We thank Stephan Uphoff for discussions. 
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Muitos parâmetros podem variar durante a electroporação de células e de aquisição de dados, dependendo do sistema biológico de interesse e a natureza exacta da experiência (de nível celular ou análise de uma única molécula). Por exemplo, quando electroporating ADN em bactérias de 0,25 a 5 pmol de fragmentos de dsDNA marcados conduz a uma baixa eficiência de internalização, permitindo que uma única molécula de detecção directa (isto é., Sem a necessidade de fotobranqueamento previamente). Acima de 5 pmol dsDNA, as células tendem a ser muito carregado, um regime mais adequado para a análise de uma única célula. Todos os DNAs marcados devem também ser previamente, a fim de eliminar qualquer vestígio de corante livre purificado em gel (fluoróforo não reagiu) a partir da solução de DNA. Além disso, possíveis problemas com a degradação do DNA, especialmente para experimentos smFRET, podem ser tratadas usando DNAs com ácidos nucleicos não naturais, ou motivos que protegem terminais exonuclease acessível como loops hairpin. Outra adjustable em parâmetro de electroporação é a força do campo aplicado durante electroporação. Força Low campo (~ 1 kV / cm) vai levar a uma baixa eficiência de carga apropriado para estudos de molécula única. Maior força de campo (até 1,8 kV / cm) irá aumentar a eficiência de carregamento; No entanto, existe uma correlação inversa entre a intensidade do campo e a viabilidade celular após a electroporação (ver Figura 4). Para referência, uma intensidade de campo normal utilizado para bactérias e leveduras electroporação é ~ 1,5 kV / cm. A constante de tempo, que representa o comprimento deste deterioração, é um parâmetro conveniente para seguir, uma vez que as gotas de constantes de tempo, assim que qualquer formação de arco fenómeno ocorre na cuvete. Em configurações normais, a constante de tempo deve ser superior a 4 ms; valores mais baixos levará a baixa eficiência de carga ou células danificadas, mesmo não-carregados. A maioria dos outros electroporators oferecer graus de liberdade (tais como &quot;truncagem de impulso&quot; ou &quot;forma de pulso&quot;) que pode ser modificado para ajustar tantocarregamento e viabilidade celular. Aplicou-se este método para ambas as bactérias e leveduras, contudo procedimentos semelhantes também deve permitir a internalização de biomoléculas marcadas em células de mamíferos usando o electroporador configurações adequadas desde a sua membrana é, na verdade, menos complexo (única bicamada lipídica), e uma vez que já electroporação foi usado com tais células 21. Quando internalizar proteínas marcadas, todos corante livre precisa ser removido a partir da solução de proteína marcada de electroporação anteriores. As moléculas livres de corantes, devido ao seu menor tamanho, podem ser internalizadas preferencialmente sobre as proteínas de interesse, e são difíceis de discriminar durante a análise de dados (não obstante o seu esperado difusão mais rápida). Como um guia, para uma amostra de proteína marcada orgânica como sendo adequados para a electroporação, a quantidade de corante remanescente livre deve ser inferior a 2% (detectado utilizando um varrimento fluorescente de um SDS-PAGE) 22. Este processo é particularmente importante,como algumas moléculas pode aderir às membranas externas de bactérias ou leveduras a electroporação. A este respeito, a amostra de controlo negativo devem exibir a intensidade de fluorescência por célula claramente mais baixo do que as células electroporadas, idealmente tão baixa quanto o nível de autofluorescência das células vazias (células que não foram incubadas com quaisquer biomoléculas marcadas com fluorescência ou a electroporação, Figura 2). Tal como acontece com dsDNA, a eficiência de internalização proteínas marcadas está relacionada com o valor de biomoléculas adicionados às células antes da electroporação. No entanto, outros parâmetros, tais como o tamanho e carga, desempenhar um papel na internalização. As pequenas proteínas apresentam alta eficiência de internalização, enquanto que as proteínas maiores (até 98 kDa) podem ser internalizados com êxito, mas com uma eficiência mais baixa (Figura 5) 26. O ponto isoelétrico da proteína, potenciais interacções com a membrana celular e os outros parâmetros físico-químicos tambémcélula de carregamento influência durante a electroporação. Como resultado, os usuários precisam otimizar experiências para o seu próprio sistema, sabendo que a concentração inicial de alta proteína marcada (&gt; 50 M) vai lhe dar a melhor chance para o carregamento de sucesso. A electroporação também oferece uma nova ferramenta para perturbar e analisar a função celular mediante a introdução de proteínas e outras biomoléculas para as células (ou marcados ou não marcados). As experiências de ARN polimerase de T7 (Figura 5C) apresentam um exemplo de uma experiência em que se pode introduzir uma biomolécula que pode alterar a expressão de genes in vivo utilizando electroporação. Ao realizar experiências de fluorescência de molécula única, iluminação TIR é geralmente favorecido sobre os outros modos de iluminação, uma vez que oferece a melhor relação sinal-para-ruído de apenas fluoróforos excitantes dentro de uma secção fina sobre a superfície lamela (~ 100 nm). No entanto imagem rotulada biomoléculas difundem dentro microorganismos vivos pode require iluminação mais profundas (até 0,8 mm para E. coli). Iluminação mais profundo é alcançado no modo de Hilo, preservando ao mesmo tempo uma elevada relação de sinal-para-ruído. Por outro lado, a imagem de campo largo é particularmente importante para a análise de fotobranqueamento passo a passo, em que o utilizador está a estimativa do número de moléculas internalizadas por fotobranqueamento toda uma célula carregada com elevado poder de laser e dividindo a intensidade de fluorescência celular inicial pela intensidade unitária produzida por uma única molécula (fotobranqueamento passo único, Figura 3). Widefield imagiologia também é necessário para a molécula de seguimento de longo prazo, a fim de localizar as moléculas de difusão de interesse mesmo que as suas trajectórias cobrir o volume da célula inteira. Neste protocolo, apresentamos como eletroporação, uma técnica padrão para biólogos e bioquímicos para a entrega de ácidos nucleicos em células, constitui um método simples para a entrega de biomoléculas fluorescentes em vários tipos de células. Thé nova, a técnica de alto rendimento oferece uma ferramenta única para observar moléculas marcadas em seu ambiente nativo. Em adição biomoléculas marcadas com fluoróforos que abrange uma ampla gama de comprimentos de onda, a electroporação pode entregar moléculas modificadas com vários grupos químicos, tais como nucleótidos e aminoácidos não naturais, quelantes de metais, agentes de reticulação, e grupos obtido confinando. Se o sistema biológico de interesse não é essencial para o desenvolvimento celular, o gene que codifica para a proteína alvo pode também ser eliminado (ou batido para baixo), assegurando que as proteínas observadas após a internalização representam todos (ou mais) do banco de proteína intracelular . Em essência, eletroporação pode &quot;transplante&quot; a flexibilidade do in vitro bioconjugates em células vivas e, portanto, beneficiar esforços em biologia sintética, biologia de sistemas, e in vivo de detecção de uma única molécula.

A maioria dos estudos de fluorescência dentro de células vivas depender de fusões de proteínas com proteínas fluorescentes (PQ), tais como 1 GFP. Estes marcadores fluorescentes permitir estudos do número de cópias, padrão de difusão ou localização de proteínas envolvidas em processos, tais como a expressão de genes ou de transporte de membrana 2-7. PQ oferecem alta especificidade rotulagem, de fácil aplicação, e estão disponíveis em um grande estoque de variantes com vários photophysical e propriedades químicas 1. No entanto, fluorophores orgânicos continuam a ser a principal escolha para experiências in vitro, devido à sua maior fotoestabilidade (até 100 vezes mais estável que o PQ) 8,9, tamanho pequeno (até 100 vezes menor do que o volume PQ) e facilidade de rotulagem intramolecular (principalmente através do uso de resíduos de cisteína). Todos estes factores são particularmente importantes para uma única molécula de fluorescência e FRET estuda 10. Vários métodos de internalização combining as vantagens da rotulagem orgânica e na detecção vivo foram introduzidas ao longo da última década; No entanto, tais métodos ou empregar polipéptidos relativamente grandes etiquetas (tags por exemplo, TMP, halo, ou 20 kDa SNAP) 11-14, requerem a utilização de aminoácidos não naturais 15, ou estão limitadas a células eucarióticas, grandes único à membrana (por ex. , raspe o carregamento, seringa carregamento, microinjeção) 16-19. Este protocolo descreve um novo, simples e de alto rendimento método internalização que acopla as vantagens de fluoróforos orgânicos com observação in vivo. Para o desenvolvimento desta técnica, foi adaptado do procedimento de electroporação comumente usado para transformar células com o plasmídeo de ADN 20,21 a fim de carregar os microrganismos, tais como E. coli ou S. cerevisiae com biomoléculas rotulados como orgânicos. O protocolo consiste em 4 passos simples: a incubação de células com biomoléculas marcadas,electroporação, a recuperação de células, e lavagem das células para remover biomoléculas não internalizado. Aqui, apresentamos este protocolo eletroporação, bem como os processos de imagem de células e de análise de dados para o estudo de fluorescência baseada em células e única molécula e traste sinais. A electroporação depende de descarregar um campo eléctrico de alta tensão através de uma suspensão de células de força iónica baixa para formar poros da membrana através da qual transientes biomoléculas podem entrar nas células (Figura 1) 20,21. Assim como com a transformação de bactérias ou de leveduras com DNA de plasmídeo, as células têm que ser preparada antes da electroporação a garantir a sua electrocompetency. Este procedimento, que consiste em vários passos de lavagem com água, aumenta a permeabilidade da membrana e diminui a força iónica da solução de células para evitar a formação de arco eléctrico na cuvete de electroporação. Neste protocolo, as células podem ser preparadas como descrito abaixo (Veja PROTOCOLO: 1.1) ou comprados a partir de provedor comercials. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig1.jpg" /> Figura 1: Representação esquemática do protocolo internalização Da esquerda para a direita:. Adicionar alguns microlitros de biomoléculas marcadas para a alíquota de células electrocompetentes (fragmentos de DNA duplamente marcada e bactérias, neste exemplo); incubar 1 a 10 min em gelo e transferir para uma cuvete de electroporação de pré-arrefecida; electroporate e depois adicionar 0,5-1 ml meio rico para as células imediatamente após; incubar a 37 ° C (ou a temperatura requerida pelo organismo, por exemplo, 29 ° C durante levedura) para permitir que as células recuperar; executar 5 passos de lavagem para remover qualquer excesso de moléculas não-internalizados marcados; ressuspender o sedimento final em 100-200 ul de tampão PBS e pipeta de 10 uL sobre uma almofada de agarose; cobrir o teclado com uma lamela e imagem limpa em um microscópio de fluorescência (no modo de campo largo ou modo HILO). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; células electrocompetentes são incubadas com as biomoléculas marcadas pouco antes eletroporação, que podem ser executadas usando electroporators padrão encontrados na maioria dos laboratórios de bioquímica. Imediatamente após a electroporação, as células são incubadas em meio enriquecido que permita a sua recuperação antes da lavagem (Figura 1). O excesso de biomoléculas marcadas não-internalizados é removido em primeiro lugar por lavagem com um tampão contendo uma concentração razoavelmente elevada de sal e um pouco de detergente (Ver PROTOCOLO: 3,3). A presença de sal perturba interacções electrostáticas não-específicos formados por não internalizados biomoléculas marcadas que de outra forma podem colar na membrana exterior. De igual modo, a presença de detergente no tampão de lavagem rompe as interacções hidrófobas não específicas. Enquanto internalização DNA é simples (Figura 2), as precauções devem ser tomadas quando internalizar proteínas marcadas utilizando eletroporação. Em primeiro lugar, a amostra estoque de proteína organicamente marcado ainda pode conter uma pequena percentagem de corante livre. As moléculas livres de corantes são muito menores do que as proteínas e pode, portanto, ser internalizada preferencialmente. Para assegurar que a vasta maioria das moléculas fluorescentes internalizadas observados correspondem à proteína de interesse, a amostra de proteína inicial deve conter menos de ~ 2% de corante livre (Figura 5) 22. O excesso de proteínas marcadas não-internalizadas também pode furar a membrana exterior da célula após a electroporação; este fenómeno é específico para a proteína e deve ser verificada para cada nova proteína. Propomos várias opções que permitem a remoção de proteínas não-internalizado a partir da amostra celular carregado (Ver PROTOCOLO: 3.3.3). Finalmente, as células são ressuspensas num pequeno volume de tampão de fosfato e pipetou-se para uma almofada de agarose, permitindo a sua imagem através de um microscópio de fluorescência. A imobilização sobre almofadas de agarose é um simple e forma eficiente de imagiologia células em uma lamela sem prejudicar sua integridade. A almofada deve conter um meio de cultura de baixa fluorescência. Imagens de células pode ser realizada tanto em microscopia widefield, o total de fluorescência reflexão interna (TIRF) ou utilizando HILO (altamente inclinadas e laminado folha óptica). Na configuração Hilo, o feixe de laser penetra mais profundamente do que a amostra em TIRF, ainda não ilumina toda a amostra como para campo amplo, permitindo uma maior razão sinal-para-ruído de 23. Dependendo da resolução de energia laser e tempo de utilização, biomoléculas internalizados podem ser contadas (utilizando a análise de fotobranqueamento-gradual, Figura 3), localizada, ou rastreados 24-28. Internalização de construções duplamente marcados com um par de fluoróforos FRET permite a quantificação de FRET tanto a uma única célula ou níveis de molécula única (Figura 6). Diferentes parâmetros podem ser variadosdependendo do resultado desejado e o sistema biológico estudado. Em primeiro lugar, a quantidade de material internalizados por células pode ser ajustado através da alteração da concentração de biomoléculas marcadas adicionado à electroporação as células antes (Figura 2). A intensidade do campo electroporação também irá influenciar tanto a eficiência do carregamento e a viabilidade celular; como esperado, enquanto que a eficiência aumenta com o aumento da carga de intensidade de campo, a viabilidade das células electroporadas diminui (Figura 4A). Ambos os parâmetros podem ser quantificados por registo da percentagem de células em divisão e carregado após a electroporação. Este ensaio de viabilidade juntamente com imagens de fluorescência também verifica a observação de biomoléculas internalizados em células vivas e permite a observação contínua ao longo de várias gerações (Figura 4B). Em resumo, este protocolo permite que a internalização de DNA e marcado por fluorescência em moléculas proteicasE. coli ou S. cerevisiae 26. Moléculas individuais marcadas com fluoróforos orgânicos podem ser rastreados com alta resolução espaço-temporal para escalas de tempo uma ordem de magnitude maior do que PQ. Finalmente, este método é compatível com widefield, TIRF e detecção confocal, bem como regimes de excitação por impulsos, tais como Alex (alternando excitação laser 28,29).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="834">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:227px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:321px;">ElectroMax DH5-alpha Comptent cells</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11319-019</td>
			<td>or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">EZ Rich Defined Madia</td>
			<td style="width:227px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">M2105</td>
			<td>low fluorescence rich media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporation Apparatus&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100</td>
			<td>or any classical electroporator for microorganism transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Certified Molecular Biology agarose</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">161-3100</td>
			<td>low fluorescence agarose for agarose pad</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:321px;">Microscope coverslips No 1.5 thickness</td>
			<td style="width:227px;">Menzel</td>
			<td style="width:119px;">BB024060SC</td>
			<td>remove background particles by heating slides in furnace at 500 &#176;C for 1h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Single-molecule fluorescence microscope</td>
			<td style="width:227px;">Home-built</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>described in REFs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Localization software</td>
			<td style="width:227px;">Custom-written, available online</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Tracking software</td>
			<td style="width:227px;">Available online</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>MATLAB implementation by Blair and Dufresne.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

internalization and observation of fluorescent biomolecules in living microorganisms via electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

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Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

Internalização e Observação de Fluorescent Biomoléculas em microorganismos vivos via Eletroporação

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.7K visualizações.  University of Oxford. Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.