La automatización del microscopio de fuerza atómica es una innovación clave en la evolución de la tecnología hacia aplicaciones biomédicas. También se abre el acceso a la investigación de las propiedades biomecánicas de las poblaciones celulares. Nuestro método permite registrar mediciones de AFM para 1,000 células en cuatro horas, en comparación con los métodos habituales, que toman cuatro horas para medir 10 células, esto es realmente una ganancia significativa de tiempo.
Si la automatización es un requisito previo para llevar esta tecnología a los laboratorios hospitalarios, este protocolo de prueba de concepto sugiere su potencial para su uso en el desarrollo de estrategias de diagnóstico médico específicas. Este protocolo utiliza un tallo PDMS versátil que se puede llenar con varios microbios que permiten explorar diferentes sistemas. Para preparar el sello PDMS, mezcle 55 gramos de solución prepolímero PDMS en una relación de masa de 10 a una en PDMs, oligómeros y agente de curado y desgaste la solución resultante al vacío una vez 10 a la negativa una a una vez 10 veces 10 a las dos barras negativas durante cinco a 10 minutos.
Cuando se hayan eliminado todas las burbujas de las trampas, vierta 20 gramos de la solución desgastada en un molde maestro de silicio a un espesor de dos a tres milímetros y desgasificar de nuevo. Cuando se hayan eliminado todas las burbujas, reticular el PDMS a 80 grados Celsius durante una hora y usar un bisturí para cortar el sello microestructurado pdms paralelo a las matrices de microestructura visibles. Luego, desprenda el sello del molde maestro de silicio y coloque el sitio de microestructura de sello en una diapositiva de vidrio con las micro estructuras alineadas con el lado de la diapositiva.
Para preparar las celdas para el dispositivo, centrífuga 600 microlitros de la suspensión celular de interés y agregue 200 microlitros del sobrenadante al sello. Desgasificar el sobrenadante al vacío durante unos 40 minutos. Cuando se hayan eliminado todas las burbujas, substituya el sobrenadante de la superficie del PDMS con 200 microlitros de la solución de células resuspended para una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente.
Para cargar las celdas en las micro estructuras del sello, utilice un portaobjetos de vidrio sostenido en un ángulo de 30 a 50 grados para extender las celdas a través del sello en ambas direcciones, varias veces según sea necesario. Cuando se haya logrado una alta tasa de llenado de las microestructuras, utilice una pipeta para eliminar la suspensión de la célula y lave las tres veces con un mililitro de tampón de acetato por lavado para eliminar cualquier célula sin atraquear. Después del último lavado, use el flujo de nitrógeno para secar la parte posterior de la muestra y coloque el sello en una placa de Petri.
A continuación, añadir dos mililitros de tampón de acetato fresco al plato. Para la microscopía de fuerza atómica de las células, coloque el plato en la etapa del microscopio de fuerza atómica y centre la etapa de cero a cero. Cuando el escenario se haya centrado, mueva la placa al soporte de la placa petri del microscopio y alinee el borde del sello para que sea perpendicular al eje y del soporte de la placa Petri.
Luego coloque la cabeza de fuerza del microscopio atómico en el escenario, teniendo cuidado de que los motores paso a paso estén lo suficientemente extendidos para evitar que la punta se estrelle contra el sello. Para obtener imágenes, utilice las perillas del microscopio para centrar la punta del microscopio de fuerza atómica sobre la esquina izquierda de los pozos de micromedios cuadrados de 4,5 por 4,5 metros y seleccione el modo de mapeo de fuerza en el software del microscopio. Para establecer un mapa de fuerza de 64 por 64 sobre un área de 100 por 100 micrómetros, establezca el punto de configuración relativo en tres a cinco nano Newtons, la longitud Z en cuatro micrómetros, el movimiento Z a duración constante, el tiempo de extensión a 0,01 segundos, el retardo de extensión a cero, el retardo de retracción a cero, el modo de retardo a fuerza constante , la velocidad de muestreo a 2048 Hertz.
Desmarque Z bucle cerrado y compruebe la imagen cuadrada. Establezca el acceso rápido a 100 micrómetros, el eje lento a 100 micrómetros, el desplazamiento X a cero micrómetros, el desplazamiento Y a cero micrómetros, el ángulo de la cuadrícula a cero grados, los píxeles a 64 por 64 y la proporción de píxeles a uno a uno. A continuación, abra el software de automatización.
En la ventana emergente, seleccione la ruta hacia el archivo de script. Introduzca la coordenada W1 en la línea variable P1 239 de la sección del cuadro de entradas del script gyfon y el valor de la coordenada W2 en la línea variable P2 241. Atribuya el valor de tono a la línea de variable de tono 245 del script e ingrese la dimensión del pozo, que se puede determinar a partir del diseño de los patrones de pozo en la línea variable W-S 248.
Escriba la ruta al directorio de almacenamiento en la línea 251 para guardar los datos en el lugar deseado y establezca la línea variable de área total 254 al deseo en el extremo múltiple de los 100 micrómetros. A continuación, establezca la fila de la matriz de curvas de fuerza y la columna registrada por pozo en la línea variable de escaneos numéricos 257 y haga clic en ejecutar para iniciar el programa. Para analizar los datos, utilice el software de código video studio para abrir el script de Python y ejecutar el script de Python copy files para organizar los archivos de curva de fuerza en una carpeta.
Introduzca la ruta de acceso a la carpeta general donde se almacenarán los datos. para analizar las curvas de fuerza, abra el software de procesamiento de datos del fabricante del microscopio de fuerza atómica. En el menú archivo, seleccione lote de curvas de espectroscopia.
A continuación, seleccione el archivo y el proceso de carga, y seleccione el proceso de rigidez. Seleccione el último paso del proceso y haga clic en mantener y aplicar a todos para que todas las curvas de fuerza reciban el mismo tratamiento. Para abrir el script de R, cargue los archivos que contienen la información extraída con el software de procesamiento de datos en el software de estudio de R.
En la ventana del entorno, haga clic en Importar conjunto de datos y, en el lector de texto de la ventana emergente, haga clic en Examinar para localizar el archivo TSV de puntos. Una vez cargado el archivo, seleccione la región de ejecución de código y ejecute todo para ejecutar todo el código. Aquí, se muestran los histogramas típicos obtenidos utilizando el protocolo como se muestra.
En este análisis, la rigidez repartición se registró en 957 células nativas, mientras que en este análisis, se midió la rigidez de 574 células tratadas con caspofungina. Sepa que el uso de cientos de celdas permite una distribución bi-modal de los valores a observar. En muestras más pequeñas, normalmente se observa una sola distribución que puede resultar en la falta de observación de la heterogeneidad de la población.
Una comparación de las dos condiciones destaca los efectos de caspofungina en la reducción de la rigidez celular. A revelado por la comparación de ANOVA de las células nativas y tratadas, las dos condiciones exhiben altamente, tiesuras perceptiblemente diversas. Este valor se alcanzó debido al gran número de células analizadas, proporcionando una mayor confianza en los resultados obtenidos.
Agregar el sobrenadante al sello PDMS antes de vaciar repetidamente las celdas en los pozos hasta que el sello esté lleno, es fundamental para el éxito del análisis. En esta prueba de concepto, las células de los albicans de la candida eran analizadas pero el protocolo se puede aplicar a cualquier grupo de células, de moléculas, o de materiales del patrón.
