We thank Stephan Uphoff for discussions. 
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).

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The authors have nothing to disclose.

Molti parametri possono essere variati durante elettroporazione cellulare e acquisizione dati a seconda del sistema biologico di interesse e la precisa natura dell&#39;esperimento (a livello di cella o l&#39;analisi singola molecola). Ad esempio, quando electroporating DNA in batteri, 0,25-5 pmol di frammenti marcati dsDNA porta ad una bassa efficienza interiorizzazione, permettendo il rilevamento diretto singola molecola (es., Senza la necessità di photobleaching anticipo). Sopra 5 pmol dsDNA, le cellule tendono ad essere pesantemente caricato, un regime più adatto per l&#39;analisi singola cellula. Tutti DNA etichettati dovrebbero essere precedentemente gel purificato per eliminare ogni traccia di colorante libero (fluoroforo non reagito) dalla soluzione di DNA magazzino. Inoltre, i potenziali problemi con la degradazione del DNA, in particolare per gli esperimenti smFRET, possono essere affrontate utilizzando DNA con acidi nucleici innaturali, o motivi che proteggono exonuclease accessibili termini come loop tornanti. Un&#39;altra adjustablparametro e in elettroporazione è l&#39;intensità del campo applicato durante elettroporazione. Intensità bassa di campo (~ 1 kV / cm) porterà ad una bassa efficienza di carico appropriata per gli studi singola molecola. Intensità di campo più elevate (fino a 1,8 kV / cm) aumenterà l&#39;efficienza di carico; Tuttavia, vi è una correlazione inversa tra intensità di campo e vitalità cellulare dopo elettroporazione (vedere Figura 4). Per riferimento, una intensità di campo normale usati per batteri e lieviti elettroporazione è ~ 1,5 kV / cm. La costante di tempo, che rappresenta la lunghezza di questo decadimento, è un parametro conveniente seguire, poiché la costante di tempo gocce non appena si verifica alcun fenomeno arco nella cuvetta. In Impostazioni normali, la costante di tempo deve essere superiore a 4 ms; valori più bassi porterà a bassa efficienza di carico o cellule danneggiate anche non caricati. La maggior parte elettroporatori offrono altri gradi di libertà (come &quot;troncamento impulsi&quot; o &quot;pulse forma&quot;) che può essere modificato per sintonizzare siacarico delle cellule e la vitalità. Abbiamo applicato questo metodo per entrambi i batteri e lieviti, tuttavia procedure analoghe dovrebbero anche consentire l&#39;internalizzazione di biomolecole marcati nelle cellule di mammifero utilizzando appropriate impostazioni elettroporatore dal loro membrana è in realtà meno complessa (singolo doppio strato lipidico) e dal elettroporazione è già stato utilizzato con tali cellule 21. Quando internalizzazione proteine ​​marcate, tutto colorante libero deve essere rimosso dal marcato soluzione proteica magazzino prima elettroporazione. Molecole di colorante libero, a causa delle loro dimensioni più piccole, possono essere internalizzati preferenzialmente sulle proteine ​​di interesse, e sono difficili da distinguere durante l&#39;analisi dei dati (nonostante la loro diffusione più veloce previsto). Come guida, per un campione di proteina marcata organicamente sia adatto per elettroporazione, la quantità di colorante libero residuo deve essere inferiore al 2% (rilevato utilizzando scansione fluorescenza di una SDS-PAGE) 22. Questo processo è particolarmente importante,come alcune molecole potrebbero attaccarsi alle membrane esterne di batteri o lieviti elettroporate. A questo proposito, il campione di controllo negativo dovrebbe visualizzare l&#39;intensità di fluorescenza per cella nettamente inferiore cellule elettroporate, idealmente a partire da livello autofluorescenza di celle vuote (cellule che non sono stati incubati con eventuali biomolecole fluorescente né elettroporate, Figura 2). Come con dsDNA, l&#39;efficienza internalizzazione di proteine ​​marcate è legato alla quantità di biomolecole aggiunti alle cellule prima di elettroporazione. Tuttavia, altri parametri, quali le dimensioni e la carica, giocano un ruolo nella internalizzazione. Piccole proteine ​​presentano efficienze elevate internalizzazione, mentre le proteine ​​più grandi (fino a 98 kDa) possono essere internalizzati con successo ma con minore efficienza (Figura 5) 26. Il punto isolelectric della proteina, potenziali interazioni con la membrana cellulare e gli altri parametri fisico ancheinfluenza cella di carico durante elettroporazione. Come risultato, gli utenti devono ottimizzare esperimenti per il proprio sistema, sapendo che un&#39;alta concentrazione iniziale di proteina marcata (&gt; 50 pM) darà le migliori possibilità di successo per il caricamento. Elettroporazione offre anche un nuovo strumento per turbare e analizzare la funzione cellulare introducendo proteine ​​e altre biomolecole in cellule (o etichettati o senza etichetta). Gli esperimenti T7 RNA polimerasi (Figura 5C) presenti un esempio di un esperimento in cui possiamo introdurre una biomolecola che può cambiare l&#39;espressione genica in vivo utilizzando elettroporazione. Quando si esegue esperimenti fluorescenza singola molecola, illuminazione TIR è solitamente favorita rispetto altre modalità di illuminazione in quanto offre il miglior rapporto segnale-rumore di soli eccitanti fluorofori all&#39;interno di una sezione sottile sopra la superficie coprioggetto (~ 100 nm). Tuttavia di imaging etichettati biomolecole diffondono all&#39;interno microrganismi viventi potrebbero riquire illuminazione più profondo (fino a 0,8 micron per E. coli). Illuminazione più profondo si ottiene in modalità HILO, mantenendo un alto rapporto segnale-rumore. D&#39;altra parte, l&#39;imaging ampio campo è particolarmente importante per l&#39;analisi fotoscolorimento graduale, in cui l&#39;utente sta valutando il numero di molecole internalizzati dalle photobleaching un&#39;intera cellula caricato con elevato potere laser e dividendo l&#39;intensità iniziale fluorescenza cellulare dall&#39;intensità unitaria prodotta da una singola molecola (passo singolo photobleaching, Figura 3). Immagini Widefield è richiesta anche per il monitoraggio molecola a lungo termine, al fine di localizzare le molecole diffondenti di interesse, anche se le loro traiettorie coprono l&#39;intero volume delle cellule. In questo protocollo, presentiamo come elettroporazione, una tecnica standard per i biologi e biochimici per la consegna acidi nucleici nelle cellule, costituisce un metodo semplice per la consegna di biomolecole fluorescenti in vari tipi di cellule. Thè romanzo, la tecnica high-throughput offre uno strumento unico per osservare molecole marcate nel loro ambiente nativo. In aggiunta biomolecole marcate con fluorofori che coprono una vasta gamma di lunghezze d&#39;onda, elettroporazione può trasportare molecole modificate con molti gruppi chimici, come i nucleotidi innaturali e aminoacidi, chelanti di metalli, reticolanti, e gruppi di ingabbiamento. Se il sistema biologico che interessa non è essenziale per lo sviluppo delle cellule, il gene codificante per la proteina bersaglio può anche essere eliminato (o smontati), assicurando che le proteine ​​osservati dopo interiorizzazione rappresentano tutti (o quasi) della piscina proteina intracellulare . In sostanza, elettroporazione può &quot;trapianto&quot; la flessibilità di bioconiugati in vitro in cellule viventi e quindi beneficiare sforzi in biologia sintetica, la biologia dei sistemi, e in vivo rilevazione singola molecola.

La maggior parte degli studi di fluorescenza all&#39;interno delle cellule viventi dipendono fusioni di proteine ​​con proteine ​​fluorescenti (PQ), come la GFP 1. Questi tag fluorescenti permettono studi il numero di copie, modello di diffusione o la localizzazione di proteine ​​coinvolte in processi come l&#39;espressione del gene o il trasporto di membrana 2-7. PQ offrono alta specificità etichettatura, facile implementazione, e sono disponibili in una grande inventario di varianti con diversi fotofisiche e chimiche 1. Tuttavia, fluorofori organici rimangono la prima scelta per gli esperimenti in vitro a causa della loro maggiore fotostabilità (fino a 100 volte più stabile rispetto PQ) 8,9, di piccole dimensioni (fino a 100 volte il volume più piccolo di PQ) e la facilità di etichettatura intramolecular (principalmente attraverso l&#39;uso di residui di cisteina). Tutti questi fattori sono particolarmente importanti per la singola molecola fluorescenza e FRET 10 studi. Diversi metodi di internalizzazione combining i vantaggi di etichettatura biologica e nel rilevamento vivo sono state introdotte negli ultimi dieci anni; tuttavia, tali metodi o impiegano polipeptidi relativamente grandi etichette (tag ad esempio, TMP, HALO, o 20 kDa SNAP) 11-14, richiede l&#39;uso di aminoacidi naturali 15, o si limitano a grandi, single-membrana delle cellule eucariotiche (ad es. , raschiare il carico, la siringa di carico, microiniezione) 16-19. Questo protocollo descrive un romanzo, semplice e high-throughput metodo interiorizzazione che le coppie i vantaggi di fluorofori organici con l&#39;osservazione in vivo. Per sviluppare questa tecnica, abbiamo adattato la procedura di elettroporazione comunemente usato per trasformare cellule con DNA plasmidico 20,21 per caricare microrganismi, come E. coli o S. cerevisiae con biomolecole etichettati organicamente. Il protocollo si compone di 4 semplici passi: l&#39;incubazione di cellule con biomolecole marcate,elettroporazione, recupero di cellule, e il lavaggio delle cellule per rimuovere biomolecole non interiorizzato. Qui, vi presentiamo questo protocollo elettroporazione, così come i processi di imaging cellulare e di analisi dei dati per lo studio di fluorescenza delle cellule-based e singola molecola e Fret segnali. Elettroporazione si basa su scaricando un campo elettrico ad alta tensione attraverso una sospensione di cellule forza ionica basso per formare pori della membrana transitori attraverso cui biomolecole possono entrare cellule (Figura 1) 20,21. Come con la trasformazione di batteri o lieviti con DNA plasmidico, le cellule devono essere preparati prima elettroporazione per garantire la loro electrocompetency. Questa procedura, composti di più fasi di lavaggio con acqua, aumenta la permeabilità della membrana e riduce la forza ionica della soluzione cellulare per evitare la formazione di archi nella cuvetta elettroporazione. In questo protocollo, le cellule possono essere preparati come descritto di seguito (Vedi PROTOCOLLO: 1.1) o acquistati dai provider commerciales. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig1.jpg" /> Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo interiorizzazione Da sinistra a destra:. Aggiungere qualche microlitri di biomolecole etichettati alla aliquota di cellule electrocompetent (frammenti di DNA doppiamente marcati e batteri in questo esempio); incubare 1 a 10 min in ghiaccio e versare in un elettroporazione cuvetta pre-raffreddata; elettroporazione e quindi aggiungere 0,5-1 ml terreno ricco alle cellule immediatamente dopo; incubare a 37 ° C (o la temperatura richiesta dall&#39;organismo, ad esempio, 29 ° C per il lievito) per permettere alle cellule recuperare; effettuare 5 fasi di lavaggio per eliminare ogni-non interiorizzate molecole marcate in eccesso; risospendere il pellet finale in 100-200 ml di tampone PBS e pipetta 10 ml su un pad agarosio; coprire il pad con un coprioggetto pulito e immagine su un microscopio a fluorescenza (in modalità campo largo o modalità HILO). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; celle Electrocompetent vengono incubate con le biomolecole marcate poco prima elettroporazione, che possono essere eseguite utilizzando elettroporatori standard che si trovano nella maggior parte dei laboratori di biochimica. Immediatamente dopo l&#39;elettroporazione, le cellule sono incubate in un terreno ricco permettendo loro recupero prima del lavaggio (Figura 1). L&#39;eccesso di biomolecole etichettati non internalizzati viene prima rimosso mediante lavaggio in un tampone contenente un piuttosto elevata concentrazione di sale e detersivo (Vedere PROTOCOLLO: 3.3). La presenza di sale interrompe non specifici interazioni elettrostatiche formate da biomolecole etichettati non internalizzati che altrimenti potrebbero attaccarsi sulla membrana esterna. Analogamente, la presenza di detersivo nel tampone di lavaggio interrompe non specifiche interazioni idrofobiche. Mentre internalizzazione DNA è semplice (figura 2), le precauzioni devono essere prese quando interiorizzare proteine ​​marcate con elettroporazione. Innanzitutto, il campione di proteina marcata azione biologica potrebbe ancora contenere una piccola percentuale di colorante libero. Molecole di colorante liberi sono molto più piccoli di proteine ​​e possono quindi essere internalizzati preferenzialmente. Per garantire che la stragrande maggioranza delle molecole fluorescenti internalizzati osservati corrispondono alla proteina di interesse, il campione iniziale proteine ​​deve contenere meno di ~ 2% colorante libero (Figura 5) 22. L&#39;eccesso di proteine ​​marcate non internalizzati può anche aderire alla membrana cellulare esterna dopo l&#39;elettroporazione; questo fenomeno è specifico di proteine ​​e deve essere controllata per ogni nuova proteina. Proponiamo diverse opzioni che consentono la rimozione delle proteine ​​non interiorizzato dal campione di cellule caricato (Vedere PROTOCOLLO: 3.3.3). Infine, le cellule sono risospese in un piccolo volume di tampone fosfato e pipettati su un pad agarosio, permettendo loro di imaging su un microscopio a fluorescenza. Immobilizzazione sui rilievi agarosio è un simple e modo efficace di formazione immagine celle su un copri senza danneggiare la loro integrità. Il tampone dovrebbe contenere un terreno di coltura a bassa fluorescenza. L&#39;imaging cellulare può essere effettuata sia in widefield, riflessione interna totale in fluorescenza (TIRF) oppure utilizzando HILO (fortemente inclinato e laminato Sheet Optical) microscopia. Nella configurazione HILO, il raggio laser penetra più profondamente nel campione che in TIRF, ma non illuminare l&#39;intero campione da per widefield, consentendo un maggior rapporto di 23 segnale-rumore. A seconda della risoluzione potenza del laser e l&#39;ora utilizzate, biomolecole internalizzati possono essere contati (mediante analisi stepwise photobleaching, Figura 3), localizzati o tracciati 24-28. Internalizzazione dei costrutti doppiamente etichettati con un paio di FRET fluorofori consente la quantificazione di FRET sia a singola cellula o livelli di singola molecola (Figura 6). Diversi parametri possono essere variatia seconda dell&#39;uscita desiderata e il sistema biologico studiato. In primo luogo, la quantità di materiale internalizzato per cella può essere regolato modificando la concentrazione di biomolecole etichettati aggiunto al cellule prima elettroporazione (Figura 2). Intensità di campo elettroporazione influenzerà anche sia l&#39;efficienza di carico e la vitalità cellulare; come previsto, mentre il rendimento di carico aumenta con l&#39;aumentare intensità di campo, la vitalità delle cellule elettroporate diminuisce (Figura 4A). Entrambi i parametri possono essere quantificate registrando la percentuale di carico e di divisione delle cellule dopo l&#39;elettroporazione. Questo test vitalità accoppiata con imaging di fluorescenza verifica anche l&#39;osservazione di biomolecole internalizzate nelle cellule viventi e lasciare continua osservazione per diverse generazioni (Figura 4B). In sintesi, questo protocollo permette l&#39;internalizzazione delle contrassegnati in modo fluorescente di DNA e proteine ​​in molecoleE. coli o S. CEREVISIAE 26. Molecole individuali marcate con fluorofori organici possono essere monitorati con alta risoluzione spazio-temporale per tempi un ordine di grandezza superiore a PQ. Infine, questo metodo è compatibile con widefield, TIRF e rilevazione confocale, nonché sistemi di eccitazione a impulsi, come ALEX (alternata laser di eccitazione 28,29).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="834">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:227px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:321px;">ElectroMax DH5-alpha Comptent cells</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11319-019</td>
			<td>or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">EZ Rich Defined Madia</td>
			<td style="width:227px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">M2105</td>
			<td>low fluorescence rich media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporation Apparatus&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100</td>
			<td>or any classical electroporator for microorganism transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Certified Molecular Biology agarose</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">161-3100</td>
			<td>low fluorescence agarose for agarose pad</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:321px;">Microscope coverslips No 1.5 thickness</td>
			<td style="width:227px;">Menzel</td>
			<td style="width:119px;">BB024060SC</td>
			<td>remove background particles by heating slides in furnace at 500 &#176;C for 1h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Single-molecule fluorescence microscope</td>
			<td style="width:227px;">Home-built</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>described in REFs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Localization software</td>
			<td style="width:227px;">Custom-written, available online</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Tracking software</td>
			<td style="width:227px;">Available online</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>MATLAB implementation by Blair and Dufresne.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

internalization and observation of fluorescent biomolecules in living microorganisms via electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

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Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

Internalizzazione e di osservazione di Fluorescent Biomolecole in Living microrganismi via elettroporazione

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.7K Views.  University of Oxford. Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.