We thank Stephan Uphoff for discussions. 
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).

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The authors have nothing to disclose.

De nombreux paramètres peuvent être modifiés pendant l&#39;électroporation des cellules et d&#39;acquisition de données selon le système biologique d&#39;intérêt et la nature précise de l&#39;expérience (au niveau de la cellule ou molécule unique analyse). Par exemple, lorsque l&#39;ADN par électroporation dans des bactéries, 0,25 à 5 pmoles de fragments d&#39;ADN double brin marqués conduit à une faible efficacité d&#39;internalisation, ce qui permet la détection directe seule molécule (par exemple., Sans avoir besoin de photoblanchiment à l&#39;avance). Au-dessus de 5 pmol ADN double brin, les cellules ont tendance à être lourdement chargé, un régime mieux adapté pour l&#39;analyse unicellulaire. Tous les ADN marqués devraient également être préalablement purifié sur gel pour éliminer toute trace de colorant libre (fluorophore ne ayant pas réagi) de la solution ADN stock. En outre, les problèmes potentiels avec la dégradation de l&#39;ADN, en particulier pour des expériences smFRET, peuvent être réglés par des ADN avec des acides nucléiques non naturels, ou des motifs qui protègent exonucléase accessible terminaisons tels que des boucles en épingle à cheveux. Un autre adjustable paramètre dans électroporation est l&#39;intensité du champ appliqué pendant l&#39;électroporation. Faible intensité de champ (~ 1 kV / cm) conduira à une faible efficacité de chargement approprié pour les études à molécule unique. Intensités de champ plus élevée (jusqu&#39;à 1,8 kV / cm) augmenteront l&#39;efficacité de chargement; Cependant, il existe une corrélation inverse entre l&#39;intensité du champ et la viabilité des cellules après l&#39;électroporation (voir figure 4). Pour référence, une intensité de champ normal utilisé pour les bactéries et la levure est une électroporation à environ 1,5 kV / cm. La constante de temps représentant la durée de cette décomposition, est un paramètre pratique à suivre, car les gouttes de constante de temps dès que tout phénomène d&#39;arc se produit dans la cuvette. D&#39;après les réglages normaux, la constante de temps doit être supérieure à 4 ms; des valeurs inférieures conduiront à une faible efficacité de chargement ou de cellules endommagées, même non-chargées. La plupart des électroporateurs offrent d&#39;autres degrés de liberté (comme &quot;troncature d&#39;impulsion» ou «forme des impulsions&quot;) qui peut être modifiée pour accorder à la foisle chargement et la viabilité cellulaire. Nous avons appliqué cette méthode à la fois les bactéries et les levures, cependant procédures similaires devraient également permettre l&#39;internalisation des biomolécules marquées dans les cellules de mammifère en utilisant les paramètres de électroporateur appropriées depuis leur membrane est en fait moins complexe (unique bicouche lipidique) et depuis l&#39;électroporation a déjà été utilisé avec de telles cellules 21. Lorsque l&#39;internalisation des protéines marquées, tout colorant libre doit être retiré de la solution de protéine marquée des stocks électroporation préalable. Molécules de colorant libres, en raison de leur petite taille, peuvent être internalisés préférentiellement au cours des protéines d&#39;intérêt, et sont difficiles à distinguer lors de l&#39;analyse des données (malgré leur diffusion devrait plus rapide). A titre indicatif, pour un échantillon biologique de la protéine marquée pour être adapté à l&#39;électroporation, la quantité de colorant restant libre doit être inférieure à 2% (balayage à fluorescence détectée à l&#39;aide d&#39;une SDS-PAGE) 22. Ce procédé est particulièrement importante,que certaines molécules pourraient tenir à des membranes externes des bactéries ou des levures par électroporation. À cet égard, l&#39;échantillon de contrôle négatif doit afficher intensité de fluorescence par cellule nettement plus faible que les cellules électroporées, idéalement aussi bas que le niveau de cellules vides (cellules qui ne ont pas été incubées avec des biomolécules marquées par fluorescence, ni électroporation, figure 2) autofluorescence. Comme avec l&#39;ADNdb, l&#39;efficacité d&#39;internalisation des protéines marquées est liée à la quantité de biomolécules ajouté aux cellules avant l&#39;électroporation. Cependant, d&#39;autres paramètres, comme la taille et la charge, jouent un rôle dans l&#39;internalisation. Les petites protéines présentent des rendements élevés d&#39;internalisation, tandis que les protéines plus grandes (jusqu&#39;à 98 kDa) peut être internalisé avec succès, mais avec une efficacité plus faible (figure 5) 26. Le point isoélectrique de la protéine, les interactions potentielles avec la membrane cellulaire et d&#39;autres paramètres physico-chimiques aussiinfluence chargement cellulaire pendant électroporation. En conséquence, les utilisateurs ont besoin pour optimiser les expériences de leur propre système, sachant qu&#39;une forte concentration initiale de protéine marquée (&gt; 50 M) donnera la meilleure chance pour le chargement réussi. Électroporation propose également un nouvel outil de perturber et d&#39;analyser la fonction cellulaire en introduisant des protéines et d&#39;autres biomolécules dans les cellules (soit marqué ou non marqué). Les expériences de la T7 ARN polymerase (Figure 5C) présentent une telle exemples d&#39;une expérience dans laquelle on peut introduire une biomolécule qui peut modifier l&#39;expression de gènes in vivo en utilisant l&#39;électroporation. Lorsque la réalisation d&#39;expériences de fluorescence seule molécule, illumination TIR est généralement privilégiée par rapport à d&#39;autres modes d&#39;éclairage car il offre le meilleur rapport signal-sur-bruit en excitant seulement fluorophores dans une section mince dessus de la surface de lamelle (~ 100 nm). Cependant imagerie de diffusion à l&#39;intérieur des biomolécules marquées micro-organismes vivants peuvent reexiger un éclairage plus profond (jusqu&#39;à 0,8 um pour E. coli). Deeper illumination est réalisée en mode Hilo, tout en préservant un rapport signal-bruit. D&#39;autre part, l&#39;imagerie à grand champ est particulièrement important pour l&#39;analyse de photoblanchiment étapes, où l&#39;utilisateur est l&#39;estimation du nombre de molécules internalisées par photoblanchiment toute une cellule chargée avec une puissance laser élevée et en divisant l&#39;intensité initiale de la fluorescence de la cellule par l&#39;intensité unitaire produite par une seule molécule (l&#39;étape de photoblanchiment unique, figure 3). Imagerie Widefield est également nécessaire pour le suivi de la molécule à long terme afin de localiser les molécules diffusantes d&#39;intérêt même si leurs trajectoires couvrent le volume de cellule entière. Dans ce protocole, nous présentons comment électroporation, une technique standard pour les biologistes et de biochimistes pour délivrer des acides nucléiques dans les cellules, constitue une méthode simple pour délivrer biomolécules fluorescentes dans divers types de cellules. Thest nouvelle technique à haut débit offre un outil unique d&#39;observer des molécules marquées dans leur environnement natif. En d&#39;addition biomolécules marquées avec des fluorophores couvrant une large gamme de longueurs d&#39;onde, l&#39;électroporation peut délivrer des molécules modifiées par de nombreux groupes chimiques, tels que des nucleotides et des acides aminés non naturels, des chélateurs de métaux, des agents de réticulation, et les groupes de mise en cage. Si le système biologique d&#39;intérêt ne est pas indispensable au développement de la cellule, le gène codant pour la protéine cible peut également être supprimée (ou knocked-down), se assurer que les protéines observées après internalisation représentent tous (ou presque) de la piscine de protéine intracellulaire . En substance, l&#39;électroporation peut &quot;greffe&quot; la flexibilité de bioconjugués in vitro dans des cellules vivantes et donc bénéficier des efforts de la biologie synthétique, la biologie des systèmes, et dans la détection de molécule unique vivo.

La plupart des études de fluorescence à l&#39;intérieur des cellules vivantes dépendent de fusions de protéines avec des protéines fluorescentes (MF), comme une GFP. Ces études permettent marqueurs fluorescents du nombre de copies, motif de diffusion ou la localisation des protéines impliquées dans des processus tels que l&#39;expression du gène ou du transport membranaire 2-7. MF offrent la spécificité d&#39;étiquetage haute, la mise en œuvre facile, et sont disponibles dans un grand inventaire des variantes avec divers photophysique et les propriétés chimiques 1. Cependant, fluorophores organiques restent le premier choix pour des expériences in vitro en raison de leur plus grande photostabilité (jusqu&#39;à 100 fois plus stable que MF) 8,9, de petite taille (jusqu&#39;à 100 fois plus petit volume que MF) et la facilité d&#39;étiquetage intramoléculaire (principalement par l&#39;utilisation de résidus de cysteine). Tous ces facteurs sont particulièrement importants pour la fluorescence seule molécule et FRET 10 études. Plusieurs méthodes d&#39;internalisation Combincompris les avantages de l&#39;étiquetage biologique et dans la détection in vivo ont été introduites au cours de la dernière décennie; Cependant, ces méthodes soit emploient relativement importantes polypeptides balises (tags par exemple, TMP, HALO, ou 20 kDa SNAP) 11-14, nécessitent l&#39;utilisation d&#39;acides aminés non naturels 15, ou sont limités à grandes cellules eucaryotes, seule membrane (par exemple. , gratter chargement, seringue chargement, la micro-injection) 16-19. Ce protocole décrit un roman, simple et à haut débit méthode d&#39;internalisation que les couples les avantages de fluorophores organiques avec l&#39;observation in vivo. Pour développer cette technique, nous avons adapté le procédé d&#39;électroporation couramment utilisé pour transformer des cellules avec l&#39;ADN plasmidique 20,21 afin de charger les micro-organismes tels que E. coli ou S. cerevisiae avec des biomolécules organiquement étiquetés. Le protocole se compose de quatre étapes simples: l&#39;incubation des cellules avec des biomolécules marquées,l&#39;électroporation, la récupération des cellules, et le lavage des cellules pour éliminer les biomolécules non-internalisé. Ici, nous présentons ce protocole d&#39;électroporation, ainsi que les procédés d&#39;imagerie cellulaire et d&#39;analyse de données pour étudier la fluorescence à base de cellules et une seule molécule et FRET signaux. L&#39;électroporation de décharge repose sur un champ électrique à haute tension à travers une faible ionique suspension de cellules de force pour former des pores de la membrane à travers laquelle transitoire biomolécules peuvent pénétrer dans les cellules (figure 1) 20,21. Tout comme avec la transformation de bactéries ou de la levure avec de l&#39;ADN plasmidique, les cellules doivent être préparés avant l&#39;électroporation pour assurer leur electrocompetency. Cette procédure, composé de plusieurs étapes de lavage avec de l&#39;eau, augmente la perméabilité de la membrane et réduit la force ionique de la solution de cellules pour éviter un arc électrique dans la cuvette d&#39;électroporation. Dans ce protocole, les cellules peuvent être préparés comme décrit ci-dessous (voir le protocole: 1.1) ou acheté d&#39;un fournisseur commercials. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig1.jpg" /> Figure 1: Représentation schématique du protocole d&#39;internalisation De gauche à droite:. Ajouter quelques microlitres de biomolécules marquées à l&#39;aliquote de cellules électrocompétentes (fragments d&#39;ADN doublement marquée et les bactéries dans cet exemple); incuber 1 à 10 minutes sur de la glace et à transférer une cuvette d&#39;électroporation de pré-refroidi; électroporer puis ajouter 0,5 à 1 ml de milieu riche pour les cellules immédiatement après; incuber à 37 ° C (ou la température requise par l&#39;organisme, par exemple, 29 ° C pour les levures) pour laisser les cellules se rétablir; effectuer des 5 étapes de lavage pour enlever l&#39;excédent non-internalisées molécules marquées; remettre en suspension le culot final dans 100-200 pi de tampon PBS et pipette 10 ul sur un tampon d&#39;agarose; couvrir le pad avec une lamelle nettoyé et image sur un microscope à fluorescence (en mode grand champ ou en mode HILO). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; cellules électrocompétentes sont incubées avec les biomolécules marqués juste avant électroporation, qui peuvent être effectuées à l&#39;aide électroporateurs standards trouvés dans la plupart des laboratoires de biochimie. Immédiatement après l&#39;électroporation, les cellules sont incubées dans un milieu riche qui permet leur récupération avant de les laver (Figure 1). L&#39;excès de biomolécules marquées non-internalisées est d&#39;abord éliminé par lavage dans un tampon contenant une concentration relativement élevée de sel et un peu de détergent (Voir PROTOCOLE: 3,3). La présence de sel perturbe interactions électrostatiques non spécifiques formés par des biomolécules marquées non internalisés qui autrement peuvent coller sur la membrane externe. De même, la présence de détergent dans le tampon de lavage perturbe interactions hydrophobes non spécifiques. Alors que l&#39;ADN internalisation est simple (Figure 2), des précautions doivent être prises lors de l&#39;internalisation des protéines marquées à l&#39;aide de l&#39;électroporation. Tout d&#39;abord, le stock échantillon de protéines organiquement marqué pourrait encore contenir un petit pourcentage de colorant libre. Molécules de colorant libres sont beaucoup plus petites que les protéines et pourraient donc être internalisés préférentiellement. Pour se assurer que la grande majorité des molécules fluorescentes internalisés observées correspondent à la protéine d&#39;intérêt, l&#39;échantillon de protéine initiale doit contenir moins de 2% de colorant ~ libre (Figure 5) 22. L&#39;excès de protéines marquées non-internalisées peut également tenir à la membrane cellulaire externe après l&#39;électroporation; ce phénomène est spécifique à la protéine et doit être vérifié pour chaque nouvelle protéine. Nous vous proposons plusieurs options qui permettent l&#39;élimination des protéines non-intériorisée de l&#39;échantillon de cellules chargé (Voir PROTOCOLE: 3.3.3). Enfin, les cellules sont remises en suspension dans un petit volume de tampon phosphate et un tampon pipette sur agarose, ce qui permet leur image sur un microscope à fluorescence. Immobilisation sur des patins agarose est un simple et moyen efficace de l&#39;imagerie des cellules sur une lamelle sans nuire à leur intégrité. Le tampon doit contenir un milieu de culture à faible fluorescence. Imagerie cellulaire peut être effectuée soit en champ large, totale fluorescence à réflexion interne (FRBR) ou en utilisant HILO (fortement inclinées et laminé feuille optique) microscopie. Dans la configuration HILO, le faisceau laser pénètre plus profondément dans l&#39;échantillon que dans TIRF, mais ne se allume pas tant que la totalité de l&#39;échantillon de grand champ, ce qui permet un plus grand rapport 23 signal-sur-bruit. En fonction de la résolution de la puissance du laser et le temps utilisé, les biomolécules peuvent être internalisés comptées (à l&#39;aide de l&#39;analyse pas à pas-photoblanchiment, figure 3), localisées, suivies ou 24-28. L&#39;internalisation des constructions doublement marquée avec une paire de fluorophores de FRET permet la quantification de FRET tant au unicellulaire ou niveaux seule molécule (figure 6). Différents paramètres peuvent être modifiésen fonction de la sortie souhaitée et le système biologique étudié. Tout d&#39;abord, la quantité de matière internalisé par la cellule peut être réglée en modifiant la concentration de biomolécules marquées ajouté aux cellules avant l&#39;électroporation (figure 2). l&#39;intensité de champ d&#39;électroporation aura aussi une influence à la fois l&#39;efficacité de chargement et la viabilité des cellules; comme prévu, tandis que l&#39;efficacité de chargement augmente avec l&#39;intensité du champ, la viabilité des cellules électroporées diminue (figure 4A). Les deux paramètres peuvent être quantifiés en enregistrant le pourcentage de charge et la division des cellules après l&#39;électroporation. Ce dosage de la viabilité couplée à l&#39;imagerie de fluorescence vérifie également l&#39;observation des biomolécules internalisés dans les cellules vivantes et permet une observation continue sur plusieurs générations (figure 4B). En résumé, ce protocole permet l&#39;internalisation des marquées par fluorescence des molécules ADN et de protéines dansE. coli ou S. 26 cerevisiae. Les molécules individuelles marquées avec des fluorophores organiques peuvent être suivis avec la résolution spatio-temporelle élevée pour des échelles de temps un ordre de grandeur plus de médecins de famille. Enfin, cette méthode est compatible avec grand champ, la FRBR et la détection confocale, ainsi que des systèmes d&#39;excitation pulsés, comme ALEX (alternant excitation laser 28,29).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="834">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:227px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:321px;">ElectroMax DH5-alpha Comptent cells</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11319-019</td>
			<td>or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">EZ Rich Defined Madia</td>
			<td style="width:227px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">M2105</td>
			<td>low fluorescence rich media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporation Apparatus&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100</td>
			<td>or any classical electroporator for microorganism transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Certified Molecular Biology agarose</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">161-3100</td>
			<td>low fluorescence agarose for agarose pad</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:321px;">Microscope coverslips No 1.5 thickness</td>
			<td style="width:227px;">Menzel</td>
			<td style="width:119px;">BB024060SC</td>
			<td>remove background particles by heating slides in furnace at 500 &#176;C for 1h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Single-molecule fluorescence microscope</td>
			<td style="width:227px;">Home-built</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>described in REFs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Localization software</td>
			<td style="width:227px;">Custom-written, available online</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Tracking software</td>
			<td style="width:227px;">Available online</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>MATLAB implementation by Blair and Dufresne.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

internalization and observation of fluorescent biomolecules in living microorganisms via electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

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Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

Internalisation et l&#39;Observation des Biomolécules Fluorescent In Living micro-organismes par électroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.7K vues.  University of Oxford. Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.