The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Mu&#241;iz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).

1. Preparación de reactivos de cultivo y placas de cultivo <ol><li> Preparar medio de cultivo de células madre alimentador libre mediante la adición de 100 ml de suplemento de suero libre de 5x a 400 ml de medio basal de células madre. El medio es estable a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas y a -20 ° C durante 6 meses. </li><li> Añadir 10 mM solución de Rho-asociado, espiral de la bobina que contiene la proteína quinasa (Rock) inhibidor (Y-27362) al cuerpo embrioide (EB) Medio de formación disponibles en el mercado. </li><li> Preparar medio de diferenciación mediante la adición de 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 2 mM L-glutamina, la sustitución de suero knockout 10% (KSR) y 10 mg / ml de gentamicina a medio Eagle modificado / mezcla de nutrientes de Dulbecco F-12 (DMEM / F12). </li><li> Preparar medio IPS-RPE mediante la adición de suplemento 1x N1, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 250 mg / ml taurina, 13 ng sal sódica / ml triyodo-L-tironina, 20 ng / ml de hidrocortisona, 5 mg / ml de gentamicina, y 15% suero bovino fetal (FBS) &lt;sup&gt; 21 a medio esencial mínimo de Eagle (MEM). Ajustar el pH a 7,4. </li><li> Preparar triyodo-L-tironina solución de sal de sodio de valores. Disolver 1 mg de sal de sodio triyodo-L-tironina en 1 N de hidróxido de sodio girando suavemente. Añadir 49 ml de MEM para hacer 50 ml de 20 g / ml de sal de sodio triyodo-L-tironina. Preparar alícuotas y congelar a -20 ° C hasta que se necesite. Utilice volumen apropiado para alcanzar la concentración deseada en medio de cultivo final. </li><li> Preparar hidrocortisona solución madre. Solubilizar 1 mg de hidrocortisona en 1 ml de etanol al 100% por agitación suave. Añadir 19 ml de MEM para hacer 20 ml de 50 mg / ml de solución de hidrocortisona de valores. Alícuota y congelar a -20 ° C hasta que se necesite. Utilice volumen adecuado para conseguir la concentración deseada en el medio de cultivo final. </li><li> Preparar una solución de trabajo de dispasa de 1 mg / ml en DMEM / F12. </li><li> Preparación de las placas matriz recubierta <ol><li> Preparar matriz de proteína extraída de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) moucélulas de sarcoma de Se en DMEM / F12 a 0,08 mg / ml. Escudo cada pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 ml de la solución de matriz. Se incuban las placas recubiertas a temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Después de la incubación de 1 hora, aspirar el exceso de DMEM / F12. Añadir 0,5 ml de medio de cultivo celular vástago alimentador libre para evitar el secado de los pozos. Las placas matriz recubierta están listos para su uso. </li></ol></li><li> Preparar placas de micropocillos, enjuagando cada pocillo con 2 ml de DMEM / F12. Eliminar DMEM / F12 y añadir 0,5 ml de medio de formación de EB suplementado con inhibidor de la roca a cada pocillo. Centrifugar la placa a 2.000 xg durante 5 min para eliminar las burbujas de aire. </li><li> Preparar tampón de tinción FACS mediante la mezcla de 2% de FBS y 0,09% de azida de sodio en tampón fosfato salino (PBS). Ajuste el tampón a pH 7,4. </li><li> Preparar la solución de neutralización de tripsina mediante la adición de 10% de FBS a DMEM / F12. </li></ol> 2. iPS Cultura <ol><li> Antes de la siembra de células iPS, cálido tallo medio de cultivo celular alimentador libre a 37 ° C, y tienen la matrix placas recubiertas listo. </li><li> Descongelar rápidamente las células iPS IMR90-1 en un baño a 37 ° C. A continuación, retire la crio-vial del baño de agua y limpie el vial con etanol al 70%. Transferir las células a un tubo cónico de 15 ml con una pipeta 2 ml para minimizar la rotura de los agregados celulares. </li><li> Añadir 5 ml de medio de cultivo de células madre alimentador libre caliente a las células gota a gota y mezclar suavemente. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender cuidadosamente los grupos de células en 2 ml de medio de cultivo de células madre alimentador libre y semillas de los grupos de células en los pocillos de la placa de matriz recubiertos. Colocar la placa en una incubadora a 37ºC con 5% de CO 2, 95% de humedad. </li><li> Cambiar el medio de cultivo de células iPS diaria. Observe colonias indiferenciadas cinco a siete días después de la siembra. Compruebe si hay colonias indiferenciadas que están listos para el paso (colonias con un centro denso) bajo un microscopio de luz. </li></ol> 3. pases de células iPS <ol><li> Antes de comenzar a paso las células iPS, calentar la solución dispasa, DMEM / F12 y tallo medio de cultivo celular alimentador libre a 37 ° C en baño de agua. </li><li> Antes de pases de células iPS, retire cualquier área de la diferenciación raspando la superficie y aspirar el medio. Enjuagar cuidadosamente las células iPS con 2 ml de DMEM / F12. </li><li> Añadir 1 ml de 1 mg / ml de dispasa a cada pocillo e incubar a 37 ° C durante 7 min. Aspirar el dispasa y enjuagar suavemente las colonias de células con 2 ml de DMEM / F12 dos veces. Después de enjuagar, añadir 2 ml de medio de cultivo de células madre alimentador libre a cada pocillo. </li><li> Con una pipeta de 5 ml raspar suavemente las colonias de la placa para formar grupos de células. La transferencia de los grupos de células desprendidas a un tubo cónico de 15 ml. Añadir suficiente vástago de medio de cultivo celular libre de alimentador para sembrar el siguiente paso de las células. </li></ol> 4. Generación de EBS Usando microplacas <ol><li> Preparación de una suspensión de células individuales de células iPS <ol><li> Retire el medium de las células iPS y enjuagar las células iPS con 2 ml de DMEM / F12. Añadir 750 l de accutase a las células iPS en cada pocillo de la placa de 6 pocillos. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 para permitir que las células se desprenden de la placa (aproximadamente 5-10 min). </li><li> Utilice una pipeta de disociar suavemente cualquier resto de las células y de separar las células que quedan en la superficie de la placa. Transferir las células a un tubo cónico de 50 ml. Enjuagar la placa con 5 ml de DMEM / F12 y combinar el enjuagado DMEM / F12 con las células en el tubo cónico. Pasar la suspensión celular a través de un filtro de células de 40 micras para eliminar los posibles grupos de células residuales. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente para eliminar el accutase. Resuspender el sedimento celular en un medio de formación de EB de modo que la concentración de células es de aproximadamente 0,5-1,0 x 10 7 células / ml. </li><li> Determinar el número de células viables contando las células con azul de tripano y un hemocitómetro. </li></ol></li><li> Adjusting densidad celular en micropocillos para formar EBS tamaño controlado <ol><li> Ajustar el número de células a cada pocillo de la microplaca para generar los tamaños EB deseados. Añadir las células a los pocillos de las placas preparadas en el paso 1.9, Distribuya uniformemente las células pipeteando suavemente las células en varias ocasiones. Nota: El número de células requeridas por pocillo = el número deseado de células por EB x número de micropocillos por pocillo. </li><li> Ajuste el medio EB formación complementado con inhibidor de la roca en los pozos a un volumen final de 2,0 ml. Redistribuir las células pipeteando suavemente cada pocillo. Centrifugar las microplacas a 100 g durante 3 min. Colocar las placas en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO2 y 95% de humedad durante 24 hr. </li></ol></li><li> EB Cosecha de las placas de microtitulación <ol><li> Cosecha de EBs de micropocillos mediante pipeteo medio en el pozo arriba y abajo con una micropipeta 1 ml para eliminar la mayor parte de los EBS. Pasar la suspensión a través de una célula EB 40 micras invertidacolador en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml para eliminar las células individuales. </li><li> Lave la microplaca 5 veces con 1 ml de DMEM / F12 para eliminar todos los EBS. Recoger lavados y pasar sobre el filtro celular invertida. Gire el lado derecho hacia filtro celular a un nuevo tubo cónico de 50 ml. Recoge los EBS por lavado con medio EB formación. Contar EBS para determinar el rendimiento. </li></ol></li></ol> 5. Revestimiento del EBS y Diferenciación Iniciación <ol><li> Placa las EBS en matriz de proteína recubierta placas de seis pocillos (como en el paso 1.8.1) a una densidad de &lt;1.000 EB / pocillo en medio de la formación de EB más un inhibidor de la roca 10 mM. Incubar EBS a 37 ° C con 5% de CO2 y 95% de humedad durante 24 hr. </li><li> 24 horas después de la siembra EB, reemplazar con medio de diferenciación para iniciar la diferenciación. Cambiar la mitad del medio de diferenciación cada dos días hasta que se recogieron las células para su posterior análisis. </li><li> Recoger muestras en días 6, 17, 29 y 60 para llevar a cabo RT-PCR, immunocytochemistry y FACS para validar la expresión de genes característicos del EPR y proteínas. </li></ol> 6. Extracción de ARN y PCR <ol><li> Extracto de ARN de las muestras de EB según las instrucciones proporcionadas en el kit disponible comercialmente. Determinar la concentración de ARN mediante el uso de un espectrofotómetro. </li><li> Realizar la transcripción inversa en 100 ng de ARN total de acuerdo con RNA disponibles comercialmente a cDNA kit de transcripción inversa. </li><li> Realizar PCR con 10 ng de cDNA usando los siguientes cebadores (Tabla 1) a una concentración de 10 mmol / 10 ng de cDNA. Ajuste la PCR como sigue: desnaturalizar el ADN a 95 ° C durante 5 min, amplificar con 35 ciclos a 95 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 1 min, seguido de un ciclo final a 72 ° C durante 10 min. Ejecute el producto de PCR en un gel de agarosa al 1%. </li></ol> 7. La inmunocitoquímica <ol><li> Lávese las EB con PBS dos veces a temperatura ambiente. Fijar los EBS a TA en el 4% paraformaldehyde durante 10 min. Enjuagar una vez con PBS a RT. Almacene las muestras en PBS a 4 ° C hasta su uso para la tinción. </li><li> En el día de la tinción, el tratamiento de las células fijadas con fijación y permeabilización de reactivos. Incubar las muestras con solución de bloqueo (10% suero de cabra en solución de permeabilización) durante 1 hora a RT. </li><li> Realizar inmunoquímica en 10% suero de cabra en solución de permeabilización utilizando los siguientes anticuerpos primarios en las diluciones indicadas: anti-Pax6 (01:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (1:30), y anti- ZO1 (1: 100). Incubar las muestras con anticuerpos O / N correspondiente a 4 ° C. </li><li> Al día siguiente, eliminar el anticuerpo primario de las células y lavar las muestras tres veces con PBS. Incubar las muestras con anticuerpos secundarios fluoróforo conjugado durante 1 hora a RT. </li><li> Eliminar el anticuerpo secundario de las células y lavar las muestras tres veces en PBS. Monte la cubierta se desliza sobre portaobjetos de vidrio con DAPI que contiene medio de montaje y deje muestras para establecer O / N en una cámara oscura.Utilice un microscopio de fluorescencia para visualizar la tinción. </li></ol> 8. La tinción para el análisis de FACS <ol><li> Lavar los EBS cultivadas en PBS dos veces. Incubar EBS con 0,5 ml de tripsina al 0,25% durante 5-10 min para hacer una suspensión de células individuales. Neutralizar la tripsina con solución neutralizante de tripsina (1 ml / pocillo). </li><li> Transferir la suspensión de células individuales a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 600 xg durante 10 min. </li><li> Descartar el sobrenadante y añadir 10 ml de DMEM / F12 a las células en el tubo. Invierta suavemente para mezclar las células. Se centrifuga a 600 x g. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender las células en tampón de tinción FACS. </li><li> Cuente el número total de células. Centrifugar a 600 xg durante 10 min. Después de la centrifugación el sobrenadante de descarte. Fijar las células inmediatamente por la adición de 0,5 ml de paraformaldehído al 4%. Mezclar bien por agitación suave. Se incuban las células a 4 ° C durante 20 min. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 10 min y retirar elsobrenadante. Vortex suavemente para perturbar el sedimento celular. Permeabilizar las células mediante la adición de 1 ml de solución de permeabilización enfriada. Vortex suavemente para mezclar e incubar en hielo durante 30 min. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 10 min y separar el sobrenadante. Añadir 3 ml de tampón de tinción FACS y resuspender. Repita este paso para una vez más. Resuspender las células en tampón de tinción FACS a una concentración final de 5 x 10 6 células / ml. </li><li> Transferir 100 l de la suspensión de células (células de 0,5 x 10 6) a cada uno de los tubos de microcentrífuga y añadir el volumen recomendado de anticuerpo primario. Para Pax6, añadir 5 l de PE anti-Pax6 en 100 l de suspensión celular. Para MITF, añadir 5 l de anti-MITF en 100 l de suspensión celular. </li><li> Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 60 min. Añadir 3 ml de tampón de tinción FACS. Mezclar y centrifugar a 600 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y repetir 8.16 por dos veces más. </li><li> Para la tinción MITF, se incuban las células en Antibo secundariady, de cabra anti-ratón de Alexa Fluor 488 a una dilución de 1: 2000 durante 1 hora a 4 ° C. Para la tinción de Pax6, evitar este paso. </li><li> Lavar las células con 5 ml de tampón de tinción FACS y se centrifuga a 600 xg durante 10 min. Repita el proceso para dos veces más. </li><li> Resuspender las células en 500 l de tampón de tinción FACS y agitar suavemente para alterar el sedimento celular. Las muestras están listas para el análisis de citometría de flujo. </li></ol> 9. iPS-RPE Aislamiento y cultivo <ol><li> En el día 29, corte con cuidado alrededor de las colonias pigmentadas seleccionados de la placa de cultivo con una punta de pipeta de 200 l. Transferencia de las colonias flotantes a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las colonias a 600 xg durante 10 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las colonias de células en 10 ml de DMEM / F12 y centrifugar a 600 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Preparar una suspensión de células individuales mediante la incubación de las colonias con 2 ml de tripsina al 0,25% a 37 ° C durante 7-10 min. Vórtice suavemente la suspensión de células para disociar las colonias. </li><li> Neutralizar la tripsina mediante la adición de 2 ml de medio iPS-RPE. Centrifugar a 600 xg durante 10 min y descartar el sobrenadante. Resuspender las células individuales en 2 ml de medio iPS-RPE. Transferir las células en una matriz de proteína placa de 6 pocillos recubiertos y el lugar en una incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 y 95% de humedad. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Para conseguir plenamente las promesas de las células madre pluripotentes para la terapia celular, es necesario regular su diferenciación de una manera consistente y reproducible. Este informe describe los protocolos para formar EBS tamaño controlado utilizando la tecnología de placas de pocillos, iniciar la diferenciación hacia RPE e identificar marcadores de proteínas y genes de RPE. Para sincronizar la diferenciación in vitro, tamaños homogéneos de EB fueron formados por un número conocido de célu...

Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) son un tipo de células madre pluripotentes obtenidas por la reprogramación de células adultas con factores extrínsecos 1. En contraste, las células madre embrionarias (CES), otro tipo de células madre pluripotentes, se generan a partir de la masa celular interna del blastocisto 2-3. A pesar de sus diferentes orígenes, las células iPS y las CME son comparables en su ilimitada capacidad para replicarse in vitro y en su capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula 4-5. Estas características de las células iPS les hacen candidatos ideales para aplicaciones en medicina regenerativa personalizada. Los recientes esfuerzos de investigación se centran en el desarrollo de protocolos de diferenciación robustos para la producción de células adultas especializadas incluyendo epitelio pigmentario de la retina (EPR) 6-11. Para posibles aplicaciones clínicas de las células iPS derivadas, una diferenciación dirigida para ese tipo específico de célula es esencial. Hay varios métodospublicado para la diferenciación dirigida de ambas CES e iPS células RPE en que varía mucho en su eficacia 6-7, 12-16. Todavía no sabemos muchos de los eventos moleculares que gobiernan el destino de las células / tejidos durante el desarrollo o diferenciación. En los últimos años, se han hecho esfuerzos para desarrollar el protocolo de diferenciación que puede imitar el desarrollo embriológico tanto como sea posible. Durante la fase de blastocisto, la población no comprometido de las células madre están juntos en un microambiente tres dimensiones. Así, varias estrategias se aplicaron para hacer las células ESC / iPS reunidos juntos y crecer en tres dimensiones. Estos agregados de células madre se denominan cuerpos embrionarios (EBS). Los estudios han demostrado que la EB diferenciación de células madre imitan etapa temprana del desarrollo del embrión y espontáneamente puede dar lugar a endodermo primitivo en su superficie exterior. Más tarde, como el desarrollo EB progresa, fenotipos de células diferenciadas de los tres linajes germinales aparecen 17-18. Therefore, protocolos de diferenciación basada EBS han atraído mucha atención para la diferenciación in vitro de células ESC / iPS y son un buen candidato para la generación EPR a partir de células madre pluripotentes 13. EB se pueden hacer usando varios métodos a partir de células / iPS DESC. Inicialmente, los OC fueron hechas por el raspado de las colonias adheridas y mantenerlas en cultivo en suspensión no adherente. Sin embargo, este enfoque produce población heterogénea de EBS que provoca una baja reproducibilidad. Colgando de cultivo celular de caída y la formación de micro pozos EBS basada otras técnicas populares para la formación de EB que producen EBS homogéneos de tamaños definidos que son altamente reproducible. Además, la técnica de micropocillos puede producir gran número de agregados con menos esfuerzo. La diferenciación de las células dentro de EBS es regulada por un múltiplex de señales morfogénicas del microambiente extracelular e intracelular. En contraste con la diferenciación en una lunformato olayer, EB proporcionar una plataforma para el complejo ensamblaje de las células y la señalización intercelular que ocurra 17. Curiosamente, se observó el número de células madre pluripotentes utilizados para hacer EBS individuales para influir en el destino de las células. Por ejemplo, en un estudio de la diferenciación hematopoyética de los CES humanos, se observó que las células 500 EB promovió la diferenciación hacia el linaje mieloide de las células mientras que 1.000 EB empujado hacia el linaje eritroide 20. En otro estudio, los OC pequeños favorecieron diferenciación endodermo mientras que EB mayores promovidos hacia la diferenciación neuro-ectodermo 11, 17. Estos estudios anteriores sugieren fuertemente que el número de células ESC / iPS utilizados para hacer EBS individuales afectan EBS diferenciación basado en cualquier tipo de células. Sin embargo, hasta donde sabemos, no hay estudios actuales que han dilucidado el impacto del tamaño de EB en su propensión a diferenciarse hacia RPE. El objetivo de este estudio es caracterizar la influencia deTamaño de EB en las células (iPS) madre pluripotentes inducidas - epitelio pigmentario de la retina (iPS-RPE) diferenciación y para identificar el número de células óptimo para hacer los EBS para la diferenciación dirigida hacia linaje RPE.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:239px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:140px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:161px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mTeSR1 media + 5X supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">M-7154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH30853.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">MEM media</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">N1 supplement</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">N-6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Taurine</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">H0888-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH3008803HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-l-thyronine sodium&#160; salt</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dispase</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Matrigel</td>
			<td style="width:183px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:140px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Aggrewell 400 plate</td>
			<td style="width:183px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td>27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">AggreWell medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Mouse Anti-PAX6 antibody</td>
			<td colspan="2">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit Anti- RX antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab23340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Mouse&#160; Anti-MITF antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MS-772-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>40-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">RNeasy plus mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">PCR master mix</td>
			<td>promega</td>
			<td>M7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">High capacity RNA to c DNA kit</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td>4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deriving retinal pigment epithelium (rpe) from induced pluripotent stem (ips) cells by different sizes of embryoid bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

En este experimento, las células iPS fueron cultivadas y diferenciarse en el linaje RPE de EBS. EBS de tamaños controlados se formaron utilizando placas de micropocillos. Como se ve en la figura 1 la formación de EB fue homogénea en las placas de micropocillos. Estos EB fueron recogidos y se sembraron en placas de 6 pocillos (Figura 2). RPE puede ser identificado por su clásica hexagonal morfología, pigmentación, y la expresión de marcadores de RPE. ...

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Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

El objetivo de este informe es describir los protocolos para derivar el epitelio pigmentario de la retina (EPR) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPS) utilizando diferentes tamaños de cuerpos embrionarios.

Derivadas del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de madre pluripotentes inducidas (iPS) células de diferentes tamaños de cuerpos embrionarios

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

deriving-retinal-pigment-epithelium-rpe-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

10.5K vistas.  U.S. Army Institute of Surgical Research.  El objetivo de este informe es describir los protocolos para derivar el epitelio pigmentario de la retina (EPR) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPS) utilizando diferentes tamaños de cuerpos embrionarios. 

Video: Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

Derivación eficiente de células de la retina epitelio pigmentario de Células Madre

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Análisis de inducida por ácido retinoico Neural diferenciación de células madre embrionarias de ratón en cuerpos embrioides dos y tres dimensiones

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Diferenciación de los condrocitos de las células madre pluripotentes humanas inducidas por la sangre periféricas derivadas de la sangre

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Formación de gránulos condrogénicos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre del cordón umbilical

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Diferenciación rápida y dirigida de las células epiteliales del pigmento retiniano de humanos embrionarios o inducidas pluripotenciales células

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

Ingeniería del tejido epitelio pigmentario de la retina trasplante adecuado derivado de células madre embrionarias humanas

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent epiblast cells by orchestrated exposures to cytokines, including bone morphogenetic protein 4 (Bmp4). In human embryos, the earliest PGCs have been identified on the endodermal wall of yolk sac around the end of the 3rd week of gestation, but little is known about the process of human PGC specification and their early development. To circumvent the technical and ethical barriers of studying human embryonic PGCs, surrogate cell culture models have been recently generated from pluripotent stem cells. Here, we describe a 13-day protocol for robust production of human PGC-Like Cells (hPGCLCs). Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) maintained in the primed pluripotency state are incubated in the 4i na&#239;ve reprogramming medium for 48 hours, dissociated to single cells, and packed into microwells. Prolonged maintenance of hiPSCs in the na&#239;ve pluripotency state causes significant chromosomal aberrations and should be avoided. hiPSCs in the microwells are maintained for an additional 24 hours in the 4i medium to form embryoid bodies (EBs), which are then cultured in low-adherence plasticware under a rocking condition in the hPGCLC induction medium containing a high concentration of recombinant human BMP4. EBs are further cultured for up to 8 days in the rocking, non-adherent condition to obtain maximum yields of hPGCLCs. By immunohistochemistry, hPGCLCs are readily detected as cells strongly expressing OCT4 in almost all EBs exclusively on their surface. When EBs are enzymatically dissociated and subjected to FACS enrichment, hPGCLCs can be collected as CD38+ cells with up to 40-45% yield.

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of both sperm and eggs. Human embryonic PGCs are specified from pluripotent epiblast cells through interactions of cytokines. Here, we describe a 13-day protocol of inducing human cells transcriptomally resembling PGCs at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells.

Generación humana Primordial células germinales-como las células en la superficie de cuerpos de Embryoid de pluripotencia cebada inducida por células madre pluripotentes

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Generación de 3D piel organoide de cable derivadas de sangre inducida por las células de vástago Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Diferenciación de endotelio hemogénico de células madre pluripotentes humanas en una condición definida libre de alimentador y xeno

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...