (0,15 mM) en agua a la mezcla para inicializar la reacción. </li><li> Burbujear nitrógeno a través de la solución de reacción durante 10 seg, sellar el vial con Parafilm, y hacer reaccionar durante 24 horas a RT. </li><li> Al completion eliminar coverslide microestructurada del vial de reacción, enjuague con agua y colocarlo en una placa de poliestireno de 12 pocillos. </li></ol> 10. Detección de inmunofluorescencia de Biotinylated acetileno Grupos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bloquear coverslide microestructurada en DPBS (3% burro suero) durante 1 hora a RT. Mancha para grupos de acetileno biotinilados con estreptavidina-546 conjugado (2 mg / ml) en los subproductos de desinfección (3% burro suero en PBS) durante 2 horas a RT. </li><li> Enjuague coverslide microestructurada 5 veces con DPBS durante 10 min con agitación suave. NOTA: La Figura 4B representa una imagen de la corredera después de que se ha completado este paso. </li></ol> 11. Cobre-libre &quot;Haga clic en&quot; Biotinilación de azida Terminado Cadenas PEGMEMA NOTA: Si se desea, esta etapa de modificación del sustrato se puede realizar in situ durante el cultivo celular. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Deja coverslide microestructurada en 12 pocillos pplato olystyrene siguiente DBPs enjuaga. </li><li> Añadir 2 ml de DBP (o medios de cultivo celular) que contiene 20 mM DBCO-PEG 4-biotina, y permitir que esta reacción continúe durante 24 horas a temperatura ambiente (oa 37 ° C en una incubadora). </li><li> Al terminar, enjuague coverslide microestructurada 5 veces con DPBS (o, simplemente, realizar un cambio de los medios de comunicación). </li></ol> 12. Detección de inmunofluorescencia de Biotinylated azida Grupos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Mancha para grupos azida biotinilados con estreptavidina-488 conjugado (2 mg / ml) en 2 ml de DPBS (3% burro suero) durante 2 horas a RT. </li><li> Enjuague coverslide microestructurada 5 veces en DPBS durante 10 min con agitación suave. </li><li> Imagen micropatterned coverslide utilizando microscopio de fluorescencia confocal. Figura 4A-C representa las imágenes de la diapositiva después de que se complete este paso. NOTA: Cuando se utiliza sustratos para ensayos de cultivo de tejidos, omita las secciones 10 y 12 del presente protocolo. Después de la deseada degree de funcionalización, esterilizar el coverslide ingeniería enjuagando ambos lados con etanol al 100% y secado bajo una corriente de nitrógeno. Transferir el portaobjetos a una cabina de seguridad biológica estéril y enjuague el portaobjetos con PBS cinco veces antes de proceder a la siembra y cultivo de células. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments.">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).</li><li>Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet+printing+for+high-throughput+cell+patterning.">Inkjet printing for high-throughput cell patterning.</a> Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).</li><li>Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials.">Biomaterials.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp.">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

Sustratos ideales para la ingeniería de tejidos se recapitulan Bioinspirada y por lo tanto la distribución espacial de los ligandos bioactivos críticos que se encuentran dentro de los tejidos nativos. Ellos también poseer propiedades dinámicas que permiten ajustes temporales de los ligandos y los patrones espaciales en el que se presentan para permitir la morfogénesis de tejidos dirigida y espacialmente restringidas inducción de destino de la célula. La fabricación de este tipo de sustratos requiere la inmovili...

La capacidad de las superficies injertados con PEG para mostrar ligandos bioquímicos covalentemente unidos, manteniendo al mismo tiempo inherentes propiedades no-fouling ellos una opción ideal para entornos de ingeniería de microescala personalizados sobre sustratos de cultivo 1,2,3 hacer. Las interacciones bioespecíficas mediados por ligando conjugado de PEG cepillos permite el análisis reduccionista de los efectos de señales bioquímicas que se encuentran dentro del complejo en microambientes de tejido in vivo en fenotipos de células individuales. Además, las químicas &quot;clic&quot; bio-ortogonales se pueden utilizar para facilitar la inmovilización de ligandos direccional de modo que se presentan en conformaciones nativas 4-6. Por lo tanto, el patrón espacial microescala de PEG cepillos es una herramienta versátil para crear diseñador en nichos vitro para investigar la señalización celular inducida por señales bioquímicas inmovilizados 6,7. Un método común para la generación de patrones espaciales de cu bioquímicaES conlleva sustratos recubiertas de oro (μCP) de impresión por microcontacto con patrones de PEG alcanotioles conjugados. Entonces, las monocapas auto-ensambladas (SAMs) micropatterned de alcanotioles ylated-PEG restringe la adsorción física de las moléculas bioquímicas, por ejemplo, proteínas, sólo para regiones no modelada del sustrato 8,9. Sin embargo, las SAMs generados por esta técnica son sensibles a la oxidación en medios de cultivo celular a largo plazo. Por lo tanto, μCP&#39;d alcanotiol SAMs son a menudo más injerta con cepillos de polímero de PEG mediante transferencia atómica iniciada por superficie polimerización radical (SI-ATRP) para aumentar la estabilidad 10 no ensuciamiento de la región. Específicamente, μCP del iniciador de polimerización alcanotiol, bromoisobutirato ω-meraptoundecyl, sobre superficies recubiertas de oro seguido por SI-ATRP de poli (etilenglicol) metacrilato de metilo éter (PEGMEMA) monómeros genera superficies con microestructurada a largo plazo, estable, y no ensuciamiento PEG cepillos. Además, estos<html> son capaces de ser modificados aún más para presentar restos diversa químicos 11. Aprovechando esta propiedad, Sha et. al. desarrollado un método para diseñar sustratos de cultivo con cepillos PEGMEMA multicomponentes que presentan ortogonales químicas &quot;clic&quot;. En este método, que utilizan una serie de pasos μCP / SI-ATRP intercalados con azida de sodio secuencial, etanolamina, y propargilamina sustituciones nucleófilas para crear sustratos de cultivo a microescala que presentan patrones de múltiples ligandos inmovilizados 6. Mientras que el potencial del uso de tales químicos en conjunción con μCP manual para diseñar nuevos sustratos de cultivo es inmenso, que está limitado por la precisión y la exactitud con la que múltiples pasos μCP se pueden alinear en un único sustrato. Un alto nivel de precisión y exactitud estaría obligado a fabricar de forma reproducible complejo en nichos in vitro utilizando estas técnicas versátiles. e_content &quot;&gt; Para hacer frente a esta limitación, se han generado varios sistemas automatizados μCP y semi-automatizado. Chakra et. al. desarrollado un sistema en el que μCP sellos personalizados se colocan en un sistema ferroviario y ponen en contacto conforme con diapositivas recubiertas de oro que utilizan un accionador neumático controlado por ordenador. Sin embargo, este método requiere la fabricación precisa de sello diseños personalizados e informa de una precisión de 10 micras con ningún informe de la precisión alcanzada cuando se realizan múltiples pasos μCP 12. Más recientemente, un método que utiliza un sistema de acoplamiento cinemático integrada precisión reportada por debajo de 1 m utilizando un único patrón, pero no fueron capaces de alinear con precisión múltiples patrones debido a la falta de un control preciso de las características sello de molde para moldear 13. Además, ambos de los métodos anteriores requieren el sustrato para permanecer fijo entre los pasos de modelado , lo que limita significativamente la diversidad de químicas de modificación de la superficie que pueden serutilizado. A continuación, describimos un sistema R-μCP automatizado capaz de alineamiento exacto y preciso de múltiples pasos μCP al tiempo que permite la máxima flexibilidad en el diseño del sello y de la fabricación. Además, los sustratos estructurados pueden eliminarse repetidamente desde el sistema entre estampados, permitiendo así el uso de diversas composiciones químicas de modificación de sustrato, incluyendo las sustituciones nucleófilas secuenciales. Sustratos de ingeniería uso de tales químicos han sido utilizados para el cultivo celular previamente por tanto nos 6,14 7 y otros. Por lo tanto, hemos fusionado R-μCP y reacciones de sustitución nucleófila secuenciales para desarrollar un método para la fabricación escalable de sustratos de cultivo con señales bioquímicas complejas y micropatterned.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:185px;">Company</td>
			<td style="width:185px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:185px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">SCARA&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Epson</td>
			<td style="width:185px;">LS3-401ST</td>
			<td style="width:185px;">Higher end models with increased precision are available if desired.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:185px;">(TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE</td>
			<td style="width:185px;">Gelest</td>
			<td style="width:185px;">SIT8174.0</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:185px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:185px;">Ellsworth Adhesive Co</td>
			<td style="width:185px;">NC9020938</td>
			<td style="width:185px;">Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:185px;">24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">48393106</td>
			<td style="width:185px;">These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator</td>
			<td style="width:185px;">Telemark</td>
			<td style="width:185px;">SEC-600-RAP</td>
			<td style="width:185px;">Requries specialized training.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">EPSON LS3 SCARA</td>
			<td style="width:185px;">EPSON</td>
			<td style="width:185px;">LS3-401ST</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:185px;">&#969;-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate</td>
			<td style="width:185px;">Prochimia</td>
			<td style="width:185px;">FT 015-m11-0.2</td>
			<td style="width:185px;">Store at -20&#176;C. Other ATRP initiators may be used as this R-&#956;CP platform is applicable to all micropatterning modalities.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Schlenk Tube Flask 50 mL</td>
			<td style="width:185px;">Synthware</td>
			<td style="width:185px;">60003-078</td>
			<td style="width:185px;">Requires rubber stoppers with diaphram.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">447943</td>
			<td style="width:185px;">Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Methanol (Certified ACS)</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">A412-4</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Copper(II) Bromide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">437867</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">2&#39;,2-Bipyridine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">D216305</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Sodium L-Ascorbate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">A4034</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">03-340-4E</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">S2002</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">N,N-dimethyformamide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">227056</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">398136</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Triethylamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">T0886</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">276855</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Propargylamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P50900</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:185px;">University of Wisconsin Material Distribution Services</td>
			<td style="width:185px;">2292</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Azide-PEG3-Biotin</td>
			<td style="width:185px;">ClickChemistryTools</td>
			<td style="width:185px;">AZ104-100</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in DMF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Copper(II) Sulfate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C1297</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">678937</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">A7506</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:185px;">14190144</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:185px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">D9663</td>
			<td style="width:185px;">Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">12-Well Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientifit - NUNC</td>
			<td style="width:185px;">07-200-81</td>
			<td style="width:185px;">Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">DBCO-PEG4-Biotin</td>
			<td style="width:185px;">Clickchemistytools</td>
			<td style="width:185px;">A105P4-10</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in DMF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td style="width:185px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:185px;">S-11223</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate</td>
			<td style="width:185px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:185px;">S-11225</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:185px;">Nikon A1-R Confocal Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:185px;">Nikon Eclipse Ti, A1R</td>
			<td style="width:185px;">An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating complex culture substrates using robotic microcontact printing (r-&#181;cp) and sequential nucleophilic substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

El uso de técnicas μCP alineación manuales para diseñar sustratos de cultivo con matrices de cepillos injertados con PEG funcionalizados con ortogonal &quot;clic&quot; químicas se ha demostrado en trabajos previos 6. Sin embargo, esto ofrece un control mínimo de la orientación de patrón y, a menudo resulta en superposición de áreas funcionalizados. Aquí, un novedoso sistema R-μCP se utiliza para superar esta limitación, y su capacidad de precisión patrón de una matriz de PEG cepillo de anillos ...

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Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &amp;#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

La fabricación de sustratos de cultivo complejas utilizando robótica microcontacto impresión (R-μCP) y secuencial sustitución nucleófila

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

fabricating-complex-culture-substrates-using-robotic-microcontact

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

10.4K vistas.  University of Wisconsin, Madison. Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands. 

Video: Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Investigación

Bioingeniería

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge, arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle cells. Despite optimum drug therapy, heart failure represents a leading cause of mortality and morbidity in the developed world. A major challenge in drug development is the identification of cellular assays that accurately recapitulate normal and diseased human myocardial physiology in vitro. Likewise, the major challenges in regenerative cardiac biology revolve around the identification and isolation of patient-specific cardiac progenitors in clinically relevant quantities. These cells have to then be assembled into functional tissue that resembles the native heart tissue architecture. Microcontact printing allows for the creation of precise micropatterned protein shapes that resemble structural organization of the heart, thus providing geometric cues to control cell adhesion spatially. Herein we describe our approach for the isolation of highly purified myocardial cells from pluripotent stem cells differentiating in vitro, the generation of cell growth surfaces micropatterned with extracellular matrix proteins, and the assembly of the stem cell-derived cardiac muscle cells into anisotropic myocardial tissue.

The generation of aligned myocardial tissue is a key requirement for adapting the recent advances in stem cell biology to clinically useful purposes. Herein we describe a microcontact printing approach for the precise control of cell shape and function. Using highly purified populations of embryonic stem cell derived cardiac progenitors, we then generate anisotropic functional myocardial tissue.

Generación de tejido funcional del miocardio Alineados través de la impresión por microcontacto

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

El cartílago humano Tissue Fabrication Usando tridimensional Tecnología de impresión inyección de tinta

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

Fabricación superhidrófobas materiales poliméricos para aplicaciones biomédicas

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and provide information for follow-up treatment. Here, we demonstrate the development of a cotton-based urinalysis (i.e., nitrite, total protein, and urobilinogen assays) analytical device that employs a lateral flow-based format, and is inexpensive, easily fabricated, rapid, and can be used to conduct multiple tests without cross-contamination worries. Cotton is composed of cellulose fibers with natural absorptive properties that can be leveraged for flow-based analysis. The simple but elegant fabrication process of our cotton-based analytical device is described in this study. The arrangement of the cotton structure and test pad takes advantage of the hydrophobicity and absorptive strength of each material. Because of these physical characteristics, colorimetric results can persistently adhere to the test pad. This device enables physicians to receive clinical information in a timely manner and shows great potential as a tool for early intervention.

To investigate simple fabrication approaches for multiple assay needs, we created a fluid-absorbing channel system made of cotton material. This device was used to establish a multiple detection platform, and solve contamination issues that commonly affect lateral flow-based biomedical devices, for clinical urinalysis of nitrite, total protein, and urobilinogen.

La fabricación de dispositivos analíticos de algodón

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

La expansión de nanoestructurada Los sustratos usando la técnica de la puntada para Nanotopographical modulación del comportamiento de la célula

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabricación de un hidrogel de derivados de matriz extracelular renal corteza

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Four-Dimensional CT Analysis Using Sequential 3D-3D Registration

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data remains difficult because segmentation in all volumetric frames is time-consuming. We aimed to analyze joint kinematics using a sequential 3D-3D registration technique to provide the kinematics of the moving bone with respect to the fixed bone semiautomatically using 4DCT DICOM data and existing software. Surface data of the source bones are reconstructed from 3DCT. The trimmed surface data are respectively matched with surface data from the first frame in 4DCT. These trimmed surfaces are sequentially matched until the last frame. These processes provide positional information for target bones in all frames of the 4DCT. Once the coordinate systems of the target bones are decided, translation and rotation angles between any two bones can be calculated. This 4DCT analysis offers advantages in kinematic analyses of complex structures such as carpal or tarsal bones. However, fast or large-scale motions cannot be traced because of motion artifacts.

We analyzed joint kinematics from four-dimensional computed tomography data. The sequential 3D-3D registration method semiautomatically provides the kinematics of the moving bone with respect to the subject bone from four-dimensional computed tomography data.

Análisis de TC de cuatro dimensiones mediante el registro secuencial 3D-3D

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data ...

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous lipid tubules found in eukaryotic cells. However, in vivo LNTs are highly non-equilibrium structures that require chemical energy and molecular motors to be assembled, maintained, and reorganized. Furthermore, the composition of in vivo LNTs is complex, comprising of multiple different lipid species. Typical methods to extrude LNTs are both time- and labor-intensive, and they require optical tweezers, microbeads, and micropipettes to forcibly pull nanotubes from giant lipid vesicles. Presented here is a protocol for the gliding motility assay (GMA), in which large scale LNT networks are rapidly generated from giant unilamellar vesicles (GUVs) using kinesin-powered microtubule motility. Using this method, LNT networks are formed from a wide array of lipid formulations that mimic the complexity of biological LNTs, making them increasingly useful for in vitro studies of lipid biophysics and membrane-associated transport. Additionally, this method is capable of reliably producing LNT networks in a short time (&#60;30 min) using commonly used laboratory equipment. LNT network characteristics such as length, width, and lipid partitioning are also tunable by altering the lipid composition of the GUVs used for fabricating the networks.

This protocol describes a process for fabricating lipid nanotube networks using gliding kinesin motility in conjunction with giant unilamellar lipid vesicles.

Fabricación de redes de nanotubos lipídicos multicomponente utilizando el ensayo de motilidad de quinesina deslizante

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

Manipulación de células madre y neuronas neuronales únicas en las rebanadas cerebrales mediante la microinyección robótica

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...