We thank Stephan Uphoff for discussions. 
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).

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	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Leake, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+turnover+in+single,+functioning+membrane+protein+complexes.">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li><li>Taniguchi, Y., Kawakami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+HaloTag+protein+to+covalent+immobilization+of+recombinant+proteins+for+single+molecule+force+spectroscopy.">Application of HaloTag protein to covalent immobilization of recombinant proteins for single molecule force spectroscopy.</a> Langmuir. 26, 10433-10436 (2010).</li><li>Xie, X. S., Choi, P. J., Li, G. W., Lee, N. K., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+approach+to+molecular+biology+in+living+bacterial+cells.">Single-molecule approach to molecular biology in living bacterial cells.</a> Annual review of biophysics. 37, 417-444 (2008).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+subcellular+RNA+sequencing+in+situ.">Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ.</a> Science. 343, 1360-1363 (2014).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+microscopy+coming+of+age:+from+concepts+to+biological+impact.">Localization microscopy coming of age: from concepts to biological impact.</a> J Cell Sci. 126, 3505-3513 (2013).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Hao Chen, K., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localizationbased+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localizationbased super-resolution imaging.</a> Nat Meth. 8, 1027-1041 (2011).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Meth. 2, 905-909 (2005).</li><li>Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+molecules+at+cell+division+reveals+native+protein+localization.">Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization.</a> Nat. Methods. 9, 480-482 (2012).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Single-Cell+RNA-Seq+for+Marker-Free+Decomposition+of+Tissues+into+Cell+Types.">Massively Parallel Single-Cell RNA-Seq for Marker-Free Decomposition of Tissues into Cell Types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li><li>Aldridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHT-ChIP-seq:+a+completely+automated+robotic+protocol+for+high-throughput+chromatin+immunoprecipitation.">AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation.</a> Genome Biol. 14, R124 (2013).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).</li><li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates.">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nat. Methods. 7, 717-719 (2010).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo.">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+incorporating+macromolecules+into+adherent+cells.">A method for incorporating macromolecules into adherent cells.</a> J Cell Biol. 98, 1556-1564 (1984).</li><li>Clarke, M. S., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syringe+loading+introduces+macromolecules+into+living+mammalian+cell+cytosol.">Syringe loading introduces macromolecules into living mammalian cell cytosol.</a> J Cell Sci. 102, 533-541 (1992).</li><li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells.">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nat. Methods. 7, 203-205 (2010).</li><li>Taylor, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromagnetic+syringe.">Electromagnetic syringe.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 25, 303-304 (1978).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation.">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16, 6127-6145 (1988).</li><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li><li>Sustarsic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+delivery+of+fluorescently+labeled+proteins+in+live+bacteria+using+electroporation.">Optimized delivery of fluorescently labeled proteins in live bacteria using electroporation.</a> Histochem Cell Biol. , (2014).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat. Methods. 5, 159-161 (2008).</li><li>Sinha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cascade+of+DNA-binding+proteins+for+sexual+commitment+and+development+in+Plasmodium.">A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium.</a> Nature. 000, 1-5 (2014).</li><li>English, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+investigations+of+the+stringent+response+machinery+in+living+bacterial+cells.">Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E365-E373 (2011).</li><li>Crawford, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+intracellular+single-molecule+fluorescence+using+electroporated+molecules.">Long-lived intracellular single-molecule fluorescence using electroporated molecules.</a> Biophys J. 105, 2439-2450 (2013).</li><li>Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+DNA+repair+in+live+bacteria.">Single-molecule DNA repair in live bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8063-8068 (2013).</li><li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Protein-DNA+Interactions+in+Live+Bacterial+Cells+Using+Photoactivated+Single-molecule+Tracking.">Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking.</a> J Vis Exp. , (2014).</li><li>Hohlbein, J., Gryte, K., Heilemann, M., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+on+a+new+wave+of+single-molecule+fluorescence+methods.">Surfing on a new wave of single-molecule fluorescence methods.</a> Phys Biol. 7, 031001 (2010).</li><li>Xie, X. S., Yu, J., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspective+-+Living+cells+as+test+tubes.">Perspective - Living cells as test tubes.</a> Science. 312, 228-230 (2006).</li><li>Santoso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+transitions+in+DNA+polymerase+I+revealed+by+single-molecule+FRET.">Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 715-720 (2010).</li><li>Hohlbein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+landscapes+of+DNA+polymerase+I+and+mutator+derivatives+establish+fidelity+checkpoints+for+nucleotide+insertion.">Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion.</a> Nature communications. 4, 2131 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

많은 매개 변수는 셀 전기 및 데이터 수집 관심 생물학적 시스템 및 실험 (셀 레벨 또는 단일 분자 분석)의 정확한 성질에 따라 동안 변화 될 수있다. 세균 내로 DNA를 electroporating 때 예를 들어, 표지 된 dsDNA 단편의 0.25-5 pmol의이 (미리 photobleaching에 대한 필요없이, 즉.) 직접 단일 분자 검출을 허용하는 내재화 낮은 효율에 이르게. 5 pmol의 dsDNA보다도 무겁게 단일 세포 - 세포 분석을위한 체계가 더 적합로드되는 경향이있다. 표지 된 DNA는 모든 이전에 겔 - 정제 된 자유 염료의 흔적을 제거하기 위해 있어야 DNA 스톡 용액으로부터 (형광 비 반응). 게다가, 특히 smFRET 실험에 대한 DNA 저하, 잠재적 인 문제, 부 자연스러운 핵산, 또는 머리 핀의 자형 루프로 엑소 뉴 클레아 접근 말단을 보호 모티브의 DNA를 사용하여 해결할 수 있습니다. 또 다른 adjustabl일렉트로 목록 매개 변수는 E 일렉트로 동안인가 전계 강도이다. 낮은 전계 강도 (~ 1 kV의 / cm)는 단일 분자 연구에 적합한 낮은 부하 효율로 이어질 것입니다. (1.8 kV로 / cm까지) 더 높은 전기장 세기가 적재 효율을 증가시킬 것이다; 그러나, 전기 천공 후 전기장 세기 및 세포 생존율 사이의 역 상관 관계가있다 (도 4 참조). 참고로, 박테리아, 효모 및 전기 천공에 사용되는 통상의 전계 강도는 ~ 1.5 kV로 / cm이다. 시정 방울 즉시 임의의 아킹 현상이 발생 큐벳으로 보낸이 붕괴의 길이를 나타내는 시간 상수는, 따를 편리한 파라미터이다. 정상 설정에서 시간 상수는 4 밀리 초보다 커야한다; 낮은 값은 낮은 부하 효율 또는 비로드 손상된 세포로 이어질 것입니다. 대부분의 electroporators 모두 조정 수정할 수 있습니다 (예 : &quot;펄스 절단&quot;또는 &quot;펄스 모양&quot;등의) 자유의 다른 학위를 제공셀 로딩과 생존. 그러나 우리는 유사한 절차 또한 멤브레인 (단일 지질 이중층) 실제로는 덜 복잡하고 전기부터 이미 세포와 함께 사용되어 있기 때문에 적절한 electroporator 설정을 사용하여 포유 동물 세포에 표지 된 생체 분자의 내면화를 허용해야합니다, 모두 박테리아와 효모에이 방법을 적용 (21). 표지 단백질을 내면화 할 때, 모두 무료 염료 표지 단백질 원액 이전 전기에서 제거해야합니다. 자유 염료 분자가, 그들의 더 ​​작은 크기에, 관심있는 단백질의 내재화를 통해 우선적으로, 그리고 (자신의 확산에도 불구하고 예상 빠른) 데이타 분석에서 구별하는 것이 어려울 수있다. 유기적 표지 단백질의 샘플에 대한 설명서는, 전기 천공에 적합하도록, 자유 염료 잔량이 2 % 미만이어야 22 (SDS-PAGE의 형광 주사를 사용하여 검출). 이 프로세스는 특히 중요일부 분자는 일렉트로 세균이나 효모의 외막에 충실 할 수있다. 이러한 관점에서, 음성 대조군 샘플 (임의 형광 표지 된 생체 분자와 함께 배양이나 전기 천공되지 않은 세포도 2) 빈 셀의 자기 형광도 수준 이상적으로 낮은 전기 천공 세포보다 분명히 낮은 셀당 형광 강도를 표시한다. dsDNA와 마찬가지로, 표지 단백질의 내재화 효율 일렉트로 이전 세포에 첨가 된 생체 분자의 양에 연결된다. 그러나, 이러한 크기 및 전하와 같은 다른 파라미터들은, 내재화의 역​​할을한다. 작은 단백질은 더 큰 단백질 반면 (그림 5) (26) (98 kDa의까지) 성공적으로 내면화 될 수 있지만, 낮은 효율, 높은 국제화 효율을 나타낸다. 단백질 isolelectric 점, 세포막 전위와의 상호 작용 또는 다른 물리 화학적 및 파라미터전기 동안 영향 셀 로딩. 그 결과, 사용자는 표지 단백질 (&gt; 50 μM)의 높은 초기 농도가 성공적으로 로딩을위한 최고의 기회를 줄 것이다 것을 알고, 자신의 시스템에 대한 실험을 최적화해야합니다. 전기도 교란 및 세포 (중 레이블 또는 레이블)에 단백질 등의 생체 분자를 도입하여 세포의 기능을 분석 할 수있는 새로운 도구를 제공합니다. 본 T7 RNA 폴리머 라제의 실험 (도 5C) 우리는 전기를 이용하여 생체 내에서 유전자 발현을 변경 생체 분자를 도입 할 수있다 등의 실험 예. 단일 분자 형광 실험 수행 때 커버 슬립면 (~ 100 ㎚) 상기 얇은 섹션 내 흥분 만 형광 의해 최상의 신호 대 잡음비를 제공하는 것처럼, TIR 조명은 일반적으로 다른 조명 모드를 통해 선호된다. 그러나 살아있는 미생물의 내부 확산 영상 표시 생체 분자는 다시 수첩 깊은 조도 (최대 E. 콜라이 0.8 ㎛이다). 높은 신호 대 잡음비를 유지하면서 깊은 조명은, 힐로 모드에서 달성된다. 한편, 넓은 시야의 촬상은 사용자가 높은 레이저 파워와 전체로드 셀 photobleaching에 및 생산 단위의 강도에 의해 초기 셀 형광 강도로 나누어 내재화 분자의 수를 예상된다 단계적 광표백 분석에 특히 중요 단일 분자 (단일 광표백 단계, 그림 3)에 의해. 그 궤적이 셀 전체 볼륨을 커버해도 위드 촬상 또한 관심 분자 확산 지역화하기 위하여 장기간 추적 분자 요구된다. 이 프로토콜에서, 우리는 전기, 세포에서 핵산을 전달하기위한 생물학 및 생화학의 표준 기법은 다양한 세포 유형에서 형광 생체 분자를 전달하기위한 간단한 방법을 구성하는 방법을 제시한다. 목소설, 높은 처리량 기술은 그 나라의 환경 표지 분자를 관찰 할 수있는 독특한 도구를 제공합니다. 형광 물질은 넓은 파장 범위를 포함 표지 또한 생체 분자에있어서, 이러한 비 천연 뉴클레오타이드 및 아미노산, 금속 킬레이트 제, 가교제, 및 caging 기 등 많은 화학 기, 변성 분자를 제공 할 수있는 전기. 관심있는 생물학적 시스템 세포 발달에 필수적이지 않으면 내재화 후 관찰 된 단백질은 세포 내 단백질 풀의 모든 (또는 대부분의) 표현을 보장, 표적 단백질을 코딩하는 유전자는 또한 삭제 될 수있다 (또는 노크 다운) . 본질적으로, 전기는 &quot;이식&quot;살아있는 세포로 체외 bioconjugates의 유연성 때문에 합성 생물학, 시스템 생물학에 노력하고, 생체 내 단일 분자 검출을 혜택을 누릴 수 있습니다.

살아있는 세포 내부의 대부분의 형광 연구는 GFP 1 형광 단백질 (FPS)와 단백질의 융합에 따라 달라집니다. 이러한 형광 태그는 유전자 발현 또는 2-7 수송 막 등의 처리에 관여하는 단백질의 카피 수, 확산 패턴 또는 지역화 연구를 허용한다. FPS는 높은 라벨 특이성, 쉬운 구현을 제공하며, 다양한 광 물리, 화학적 특성 1 변종의 큰 목록에서 사용할 수 있습니다. 그러나, 유기 형광가 큰 광 안정성에 의한 시험 관내 실험에 대한 주요 선택을 유지 (최대 FPS보다 안정적 100 배) 8, 9, 작은 크기 (더 작은 FPS보다 볼륨 100 배에) 및 분자 표지의 용이성 (주로 시스테인 잔기의 사용을 통해). 이러한 모든 요소는 단일 분자 형광에 특히 중요하며, FRET (10)을 연구합니다. 여러 국제화 메소드 COMBIN유기 라벨링 및 생체 검출 장점을 보내고 것은 지난 10 년 동안 소개되었다; 그러나, 이러한 방법은 비 천연 아미노산 (15)의 사용을 필요로하거나, 예를 들면 (대형 단일 막 진핵 세포로 제한되어, 비교적 큰 폴리펩티드 태그 (예를 들어, TMP, 할로, 또는 20 kDa의 SNAP 태그) 11-14을 사용 하나. 로드, 주사기 로딩, 미세 주입) 16 ~ 19를 긁어. 이 프로토콜은 그 생체 내 관찰과 커플 유기 형광의 새로운 장점을 간단하고 높은 처리량 내재화 방법을 설명한다. 이 기술을 개발하기 위해, 우리는 일반적으로 예컨대 E. 같은 미생물을로드하기 위해 플라스미드 DNA (20, 21)와 함께 세포를 형질 전환하는 데 사용되는 전기 천공 절차를 채택 대장균 또는 S. 유기적 표시 생체 분자와 사카로 마이 세스 세레 비시 애. 이 프로토콜은 4 간단한 단계로 구성 세포의 배양을 표시 생체 분자와,전기, 세포 복구, 세포 세척이 아닌 내면화 된 생체 분자를 제거합니다. 여기서, 우리는이 전기 프로토콜뿐만 아니라, 셀 기반 및 단일 분자의 형광을 연구하고 신호를 안달 세포 이미징 데이터 분석 및 처리를 제시한다. 전기 천공은 생체 분자 (도 1) 셀 (20, 21)를 입력 할 수있는 과도 멤브레인 기공을 형성하기 위해 낮은 이온 강도 세포 현탁액을 가로 질러 고전압 전기장 방전에 의존한다. 다만 플라스미드 DNA로 형질 전환 박테리아 또는 효모와 같은 세포는 electrocompetency을 보장하기 위해 전기 천공 전에 제조되어야한다. 이 절차는, 물과 여러 세척 단계로 이루어지는, 막 투과성을 증가시키고, 전기 천공 큐벳 내의 아킹을 피하기 위해 세포 용액의 이온 강도를 낮춘다. 이 프로토콜에서, 세포 (PROTOCOL 참조 : 1.1)을 후술하는 바와 같이 제조 될 수 있거나 또는 상업적 공급자로부터 구입의. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig1.jpg" /> 그림 1 : 국제화 프로토콜의 도식 표현 왼쪽에서 오른쪽으로 :. electrocompetent 세포 (이중 표지 DNA 단편이 예에서 박테리아)의 나누어지는 레이블 된 생체 분자의 몇 마이크로 리터를 추가; 얼음에 1 분 10 품어과 미리 냉장 전기의 베트로 전송; electroporate 다음 직후 세포에 0.5 ml의 다양한 매체를 추가; 세포가 복구 할 수 있도록 37 ° C (또는 유기체에 필요한 온도, 예를 들어, 효모 29 ° C)에서 배양; 임의의 과량의 비 표지 된 내면화 분자를 제거하는 세척 단계 5를 수행; PBS 버퍼와 피펫 아가로 오스 패드에 10 μL의 100 ~ 200 μL의 최종 펠렛을 재현 탁; (와이드 필드 모드 또는 힐로 모드) 형광 현미경 커버 슬립 세정 및 이미지 패드 커버. (그림 1)을 허용하는 풍부한 매체에서 배양된다. 비 표지 된 생체 분자의 내재화 과량 제 염의 비교적 높은 농도의 일부를 함유하는 세제 세척 버퍼에 의해 제거된다 (3.3 PROTOCOL 참조). 염의 존재는 그렇게 외막에 붙어있다 내재화 비 표지 된 생체 분자에 의해 형성된 비 - 특이 정전 기적 상호 작용을 방해. 마찬가지로, 세척 완충액 세제의 존재하에 비특이적 소수성 상호 작용을 방해. DNA 내재화 (그림 2) 간단하지만,주의 사항은 전기를 사용하여 표지 단백질을 내면화 할 때 수행해야. 첫째, 유기적 표지 단백질의 주식 샘플은 여전히​​ 무료 염료의 작은 비율을 포함 할 수 있습니다. 무료 염료 분자는 단백질보다 훨씬 작고, 따라서 우선적으로 내면화 될 수 있습니다. 관찰 된 내면화 형광 분자의 대다수가 관심의 단백질에 대응되도록하려면 초기 단백질 샘플은 적은 2 ~ % 이상에게 무료 염료 (그림 5) (22)를 포함해야합니다. 비 표지 된 단백질의 내재화 과량 또한 일렉트로 후 세포 외막에 찌를 수있다; 이러한 현상은 특정 단백질이며, 각 새로운 단백질에 대해 확인을받을 필요가있다. 우리는 (: PROTOCOL 3.3.3 참조)로드 셀의 샘플 비 단백질의 내재화를 제거 할 수있는 여러 옵션을 제시한다. 마지막으로, 세포를 인산 완충액의 작은 부피에 재현 탁하고 형광 현미경에 자신의 이미징을 허용 아가 패드 상으로 피펫 팅한다. 아가로 오스 패드에 고정화는 간체입니다전자 및 무결성을 해치지 않고 커버 슬립에 세포 이미징의 효율적인 방법. 패드는 낮은 형광 문화 매체를 포함해야합니다. 셀 이미징은 하나 위드의 총 내부 반사 형광 (TIRF) 또는 HILO를 사용하여 (높은 경사와 적층 광학 시트) 현미경을 수행 할 수 있습니다. 힐로 구성에서, 레이저 빔은 큰 신호 대 잡음비 (23)을 허용 위드로서는 전체 샘플을 아직 조명하지 않는,보다 TIRF 시험편 깊숙히. 사용되는 레이저 파워 및 시간 해상도에 따라, 바이오 분자 내재화는 (도 3을 단계적-photobleaching에 분석을 사용하여) 계산 국소 또는 24-28를 추적 할 수있다. 형광의 FRET 쌍으로 이중 라벨 구조의 내면화는 단일 셀 또는 단일 분자 수준 (그림 6)에서 FRET 모두의 정량화 할 수 있습니다. 다른 파라미터는 변경 될 수있다원하는 출력과 연구 생물학적 시스템에 따라 다릅니다. 첫째, 셀당 내재화 물질의 양은 종래 전기 세포 (도 2)에 첨가 표지 된 생체 분자의 농도를 변경하여 조정될 수있다. 전기 천공 전계 강도는 적재 효율 및 세포 생존 둘 다에 영향을 미친다; 예상대로 증가 전계 강도 적재 효율이 증가하면서, 일렉트로 세포의 생존율 (도 4A)을 감소시킨다. 두 매개 변수는로드의 비율을 기록 및 일렉트로 후 세포 분할함으로써 정량화 할 수있다. 형광 이미징과 함께이 생존 분석은 또한 살아있는 세포에 내재화 된 생체 분자의 관찰을 확인하고 여러 세대 (그림 4B)를 통해 지속적으로 관찰 할 수 있습니다. 요약하면,이 프로토콜은 형광 표지 된 DNA와 단백질 분자의 내면화로 할 수 있습니다대장균 또는 S. 사카로 마이 세스 세레 비시 애 (26). 유기 형광으로 표지 개별 분자 크기의 순서 이상 FPS보다 시간 척도에 대한 높은 시공간 해상도로 추적 할 수 있습니다. 마지막으로,이 방법은 위드, TIRF 및 공 초점 검출뿐만 아니라 ALEX (레이저 여기 교번 28,29)와 같은 펄스 음원 방식과 호환 가능하다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="834">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:227px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:321px;">ElectroMax DH5-alpha Comptent cells</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11319-019</td>
			<td>or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">EZ Rich Defined Madia</td>
			<td style="width:227px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">M2105</td>
			<td>low fluorescence rich media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporation Apparatus&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100</td>
			<td>or any classical electroporator for microorganism transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Certified Molecular Biology agarose</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">161-3100</td>
			<td>low fluorescence agarose for agarose pad</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:321px;">Microscope coverslips No 1.5 thickness</td>
			<td style="width:227px;">Menzel</td>
			<td style="width:119px;">BB024060SC</td>
			<td>remove background particles by heating slides in furnace at 500 &#176;C for 1h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Single-molecule fluorescence microscope</td>
			<td style="width:227px;">Home-built</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>described in REFs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Localization software</td>
			<td style="width:227px;">Custom-written, available online</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Tracking software</td>
			<td style="width:227px;">Available online</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>MATLAB implementation by Blair and Dufresne.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

internalization and observation of fluorescent biomolecules in living microorganisms via electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

샘플 준비 프로토콜의 다른 단계는도 1에 도식으로 제시한다. 예를 들어, 우리는 이중 표지 (도너와 억 셉터 염료) DNA 단편의 박테리아 하중을 나타낸다. DNA 내재화를위한 대표 결과는 그림 2에 나타내었다. 각 electroporation하여 샘플의 경우, 빈 셀 및 비 electroporation하여 세포에 대한 데이터는 (그림 2)을 기록 하였다. &quot;빈 셀은&quot;생체 분자 형광하지도 않으며 전기 천공으로 세포를 배양하지 electrocompetent 대응함 채널에서의 형광 강도는 동일 실험 조건 (레이저 파워, 시간 해상도, 온도 등)에서자가 형광 수준을 반영한다. &quot;비 일렉트로 세포&quot;(또한 -EP, 즉 마이너스 EP)는 세포 형광 biomolec 함께 인큐베이션 된 electrocompetent되는 음성 대조군에 대응개 모듈 있지만, 일렉트로 없습니다. 이러한 비 - 세포를 전기 천공 빈 셀의 자기 형광로드와 유사한, 세포를 전기 천공에 의해 표시되는 형광 강도보다 상당히 낮은 형광 수준을 나타낼 것이다. 이것은 세포 외막에 접착 있었을 비 표지 된 생체 분자의 내재화 제거를 확인한다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig2.jpg" /> 그림 2 : 박테리아에서 서로 다른 농도에서 다른 형광 물질로 표지 dsDNA의 내재화 (AE) 및 효모 (F)를위한 대표 결과 왼쪽에서 오른쪽으로. 백색광, 형광 및 오버레이 이미지. - / + EP는 전기와 함께 / 않고 배양을 의미한다. 스케일 바 : 3 μm의. A. CY3B dsDNA, 10 pmol의, E. 대장균. B. ATTO647N dsDNA, 10 pmol의, E. 대장균. C. Alexa647 dsDNA 5 pmol의, E. 콜라이. D. CY3B dsDNA, 100 pmol의, E. 콜라이. E.의 ATTO647N ds는DNA, 100 pmol의, E. 대장균. F. ATTO647N dsDNA, 30 pmol의, 효모. 이 그림은 참조 (26)에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52208/52208fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 셀당 내면화 생체 분자의 수를 카운팅 절차는 함께 표지 된 DNA와 상이한 농도로 얻어진 대표적인 결과,도 3 및 보충이 영화에 제시되어 photobleaching에 분석을 이용하여 셀당 내면화 표지 된 생체 분자의 수를 추정한다. 셀 로딩 효율 인큐베이션 표지 된 DNA의 초기 량에 따라 증가, &quot;단일 분자&quot;수준 (&lt;10, 보충 영화 2B) &quot;앙상블&quot;수준 (&gt; 10로 조정하는 사​​용자에게 셀당 표지 된 분자의 수를 허용 , 보충 영화 2A). 로드 된 세포의 비율을 추정하는 방법은 강력한 t이고O, 비 - 일렉트로 세포의 평균 기포 강도 및 3 배에 달하는 표준 편차 (즉, 아베 (I-EP) + 3 * STDDEV (I-EP) 아베 = 평균 이상의 셀 강도를 표시하는 일렉트로 세포의 수를 세 I = 픽셀 당 강도, Dev.에. = 표준 편차 -EP = 비 일렉트로) (그림 3). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig3.jpg" /> 도 3 :. photobleaching에 내재화 분석을 이용하여 분자의 수를 계수 (A)는 단일 셀 photobleaching에 분석. 형광 강도 timetraces의 예 (파란색 : 원시 데이터, 빨간색 : 적합; 세트 : WL과 전 표백 후 ATTO647N 표지 dsDNA로드 대장균의 형광 이미지). 탑 : 한 단계 백화 현상. 중동 : 표백을 보여주는 ± 3 분자를 포함하는 세포점멸. 바닥 : 적어도 10 분자에 대응&gt; 10 단계를 포함하는 셀 6 미만 구별 단계를 포함하는 셀 (57)로부터 자동 - 피팅 알고리즘 단계에서 한 단계 높이의 강도 (B)의 히스토그램.. 단일 가우스 착용감 초당 8100의 단일 광자 형광 강도에 대응하는, 11 ± 3 AU 중심된다. 별표는 위 또는 단일 형광 강도에 의해 초기 형광 강도를 나누어 계산 ATTO647N dsDNA 상이한 양으로 일렉트로 셀당 내면화 분자의 동일한 50 AU (C) 히스토그램 모든 단차를 수집 함을 표시한다. 위에서 아래로 : 빈 셀 (즉, 형광 분자로 배양되지 않고 일렉트로되지 않음), 비 일렉트로 (그러나 형광 분자라는 -EP 배양) 및 electroporation하여 세포가 10 100 pmol의 (EP + 이름) dsDNA와 함께 배양 하였다. 빈 비 일렉트로 세포 대응자가 형광에, 일렉트로 반면 세포 (≥ 4 분자 별표 마크 빈 참조) 100 pmol의에서 높은로드 셀의 높은 비율이 내면화 된 분자의 넓은 분포를 보여줍니다. 국제화 효율 10, 100 pmol의 샘플 (INT와 세포의 비율은. + 3 배 Dev.에. 비 -EP 샘플의 의미&gt;)는 각각 94 %와 90 %였다. 10 pmol의 dsDNA 121 ± 106 분자, 100 pmol의 dsDNA 176 ± 187 분자 : 셀 당 내면화 분자의 수를 의미한다. 설정 : 100 MS 노출, 위드 조명. 스케일 바 : 1 μm의. 이 그림은 참조 (26)에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52208/52208fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 셀 로딩과 생존 표지 된 생체 분자의 변화량 이외에 종래 전기 천공 세포에 첨가,사용자는 전기 중 (그림 4, 보충 동영상 1) 다른 필드 강점을 선택하여 조정 내면화 분자의 양을 수 있습니다. 높은 필드 강도는 더 국제화 효율성으로 이어질하지만 세포 생존 능력의 약간의 감소로 이어집니다. 단백질의 내재화를 들어, 여과 공정의 사용은 비 표지 된 단백질을 내면화 (3.3.3.1.1 참조)를 제거하는 데 도움이된다. 이러한 경우, 셀 여과 관측 형광 단백질이 실제로 박테리아 세포질 내부에서 내재화되는 것을 보장; 우리는 (자세한 내용은, REF 22 참조) 그러나, 여과는 세포 생존 능력에 부정적인 영향을 가지고 있습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig4.jpg" /> 그림 4 : 셀 로딩과 생존시 전기 전압의 영향 (A)로드 effic에 전기 자기장 강도의 효과를 나타내는 막대 차트.iency (빨간색 막대)와 세포 (녹색 막대)의 생존. 37 ° C에서 아가 패드 1 시간 후 비 - 일렉트로 셀 (0 kV로 / cm)에 나누어 84 ± 8 %. 동일한 조건 하에서 78 ± 3 % 및 0.9 kV로 / cm 내지 1.8 kV로 / cm에서 전기 천공 셀 49 ± 3 %를 각각 1 시간 후 나눈다. 세포를 92 ± 6 %가 1.8 kV로 / cm에로드하는 동안 적재 효율, 셀 (73)은 ± 8 %, 0.9 kV로 / cm로 로딩된다. 오차 막대는 세 독립적 인 측정으로부터 계산 된 표준 편차를 나타내고; 200 개 이상의 세포는 각각의 샘플과 각각의 반복에 대해 분석 하였다. 여러 세대에 걸쳐 세포 생존을 약간 손해에 전기 전압 전반적인 적재 효율이 증가한다. (B) 형광 세포 기반 측정은 전반적인 형광 강도가 두 개의 딸세포간에 똑같이 공유되는 것을 보여준다. 셀 1과 2는 t = 0에서의 스케일 (왼쪽) 백색광 이미지에서 세포 수 및 형광 영상을 의미바 : 1 ㎛). 이 수치는 참조 (26)에서 수정되었습니다. 단백질 국제화 단백질 내재화를위한 대표 결과는도 5A &amp; B에 있습니다. 이것은 이전에 가능 일렉트로 같은 단백질 샘플로부터 가능한 나머지 (미) 염료를 가능한 많이 제거하는 것이 특히 중요하다. 도 5a &amp; B, CY3B 표지 클레 나우 단편 샘플 (KF는 대장균 DNA 중합 효소 I의 클레 나우 단편 CY3B-KF, 66 kDa의) 1 % 무료 염료를 포함의 예에서; 전체 셀 로딩에 염료의 기여는 무시할 수있다. 자유 염료의 등량 전기 천공 (표지 된 동일한 양의 단백질과 함께 배양) 비 일렉트로 세포 모두 관심 electroporation하여 샘플의 비교뿐만 아니라 세포 관찰 형광 분자되도록하여 두 개의 필수 구성 컨트롤참으로 표지 단백질을 내장되어 있습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig5.jpg" /> 그림 5 : 라이브 박테리아의 단백질 국제화 (A) 뷰의 대표적인 형광 오버레이 필드.. 세포는 1 % 무료 CY3B 염료가 포함 된 단백질 원액에서 50 pmol의 RNAP ω 서브 유닛으로 1.4 kV의 전압에서 전기 천공. 비 전기 천공 (비 -EP)과 빈 셀은 이전과 같이 정의된다. 자유 염료 RNAP ω 일렉트로 샘플과 동일한 농도로 내재화시켰다. 1 mW의 (A)의 샘플에 대한 보정 세포 평균 강도의 50 밀리 노출. (B) 분포 넓은 필드 모드, 532 nm의 여기에서 이미징, 총 세포 수의 비율에 따른다. 샘플 당 400 개 이상의 세포를 분할했다. 이 수치는 참조 (22)에서 수정되었습니다. unla의 (C) 국제화T7 프로모터의 통제하에 pRSET-EmGFP 플라스미드 인코딩 에메랄드 GFP (EmGFP)를 들고 electrocompetent DH5α에이라고 표기 T7 RNA 중합 효소 (T7 RNAP, 98 kDa의). 왼쪽 : 분석의 개략도. 중동 : 형광 오버레이. 오른쪽 : 배양 및 T7 RNAP (아래)와 일렉트로 비 electroporation하여 샘플 (위)과 전지 셀 기반 형광 강도의 히스토그램; 일렉트릭 세포의 약 11 %가 높은 형광 강도 표시 (INT와 세포의 일부를.&gt; + 의미 배 Dev.에. 비 -EP 샘플의) EmGFP의 발현을 나타내는. 3 μm의 : 별표 위 또는 동일한 1,100 AU 스케일 바의 모든 강도를 수집 쓰레기통을 나타냅니다. 이 수치는 참조 (26)에서 수정되었습니다. 그림 5c는 단백질 전기의 또 다른 응용 프로그램을 제공합니다. 여기에, 일렉트릭 단백질은 레이블이없는, 그러나 그것의 내면화는 관찰 형광 반응을 트리거합니다. 이 실험은 사전 검증가 나타나지 않는 및 세포질에 electroporation하여 단백질의 기능을 제공합니다. 레이블이없는 T7의 RNA 중합 효소 (98 kDa의)는 E.으로 내면화되었다 T7 프로모터 (26)의 제어하에 형광 단백질 EmGFP위한 코드하는 플라스미드를 함유하는 대장균 균주 DH5α. T7 RNA 중합 효소의 유전자가 DH5α에 존재하기 때문에, 우리의 실험에서 EmGFP 식 기능 T7의 RNA 중합 효소는 전기 (그림 5C)를 통해 세포 내로 도입되어 있어야합니다. 1 pmol의 T7 RNAP, 세포의&gt; 11 %로 전기를 이하의 (청색 막대도 5C)은 음성 대조군보다 높은 형광 나타냈다 (T7 RNAP 동일한 양 배양을하지만 일렉트로 생략). 이 결과는 일렉트로 내재화 T7 RNAP 분자의 비율이 생체 내에서 자신의 무결성을 유지하고 세포질에서 의도 기능을 수행 할 수 있다는 것을 정한다. 생체 내에서 단일 분자 FRET및 단일 세포 수준 마지막으로, 살아있는 박테리아에 이중 라벨 종의 내재화 및 분석 3. 형광 단백질 융합 생체 내 smFRET 연구에 적합하지 않은 그림 6과 보충 영화에 제시되어, 전기를 사용하여 살아있는 세포에 이중 라벨 생체 분자를 제공 할 수있는 능력은 하나입니다 이 방법의 가장 큰 자산. 그림 6a는 단일 셀 (기증자 - 수용체 FRET 쌍으로 CY3B 및 Atto647N의 형광체를 사용하는) 다른 FRET DNA 표준로드 박테리아의 분석을 FRET 제공합니다. 세포는 0.17, 0.48의 명백한 FRET 효율 세 짧은 이중 표지 dsDNA FRET 기준의 20 pmol의 (E *)로 전기 천공하고, 0.86는 시험 관내 (이전 26 결정). 모든 DNA를 (그림의 6A, 왼쪽)와 각각의 단일 셀 E의 * 분포의 주 피크 효율적으로 세포를 입력합니다 (체외 결과와 잘 그림 6A를 동의, 오른쪽). 중급 및 고급 FRET 샘플에서는, 하부 아마도 인해 셉터 표백 광 물리 비활성, 가변 셀 로딩의 조합, 관찰 예상보다 E의 * (따라서, 가변 신호 대 잡음 비) 및 DNA 분해와 세포 집단 . <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig6.jpg" /> 그림 6 :.. 단일 셀 및 단일 분자에 대한 대표 결과가 앙상블과 smFRET 연구 한 박테리아에 살고있는 박테리아에서 관찰 FRET 저를 보이는 각각의 세 가지 DNA FRET 기준의 20 pmol의로드 셀 (A) 분석 (~ 0.17) 중간체 (~ 0.48), 높은 (~ 0.86) FRET (체외 단일 분자 측정으로 측정 한, REF 26 참조). 왼쪽 : 흰색 빛과 그린 / 레드 (FRET) 형광 오버레이 이미지 (스케일 바 : 3 μm의). 다른 세포로부터의 FRET 값의 예는 (흰색) 표시된다. 조작<html> (위에서 아래로) HT :. 수정되지 않은 셀 기반 FRET (E *)는 DNA 표준을 FRET 기증자 만 (진한 녹색), 저 (밝은 녹색), 중간 (노란색), 고 (빨간색)에 대한 히스토그램 (B-D) 생체 smFRET합니다. 세포는 0.25 pmol의 중간 FRET DNA (패널 B), 0.25 pmol의 높은 FRET DNA (패널 C)와로드, 5 pmol의는 KF (패널 D)를 이중 표지. 왼쪽 열 : 전 수용체 광표백 후 단일 프레임의 그린 / 레드 형광 오버레이. 가운데 열 : 노란색 원 분자에 해당하는 시간을 추적합니다. FRET 효율, 기증자 방출 강도 및 수용체 방출 강도는 각각, 녹색, 파란색과 빨간색으로 표시됩니다. 오른쪽 열 : 기증자 만 분자 (녹색) 및 각 샘플에 대한 20 시간 추적에서 (노란색, 빨간색, 회색) 기증자 - 수용체 분자의 FRET 히스토그램. 스케일 바 : 3 μm의, B-D 1 μm의. 이 수치는 참조 (26)에서 수정되었습니다.208fig6large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. DNA 또는 단백질 중급 및 하이 FRET DNA 표준 샘플, 소량 (0.25 pmol의) (그림 6B, C) ​​또는 FRET 쌍으로 이중 표지 KF (Alexa647 / CY3B의 형광의 5 pmol의 그림에 대한 생체 내에서 smFRET을 준수합니다 6D는) E.에 electroporation된다 대장균. 이러한 농도는 추적 및 단일 분자 모니터링 퍼즐, 직접 현지화를 허용, 몇 (N = 1-10) 표지 분자와로드 많은 세포로 이어졌다. 다른 사람이 움직이지 나타나거나 천천히 (보충 영화 3) 확산 반면 일부 분자는 자유롭게 확산. 1 ~ 30 초 동안 마지막과 smFRET의 특징을 보여 고정 이중 표지 생체 분자 (그림 6, 중)의 Timetraces : 예를 들어 수용체 표백시 기증자 및 수용체 형광 anticorrelated 변경 (, t는 ~ 16 초, 그림 6B, 중간 ), 단일 다음(예를 들어, t ~ 19 초, 그림 6B) - 스텝 기증자 표백. 이러한 timetraces (그림 6, 오른쪽)의 시험 관내 (in vitro) 연구 26,31,32 년에 출판과 매우 잘 일치에 평균 값의 결과에서 생성 FRET 분포. 이러한 결과는 내면화 된 DNA와 단백질의 정량 smFRET 연구에 대한 기능을 설정하고 (T7의 RNAP 국제화 실험에서 지원) 단백질이 전기 및 국제화에 자신의 무결성과 구조를 유지하는 것이 좋습니다. 보충 영화 1. 세포 생존 왼쪽 : 백색광 이미지. 오른쪽 : 형광 이미지. 애니메이션 GIF 10 pmol의의 Atto647 표지 DNA로드 박테리아의 전기 (1.8 kV의 / cm) 후 분열을 보여주는 애니메이션. 형광의 감소는 전반적인 명백 서로 부분적 중에 발생 광표백에 또한 세포 분열시 표지 된 DNA의 희석으로 인해이고측정. 보충 영화 2 : 세포 기반 광표백 연구 A.. (&gt; 100 Atto647N 표지 DNA 분자를 포함하는) 과도하게로드 셀의 대표적인 예. 왼쪽 위, 관심 (빨간색 사각형)의 셀의 백색광 이미지. 오른쪽 상단, 몇 분에 걸쳐 형광 붕괴를 보여주는로드 세포의 영화. 관심 셀의 전체 형광 강도 감쇠의 아래에, 시간 추적. 유기 형광 물질은 수명을 FPS보다 높은 크기의이 주문 (여기에, ~ Atto647N 41 초) photobleaching에 나타낼 수있다. 10 미만 표지 분자 (이 경우에는 3)로드 셀 B. 대표적인 예. 패널 A. 바닥, 단일 단계 표백을 보여주는 및 / 또는 단일 유기 형광에 해당 깜박 관심있는 셀의 전체 형광 강도의 시간 추적과 동일한 최고. 이 단계의 평균 높이가 ~ 여기 (단일 분자 단위 강도에 해당AU (12))은 셀 당 분자의 내재화 초기 수를 추정하기 위해 사용된다. 300 μW 전력에서 연속 적색 레이저 여기에서 영화와 프레임 당 100 밀리 초. 보충 영화 3 :. 나는 N 단일 분자 FRET 최고 생체 내 : 세포는 지속적으로 nTIRF 조명 아래 프레임 당 50 밀리에서 모니터 0.25 pmol의 (그림 6C에서와 같이) 고 FRET DNA는 1 mW의 녹색 (532 ㎚) 레이저를 사용하여로드. 각 프레임은 각 채널의 그린 / 레드 (FRET) 형광 오버레이입니다. 확산 및 움직이지 빨간색 (그대로)과 녹색 (단일 활성 라벨) DNA 분자는 관찰 할 수있다. 아래 : 노란색 원의 분자에 해당하는 시간 추적. FRET 효율, 기증자 방출 강도 및 수용체 방출 강도는 각각, 녹색, 파란색과 빨간색으로 표시됩니다. 안티 상관 수용체 백화 현상 (빨간색 - 투 - 녹색 전환) 단일 분자 FRET의 서명에 해당합니다.

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Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.7K 조회수.  University of Oxford. Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

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Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Mycobacteria의 Electroporation

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

연구

생물학

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

형광등을 통해 F - 굴지 역학 라이브 셀 이미징은 현미경을 스페클 (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

살아있는 세포에서 Ubiquitin-proteasome 활동 모니터링 Degron (dgn) - 불안정 그린 형광 단백질 (GFP) 기반 리포터 단백질을 사용하여

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific properties, such as binding affinity, agonist or antagonist behavior, or stability, relative to the native sequence. Protein design lies at the center of current advances drug design and discovery. Not only does protein design provide predictions for potentially useful drug targets, but it also enhances our understanding of the protein folding process and protein-protein interactions. Experimental methods such as directed evolution have shown success in protein design. However, such methods are restricted by the limited sequence space that can be searched tractably. In contrast, computational design strategies allow for the screening of a much larger set of sequences covering a wide variety of properties and functionality. We have developed a range of computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. These include the design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity.
To disseminate these methods for broader use we present Protein WISDOM (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>), a tool that provides automated methods for a variety of protein design problems. Structural templates are submitted to initialize the design process. The first stage of design is an optimization sequence selection stage that aims at improving stability through minimization of potential energy in the sequence space. Selected sequences are then run through a fold specificity stage and a binding affinity stage. A rank-ordered list of the sequences for each step of the process, along with relevant designed structures, provides the user with a comprehensive quantitative assessment of the design. Here we provide the details of each design method, as well as several notable experimental successes attained through the use of the methods.

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

We developed computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. To disseminate these methods we present Protein WISDOM, an online tool for protein design (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). Starting from a structural template, design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity can be performed.

단백질 지혜 : 용 워크 벤치<em&gt; 실리코에</em&gt;<em&gt; 드 노보</em생체 분자의&gt; 디자인

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

마우스 고환의 생체 내 미세 주입 및 Electroporation에에서

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Receptor trafficking modulates signaling and cell responsiveness to ligands and is, itself, responsive to cell conditions, including ligand-induced signaling. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing drug-induced receptor trafficking using immunolabeling and colocalizational analysis.

Colocalizational 분석에 의한 수용체 후 국제화 인신 매매에 약물 유발의 이동을 추적

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. To improve the mating efficiency of B. Xylophilus and to increase the chances of mating observation, virgin adults were cultured and used for the investigation. Eggs were obtained by keeping the nematodes in water and allowing the females to lay eggs for 10 min. The second-stage juveniles (J2) were synchronized by incubating the eggs for 24 h at 25 &#176;C in the dark, and the early J4 were obtained by culturing the J2 with grey mold, Botrytis cinerea, for another 52 h. At this time point, most J4 nematodes could be clearly distinguished as being male or female using their genital morphology. The male and female J4 were collected and cultured separately in two different Petri dishes for 24 h to get virgin adult nematodes. A virgin male and a virgin female were paired in a drop of water in the well of a concave slide. The mating behavior was filmed with a video recorder under a stereomicroscope. The whole period of the mating process was 82.8 &#177;3.91 min (mean &#177;SE) and could be divided into 4 different phases: searching, contacting, copulating, and lingering. The mean minutes of duration were 21.8 &#177; 2.0, 28.0 &#177; 1.9, 25.8 &#177; 0.7 and 7.2 &#177; 0.5, respectively. Eleven sub-behaviors were described: cruising, approaching, encountering, touching, hooping, locating, attaching, ejaculating, separating, quiescence, and roaming. Interestingly, obvious intra-sexual competition was observed when one female was grouped with 3 males or one male with 3 females. This protocol is useful and valuable, not only in investigating the mating behavior of B. xylophilus, but also in acting as a reference for ethological studies of other nematodes.

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

파인 우드 선충의 관측 및 짝짓기 행동의 정량화,<em&gt; 소나무 재선충</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...