We thank Stephan Uphoff for discussions. 
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).

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The authors have nothing to disclose.

Muchos parámetros se pueden variar durante la electroporación de células y adquisición de datos en función del sistema biológico de interés y la naturaleza precisa del experimento (de nivel de celda o el análisis de una sola molécula). Por ejemplo, cuando la electroporación de ADN en bacterias de 0,25 a 5 pmol de fragmentos de dsDNA marcados conduce a una baja eficiencia de la internalización, lo que permite la detección directa de una sola molécula (es decir., Sin la necesidad de photobleaching de antemano). Por encima de 5 pmol ADN de doble cadena, las células tienden a ser muy cargado, un régimen más adecuado para el análisis de una sola célula. Todos los ADNs de la etiqueta también debe ser previamente purificado en gel con el fin de eliminar cualquier rastro de colorante libre (fluoróforo que no ha reaccionado) de la solución de ADN de valores. Además, los posibles problemas con la degradación del ADN, en particular para los experimentos smFRET, pueden abordarse mediante el uso de los ADN con los ácidos nucleicos no naturales, o motivos que protegen termini-exonucleasa accesible como bucles en horquilla. Otra adjustable parámetro en la electroporación es la intensidad de campo aplicada durante la electroporación. La fuerza del campo baja (~ 1 kV / cm) dará lugar a una eficiencia de carga baja adecuada para los estudios de una sola molécula. Intensidades de campo superiores (hasta 1,8 kV / cm) se incrementará la eficiencia de carga; sin embargo, existe una correlación inversa entre la intensidad de campo y la viabilidad celular después de la electroporación (véase la Figura 4). Para referencia, una intensidad de campo normal utilizado para las bacterias y la levadura electroporación es ~ 1,5 kV / cm. La constante de tiempo, que representa la longitud de este decaimiento, es un parámetro conveniente seguir, ya que las gotas constantes de tiempo tan pronto como cualquier fenómeno de formación de arco se produce en la cubeta. En virtud de la configuración normal, la constante de tiempo debe ser mayor que 4 ms; valores más bajos conducirán a una baja eficiencia de carga o células dañadas aún no cargados. La mayoría de electroporators ofrecen otros grados de libertad (tales como &quot;truncamiento pulso&quot; o &quot;forma de impulso&quot;) que puede ser modificado para sintonizar tantocarga de las células y la viabilidad. Hemos aplicado este método para ambas bacterias y levaduras, sin embargo procedimientos similares también deben permitir la internalización de las biomoléculas marcadas en células de mamífero usando los ajustes apropiados electroporador desde su membrana es en realidad menos complejo (una sola bicapa lipídica) y desde la electroporación ya se ha utilizado con tales células 21. Cuando internalizar proteínas marcadas, todo tinte libre necesita ser removido de la solución de proteína de stock etiquetada electroporación antes. Moléculas de colorante gratuitos, debido a su menor tamaño, pueden ser internalizados preferentemente sobre las proteínas de interés, y son difíciles de discriminar durante el análisis de datos (a pesar de su difusión más rápida esperado). Como guía, para una muestra de proteína marcada orgánicamente sea adecuado para la electroporación, la cantidad de colorante libre restante debe ser inferior a 2% (detectada usando el escaneo fluorescente de un SDS-PAGE) 22. Este proceso es particularmente importante,como algunas moléculas podrían pegarse a las membranas externas de bacterias o levaduras electroporadas. A este respecto, la muestra de control negativo debe mostrar la intensidad de fluorescencia por célula claramente inferior a las células electroporadas, idealmente tan bajo como el nivel de autofluorescencia de las células vacías (células que no han sido incubadas con cualquier biomoléculas marcadas con fluorescencia ni electroporadas, Figura 2). Como con dsDNA, la eficiencia de la internalización de proteínas marcadas está vinculada a la cantidad de biomoléculas añadió a las células antes de la electroporación. Sin embargo, otros parámetros, tales como el tamaño y la carga, juegan un papel en la internalización. Las proteínas pequeñas exhiben altas eficiencias de internalización, mientras que las proteínas más grandes (hasta 98 kDa) puede ser internalizado con éxito pero con una eficiencia más baja (Figura 5) 26. El punto isoeléctrico de la proteína, interacciones potenciales con la membrana celular y otros parámetros fisicoquímicos tambiéncarga de las células influencia durante la electroporación. Como resultado, los usuarios necesitan para optimizar los experimentos de su propio sistema, a sabiendas de que una alta concentración inicial de proteína marcada (&gt; 50 micras) y darle la mejor oportunidad para la carga exitosa. La electroporación también ofrece una nueva herramienta para perturbar y analizar la función celular mediante la introducción de proteínas y otras biomoléculas en células (ya sean etiquetados o sin etiqueta). Los experimentos de ARN polimerasa T7 (Figura 5C) presenta un ejemplo de un experimento en el que podemos introducir una biomolécula que puede cambiar la expresión génica in vivo usando electroporación tal. Cuando la realización de experimentos de fluorescencia de una sola molécula, la iluminación TIR generalmente se favorece sobre otros modos de iluminación, ya que ofrece la mejor relación señal-ruido por emocionantes sólo fluoróforos dentro de una sección delgada encima de la superficie cubreobjetos (~ 100 nm). Sin embargo de imagen etiquetada biomoléculas que se difunden dentro de microorganismos vivos podrían volvercuadernillo iluminación más profunda (hasta 0,8 m para E. coli). Iluminación más profunda se consigue en el modo de Hilo, preservando al mismo tiempo una alta relación señal-ruido. Por otro lado, las imágenes de campo amplio es particularmente importante para el análisis photobleaching paso a paso, donde el usuario es la estimación del número de moléculas internalizados por photobleaching una célula cargada entero con alto poder de láser y dividiendo la intensidad inicial de fluorescencia celular por la intensidad unitario producido por una sola molécula (paso photobleaching sola, la Figura 3). También se requiere formación de imágenes de campo amplio para el seguimiento molécula de largo plazo con el fin de localizar las moléculas de difusión de interés incluso si sus trayectorias cubren todo el volumen de la celda. En este protocolo, se presenta cómo electroporación, una técnica estándar para biólogos y bioquímicos para la entrega de ácidos nucleicos en las células, constituye un método simple para la entrega de las biomoléculas fluorescentes en diversos tipos de células. Thes novedoso, técnica de alto rendimiento ofrece una herramienta única de observar moléculas marcadas en su ambiente nativo. En adición biomoléculas marcadas con fluoróforos que cubren una amplia gama de longitudes de onda, la electroporación puede entregar moléculas modificadas con muchos grupos químicos, tales como nucleótidos y aminoácidos no naturales, quelantes de metales, agentes de reticulación, y grupos introducción en jaula. Si el sistema biológico de interés no es esencial para el desarrollo de las células, el gen que codifica para la proteína diana también puede ser borrado (o derribado), asegurando que las proteínas observadas después de la internalización representan todos (o la mayoría) de la piscina intracelular de proteínas . En esencia, la electroporación puede &quot;trasplante&quot; la flexibilidad de bioconjugados in vitro en células vivas y, por tanto, beneficiar los esfuerzos de la biología sintética, la biología de sistemas, y vivo de detección de moléculas individuales en.

La mayoría de los estudios de fluorescencia dentro de las células vivas dependen de fusiones de proteína con proteínas fluorescentes (fps), tales como GFP 1. Estas etiquetas fluorescentes permiten estudios del número de copia, patrón de difusión o la localización de las proteínas implicadas en procesos tales como la expresión de genes o de transporte de membrana 2-7. MF ofrecen una alta especificidad etiquetado, aplicación fácil, y están disponibles en un gran inventario de variantes con diferentes fotofísico y propiedades químicas 1. Sin embargo, fluoróforos orgánicos siguen siendo la elección principal para los experimentos in vitro debido a su mayor fotoestabilidad (hasta 100 veces más estable que los MF) 8,9, pequeño tamaño (hasta 100 veces menor volumen que los MF) y la facilidad de etiquetado intramolecular (principalmente a través de la utilización de residuos de cisteína). Todos estos factores son particularmente importantes para una sola molécula fluorescente y FRET estudios de 10. Varios métodos de internalización combining las ventajas del etiquetado orgánico y en la detección in vivo se han introducido en la última década; sin embargo, tales métodos ya sea emplean polipéptidos relativamente grandes etiquetas (tags por ejemplo, TMP, halo, o 20 kDa SNAP) 11-14, requiere el uso de aminoácidos no naturales 15, o se limita a las células eucariotas grandes, de una sola membrana (por ejemplo. , carga por legrado, jeringa de carga, microinyección) 16-19. Este protocolo describe un novedoso, sencillo y de alto rendimiento método de internalización que las parejas las ventajas de fluoróforos orgánicos con la observación in vivo. Para desarrollar esta técnica, se adaptó el procedimiento de electroporación comúnmente utilizado para transformar las células con el plásmido de ADN 20,21 para cargar microorganismos, tales como E. coli o S. cerevisiae con biomoléculas marcadas orgánicamente. El protocolo consiste en 4 sencillos pasos: la incubación de las células con biomoléculas marcadas,la electroporación, la recuperación celular, y lavado de células para eliminar biomoléculas no internalizadas. A continuación, presentamos este protocolo de electroporación, así como los procesos de formación de imágenes de células y análisis de datos para el estudio de la fluorescencia basada en células y de una sola molécula y FRET señales. La electroporación se basa en la descarga de un campo eléctrico de alta tensión a través de una suspensión de células de baja fuerza iónica para formar poros de la membrana transitorios a través del cual biomoléculas pueden entrar en las células (Figura 1) 20,21. Así como con la transformación de bacterias o levadura con ADN de plásmido, las células tienen que estar preparados antes de la electroporación para asegurar su electrocompetency. Este procedimiento, que consta de varias etapas de lavado con agua, aumenta la permeabilidad de la membrana y disminuye la fuerza iónica de la solución de células para evitar la formación de arco en la cubeta de electroporación. En este protocolo, las células se pueden preparar como se describe a continuación (véase el protocolo: 1,1) o comprados de proveedor comercials. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig1.jpg" /> Figura 1: Representación esquemática del protocolo de internalización De izquierda a derecha:. Añadir unos pocos microlitros de biomoléculas marcadas a la alícuota de células electrocompetentes (fragmentos de ADN doblemente marcada y bacterias en este ejemplo); incubar 1 a 10 min en hielo y transferir a una cubeta de electroporación previamente enfriada; electroporar y luego añadir 0,5 a 1 ml de medio rico a las células inmediatamente después; incubar a 37 ° C (o la temperatura requerida por el organismo, por ejemplo, 29 ° C para la levadura) para permitir que las células se recuperan; realizar 5 etapas de lavado para eliminar cualquier exceso de moléculas que no son internalizados etiquetados; resuspender el sedimento final en 100-200 l de tampón PBS y pipeta de 10 l en una almohadilla de agarosa; cubrir la almohadilla con un cubreobjetos limpio y la imagen en un microscopio de fluorescencia (en el modo de campo amplio o el modo de HILO). <p clculo = &quot;jove_content&quot;&gt; células electrocompetentes se incuban con las biomoléculas marcadas justo antes de la electroporación, las cuales se pueden realizar utilizando electroporators estándar que se encuentran en la mayoría de los laboratorios de bioquímica. Inmediatamente después de la electroporación, las células se incuban en un medio rico que permite su recuperación antes del lavado (Figura 1). El exceso de biomoléculas marcadas no internalizados se retira primero por lavado en un tampón que contiene una concentración bastante alta de sal y un poco de detergente (véase el protocolo: 3,3). La presencia de sal interrumpe interacciones electrostáticas no específicas formados por biomoléculas marcadas no internalizados que de otro modo pueden pegar en la membrana externa. Del mismo modo, la presencia de detergente en el tampón de lavado interrumpe interacciones hidrófobas no específicas. Mientras que la internalización de ADN es directa (Figura 2), las precauciones deben tomarse cuando internalizar proteínas marcadas mediante electroporación. En primer lugar, la muestra de stock de proteína marcada orgánicamente todavía puede contener un pequeño porcentaje de colorante libre. Moléculas de colorante libres son mucho más pequeñas que las proteínas y por lo tanto pueden ser internalizados preferentemente. Para asegurarse de que la gran mayoría de las moléculas fluorescentes internalizadas observadas corresponden a la proteína de interés, la muestra inicial de proteína debe contener menos de ~ 2% de colorante libre (Figura 5) 22. El exceso de proteínas marcadas no internalizados también puede adherirse a la membrana celular externa después de la electroporación; este fenómeno es específico de la proteína y necesita ser comprobada para cada nueva proteína. Proponemos varias opciones que permiten la eliminación de las proteínas no internalizadas de la muestra celular cargado (Ver PROTOCOLO: 3.3.3). Finalmente, las células se resuspenden en un pequeño volumen de tampón de fosfato y se pipetearon en una almohadilla de agarosa, lo que permite su formación de imágenes en un microscopio de fluorescencia. La inmovilización en las almohadillas de agarosa es un simplE y forma eficiente de imágenes de células sobre un cubreobjetos sin dañar su integridad. La almohadilla debe contener un medio de cultivo bajo fluorescencia. Imágenes de células se puede realizar tanto en campo amplio, el total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) o utilizando HILO (muy inclinadas y laminado Hoja óptica) microscopía. En la configuración HILO, el rayo láser penetra más profundamente en la muestra que en TIRF, sin embargo, no se ilumina toda la muestra como para campo amplio, lo que permite una mayor relación señal-ruido 23. Dependiendo de la resolución de energía y el tiempo de láser utilizado, biomoléculas internalizados pueden ser contados (usando análisis por pasos-photobleaching, Figura 3), localizados, o seguido 24-28. Internalización de los constructos doblemente marcada con un par de FRET de fluoróforos permite la cuantificación de FRET tanto a una sola célula o los niveles de una sola molécula (Figura 6). Diferentes parámetros se pueden variardependiendo de la salida deseada y el sistema biológico estudiado. En primer lugar, la cantidad de material interiorizado por célula se puede ajustar mediante la alteración de la concentración de biomoléculas marcadas añadió a las células antes de electroporación (Figura 2). Intensidad de campo electroporación también influir tanto en la eficiencia de carga y la viabilidad celular; como se esperaba, mientras que los aumentos de la eficiencia de carga con el aumento de la intensidad de campo, la viabilidad de las células electroporadas disminuye (Figura 4A). Ambos parámetros pueden ser cuantificados mediante el registro del porcentaje de carga y división de las células después de la electroporación. Este ensayo de viabilidad junto con imágenes de fluorescencia también verifica la observación de biomoléculas internalizados en las células vivas y permite la observación continua durante varias generaciones (Figura 4B). En resumen, este protocolo permite la internalización de la etiqueta fluorescente de ADN y proteínas en moléculasE. coli o S. cerevisiae 26. Las moléculas individuales marcadas con fluoróforos orgánicos pueden ser rastreados con alta resolución espacial y temporal para escalas de tiempo de un orden de magnitud más que los MF. Finalmente, este método es compatible con widefield, TIRF y detección confocal, así como esquemas de excitación pulsada, como ALEX (alternando excitación láser 28,29).

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	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:227px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:321px;">ElectroMax DH5-alpha Comptent cells</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11319-019</td>
			<td>or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">EZ Rich Defined Madia</td>
			<td style="width:227px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">M2105</td>
			<td>low fluorescence rich media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporation Apparatus&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100</td>
			<td>or any classical electroporator for microorganism transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Certified Molecular Biology agarose</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">161-3100</td>
			<td>low fluorescence agarose for agarose pad</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:321px;">Microscope coverslips No 1.5 thickness</td>
			<td style="width:227px;">Menzel</td>
			<td style="width:119px;">BB024060SC</td>
			<td>remove background particles by heating slides in furnace at 500 &#176;C for 1h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Single-molecule fluorescence microscope</td>
			<td style="width:227px;">Home-built</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>described in REFs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Localization software</td>
			<td style="width:227px;">Custom-written, available online</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Tracking software</td>
			<td style="width:227px;">Available online</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>MATLAB implementation by Blair and Dufresne.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

internalization and observation of fluorescent biomolecules in living microorganisms via electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

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Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

Internalización y Observación de fluorescente Biomoléculas en microorganismos que viven a través de electroporación

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.7K vistas.  University of Oxford. Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.