El autor agradece a Susan Whitfield para la preparación de las figuras y Camille Martin y Hillary Samagaio para asistencia con algunos de los experimentos.

<ol>
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El autor declara que ella no tiene competencia financieras intereses.

Es importante ser consciente de todas las superficies que las bacterias pueden adherirse durante el experimento. Así se pueden subestimar las bacterias que son capaces de unirse a cristal si se realiza un recuento viable usando tubos de vidrio y pipetas. Si las plantas se cultivan en agar o suelo y algunos del agar o suelo permanece en las plantas las bacterias pueden enlazar el material adherido en lugar de a las plantas. Por otro lado, lavar la superficie de la planta, particularmente en el caso de las raíces, puede quitar capas superficiales naturales tales como mucosa y alterar así los resultados de pruebas de adherencia.
Es importante estar seguro de que las bacterias se añade a la mezcla de incubación siguen vivas durante el experimento. Así rutinariamente se hagan recuentos de células viables de bacterias libres como adjuntadas. Algunas mutaciones bacterianas o tratamientos pueden reducir la tasa de crecimiento bacteriano o causan la muerte de una fracción de la población bacteriana. Bacterias vivas y muertas no sean distinguibles en el microscopio a menos que se utilizan tinciones especiales. Existe un kit de tinción útil para bacterias muertas o vivir que depende de la exclusión de los tintes de las bacterias vivas. Sin embargo, si una población mixta de especies bacterianas entonces recuento viable de la especie de interés es probablemente el método más fácil para determinar si la incubación ha resultado en la muerte bacteriana.
Composición medio influirá en crecimiento y supervivencia bacteriana. Exudado de raíz y materiales liberados de la herida y cortar los sitios proporcionará sustrato para crecimiento bacteriano modesto. Fosfato, nitrógeno y hierro tienden a ser limitante en estas condiciones. Cationes divalentes como calcio y magnesio pueden influir en la adherencia. En algunos casos fuente de carbono puede influir en la adherencia. pH es también importante. En general el pH de la rizosfera es entre 5.5 y 6.5.
Es necesario tener cuidado en el uso de bacterias con resistencia a los antibióticos. Los antibióticos más frecuentemente utilizados son la rifampicina y ácido nalidíxico. La resistencia a estos antibióticos es generalmente debido a mutaciones en genes cromosómicos (ARN polimerasa y la girasa, respectivamente) y por lo tanto no puede ser fácilmente transferido a otra cepa durante la incubación. Este tipo de resistencia no resulta en la degradación o modificación del antibiótico. Las bacterias de la marca con un marcador de genes portados por el plásmido no se recomienda a menos que el plásmido no puede transferirse a otras bacterias. La resistencia a los antibióticos no debe ser debido a la degradación o química modificación del antibiótico como antibióticos bacterias sensibles entonces serán capaces de crecer en placas de antibióticos si se ubican cerca de las bacterias resistentes.
Los métodos descritos en este documento son útiles para pequeños tamaños de muestra o experimentos donde las muestras deban ser contenida (por ejemplo, experimentos con patógenos humanos). Para tamaños de muestra grande (sobre 100 g de material o de más de 50 plantas) otros métodos o modificación drástica de estos métodos serían necesarios10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. la presencia de grandes cantidades de microorganismos distintos de las especies estudiadas también puede plantear problemas importantes. Posibles soluciones incluyen el uso de bacterias marcadas con una proteína fluorescente o resistencia a los antibióticos como se describe en los pasos 6.1.2 y 7.3. Sin embargo, cuando las bacterias de interés son raros individuos en una población grande de otros microorganismos estos marcadores no pueden ser suficientes para permitir una evaluación clara de los números de las bacterias estudiadas.
Todos los métodos descritos aquí son métodos de laboratorio en. Modificaciones menores se necesitarían estudios de invernadero. Más modificaciones mayores están probable que sean necesarios para estudios de campo donde protozoos, insectos y otros animal variación de depredación y el clima complican la provisión de condiciones definidas para los experimentos. En el futuro estos métodos pueden ampliarse para incluir las interacciones de dos o más microorganismos en la superficie de la planta.

La medición de Unión bacteriana a las superficies de la planta se ha convertido en importante en tres situaciones diferentes. La primera situación es el examen de la transmisión de los patógenos humanos en planta superficies1,2,3. El objetivo aquí es para prevenir el atascamiento bacteriano o eliminar o matar bacterias encuadernadas y así reducir la transmisión de la enfermedad en material vegetal. La segunda situación es el examen de la Unión de patógenos de plantas a sembrar superficies4. Una vez más el objetivo aquí es para evitar vinculante o eliminar o matar bacterias encuadernadas y así reducir la enfermedad. La tercera situación es el examen de la fijación de las bacterias simbióticas o promoción de crecimiento vegetal5,6. El objetivo aquí es promover bacterias vinculante y así al aumento de la salud de las plantas y cultivos los rendimientos.
Las técnicas para medir la Unión bacteriana a superficies descritas en este artículo la planta son baratos y relativamente fáciles de realizar. Los únicos requisitos son un microscopio y materiales encontrados generalmente en un laboratorio de bacteriología. Para algunas técnicas un sonicador de baño es útil. Las técnicas descritas están diseñadas para atar los experimentos realizados con muestras relativamente pequeñas. De Unión se realizan en el laboratorio, aunque es posible modificar algunas de estas técnicas para el uso en el invernadero o en el campo.
Estas técnicas se han utilizado para medir la Unión bacteriana a las raíces, brotes, hojas de corte, corte frutas y tomates intactos en el laboratorio7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Se han utilizado también para medir la colonización de raíces de plantas que crecen en el suelo o arena en el laboratorio16. Las técnicas se han utilizado muchas especies bacterianas incluyendo tumefaciens de la agrobacteria, Sinorhizobium meliloti, Escherichia coli, Salmonella enterica y Pseudomonas fluorescens. Una útil descripción de métodos para evaluar la interacción de a. tumefaciens con superficies puede encontrarse en Morton y Fuqua (2012)17. En todos los casos los tamaños de la muestra participantes eran pequeños, generalmente menos que las plantas de 25-50. Las técnicas descritas son adecuadas para uso con patógenos humanos que deben mantenerse independientes durante los experimentos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:731px;" width="731">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:143px;">light microscope</td>
			<td style="width:164px;">any</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;">phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">seeds</td>
			<td style="width:164px;">any&#160;</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;">make a note of the seed lot number and the cultivar</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">bleach</td>
			<td style="width:164px;">any</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">bath sonicator</td>
			<td style="width:164px;">any scientific supply company</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">T9284</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">nutrient agar&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Difco&#160;</td>
			<td style="width:125px;">001-01-8</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">soytone</td>
			<td style="width:164px;">Difco&#160;</td>
			<td style="width:125px;">24360</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">Sand</td>
			<td style="width:164px;">sea sand Fisher Scientific</td>
			<td style="width:125px;">S25</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">sand</td>
			<td style="width:164px;">&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">S9887</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">conetainers</td>
			<td style="width:164px;">Stuewe &#38; Sons, Inc.</td>
			<td style="width:125px;">Ray-Leach cone-tainers</td>
			<td style="width:299px;">many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">parafilm</td>
			<td style="width:164px;">any scientific supply company</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">MS salts</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">M5524</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">parrafin</td>
			<td style="width:164px;">any</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">centrigfuge</td>
			<td style="width:164px;">any scientific company</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;">to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">vortex mixer</td>
			<td style="width:164px;">any scientific company</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">micrometer</td>
			<td style="width:164px;">ACCU-SCOPE Accessories</td>
			<td style="width:125px;">A3145</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">Sedgwick-rafter counting cell</td>
			<td style="width:164px;">Hauser Scientific</td>
			<td style="width:125px;">HS3800</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">probe-clip press-seal incubatin chamber</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">Z359483</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">rifampicin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">R3501</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">naladixic acid</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">n8878</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">Live/dead stain</td>
			<td style="width:164px;">In Vitrogen Molecular Bioprobes</td>
			<td style="width:125px;">L7007</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adherence of bacteria to plant surfaces measured in the laboratory

Este manuscrito describe un método para medir la Unión bacteriana a las superficies de la planta axénicos en el microscopio óptico y mediante el uso de recuento de células viables. Materiales de planta usados incluyen raíces, brotes, hojas y cortan de frutas. Los métodos descritos son baratos, fácil y conveniente para pequeños tamaños de muestra. Enlace se mide en el laboratorio y puede utilizarse una variedad de medios de incubación y las condiciones. Puede determinarse el efecto de inhibidores. Situaciones que promueven e inhiben la Unión también pueden ser evaluadas. En algunos casos es posible distinguir si varias condiciones modificar enlace debido principalmente a sus efectos sobre la planta o en las bacterias.

A. tumefaciens coloniza las superficies radiculares. Con el fin de determinar si la producción bacteriana de la celulosa desempeña un papel en la colonización de la raíz, los efectos de las mutaciones bacterianas que impiden la síntesis de celulosa fueron examinados16. Se utilizaron las técnicas descritas en los pasos 1,3 y 7.1. Semillas de tomate eran superficie esterilizada y germinadas en agua estéril. Cuando las raíces fueron aproximadamente 2 cm de largo fueron sumergidas en una suspensión de 105 bacterias / mL y plantados en el suelo pasteurizado en contenedores. Las plantas fueron cultivadas durante 14 días a 25 ° C en un ciclo oscuro h 12 h luz/12. Después de la indicada veces las plantas fueron removidos de los contenedores. Las raíces fueron lavadas y sonicadas en un sonicador de baño para eliminar las bacterias encuadernadas. Números de bacterianos se determinaron utilizando el recuento de células viables. La figura 2 muestra el efecto de dos diversas mutaciones de celulosa-menos en la capacidad de las bacterias para colonizar las raíces de tomate. Aunque las desviaciones estándar de las mediciones eran tan altas como 0.9 log10 (un problema común con este tipo de medición) la reducción en el atascamiento de los mutantes menos celulosa es claramente evidente y podemos concluir que la producción bacteriana de celulosa ayuda a la bacteria en la colonización de raíces de tomate.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg"> Figura 2 : Raíz de la colonización de tipo salvaje y menos celulosa mutantes de a. tumefaciens. Log10 número total de bacterias por cm longitud de la raíz de raíces de tomate inoculadas con cepa de tipo salvaje a. tumefaciens C58 y mutantes menos celulosa C58:1 y C58:A60. Los números que aparecen son el medio de un mínimo de cuatro experimentos separados. Las barras indican las desviaciones estándar de los medios. Las raíces se inocularon por inmersión en una suspensión de 105 bacterias / mL para un minuto. Las plantas fueron cultivadas en contenedores y las bacterias libremente adherentes fueron quitadas por el lavado de las raíces en lavado tampón en un frasco de vidrio. Bacterias firmemente adheridas fueron quitadas usando un sonicador de baño y la suspensión resultante plateado para determinar recuento viable16. Esta figura ha sido modificada de Matthysse y McMahan. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Se examinó el papel de exopolisacáridos en la Unión de e. coli y otras bacterias a brotes de alfalfa. Algunos brotes de enfermedad diarreica por e. coli O157: H7 se trazaron a brotes de alfalfa contaminada. Unión de las bacterias de tipo silvestre y mutantes incapaces de hacer distintos exopolisacáridos se midió usando los métodos descritos en los pasos 1.1, 5.1 y 7.2. Brotes de alfalfa fueron superficie esterilizada y germinó un día en agua estéril a 25 ° C en la oscuridad. Cuatro brotes con las capas de semilla adjuntadas fueron colocados en platos de plástico estériles que contiene 5 mL de agua. Las bacterias cultivadas en caldo Luria fueron agregadas a una concentración final de aproximadamente 5 x 103 / mL. Los brotes inoculados se incubaron a 25 ° C en la oscuridad durante 3 días. Los brotes fueron lavados dos veces en 5 mL de agua estéril en un vial por inversión vigorosa y homogeneizó en lavado Tampón utilizando un homogeneizador de vidrio teflón motorizado. Experimentos anteriores utilizando bacterias marcan con un plásmido portador del gen GFP demostrado ningunas bacterias internalizadas aunque fácilmente se observaron bacterias superficiales. Los resultados se muestran en la tabla 1. Examinaron a dos cepas de e. coli O157: H7. En ambas cepas la producción de poli-β-1, 6-glucurónico acid(PGA) parece hacer la contribución más grande a la Unión del patógeno e. coli a las superficies de la planta. Ácido colónico también desempeñó un papel significativo en la Unión. Mientras que la reducción en el atascamiento en celulosa menos mutantes fue significativa no era tan grande como para los otros dos polisacáridos.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Efectos de las mutaciones en los Genes de producción de exopolisacárido en encuadernación de E. coli O157: H7 brotes y capas de semilla abiertas</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Cepa bacteriana</td>
			<td rowspan="2">Mutación o genotipo (fenotipo relevante)</td>
			<td colspan="2">Sesión número10 de bacterias límite por brote o Testa</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alfalfa brotesb
</td>
			<td>Capas de semilla abiertas</td>
		</tr>
<tr>
<td>86-24</td>
			<td>Ninguno (tipo salvaje)</td>
			<td>4.7 ± 0.6</td>
			<td>5.6 ± 0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624N</td>
			<td>
yhjN (celulosa-minus)</td>
			<td>2,9 ± 0,7c
</td>
			<td>3.5 ± 0.6c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>C 8624</td>
			<td>
wcaD (colon menos ácido)</td>
			<td>de 1,8 ± 0,7c
</td>
			<td>2.4 ± 0,5c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624P</td>
			<td>
Camp (PGA-minus)</td>
			<td>< 1.0c
</td>
			<td>± 1.0 1.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4A</td>
			<td>Ninguno (tipo salvaje)</td>
			<td>5.6 ± 0,2</td>
			<td>6.1 ± 0.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AN</td>
			<td>
yhjN (celulosa-minus)</td>
			<td>4.8 ± 0.8d
</td>
			<td>4.1 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AC</td>
			<td>
wcaD (colon menos ácido)</td>
			<td>3,9 ± 0,5c
</td>
			<td>4.8 ± 0.8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AP</td>
			<td>
Camp (PGA-minus)</td>
			<td>< 1.0c
</td>
			<td>1,2 ± 0,7c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">una media ± desviación estándar de un mínimo de tres mediciones de la cantidad (log10) de bacterias límite después de 3 días.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">b brotes fueron lavados antes de la medición.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">c significativamente diferente del tipo silvestre: P < 0.01.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">d significativamente diferente del tipo silvestre: P < 0.05.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Esta tabla ha sido modificada de Matthysse, Deora, Mishra y Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: efectos de mutaciones en genes de producción de exopolisacárido en Unión de E. coli O157: H7 a brotes. Para determinar el papel de exopolisacáridos y lipopolisacáridos en la Unión del patógeno e. coli O157: H7 cepas de brotes de alfalfa, la Unión de un conjunto de mutantes para los brotes y abiertas capas de semilla fue examinada usando los métodos se describe en el paso 6. Los resultados mostraron que poli-ß-1, 6 -N-acetil-D-glucosamina (PGA) parece ser esencial para la Unión a brotes y eso ácido de la celulosa y colanic son necesarios para la máxima unión de e. coli O157. Esta tabla ha sido modificada de Matthysse, Deora, Mishra y Torres10.
Con el fin de determinar si la producción de PGA es suficiente causar el atascamiento bacteriana a las superficies, un plásmido (pMM11) llevando el operón clonado los genes necesarios para la PGA de codificación producción fue introducida en dos diferentes bacterias que no Normalmente podrá enlazar a las raíces de tomate10. A. tumefaciens A1045 es un mutante de la cepa de tipo salvaje C58 que no puede hacer el glucano cíclico-β-1, 2 y tampoco se unen para plantar superficies29. Sinorhizobium meliloti 1021 que forma nódulos radiculares en alfalfa es incapaz de enlazar no leguminosas incluyendo tomate12. Las técnicas descritas en los pasos 1.1, 5.1, 6.3 y 7.1 se utilizan para determinar si la capacidad de hacer PGA generalmente aumentar Unión bacteriana a las superficies radiculares. Semillas de tomate eran superficie esterilizada y germinadas en agua estéril. Raíces se corta en segmentos de 1 cm de longitud y se colocaron en agua estéril y se inocularon las bacterias. Como estas dos especies de bacterias crecen a tasas diferentes, Unión se midió en diferentes momentos para permitir que cantidades aproximadamente iguales de crecimiento bacteriano. La presencia de la pMM11 del plásmido causó un aumento significativo similar en el número de bacterias dependientes de ambas especies (tabla 2)10. También se observó un aumento significativo en la Unión en el microscopio óptico, pero el enlace fue muy diferente para las dos especies (figura 3). A. tumefaciens A1045 obligado como bacterias individuales a la superficie de la raíz. S. meliloti atado en grandes grupos en los que sólo algunas de las bacterias fueron Unidos directamente a la raíz y la mayoría de las bacterias fueron unida a otras bacterias. Este ejemplo muestra que el simplemente analizando los números de destino sin incluir observaciones microscópicas de bacterias puede dar una impresión errónea de los resultados de un experimento. Aunque ambos métodos (recuento de células viables y observaciones microscópicas) muestran que pMM11 mayor atascamiento bacteriano a las raíces de tomate, el tipo de enlace por la producción de PGA fue diferente para las dos especies bacterianas10.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">El efecto de la pMM11 del plásmido en la Unión de bacterias a las raíces de tomate</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cepa bacteriana</td>
			<td>Plásmido</td>
			<td>Limitado número de bacterias por mm de longitud de raíz</td>
		</tr>
<tr>
<td>A. tumefaciens A1045un
</td>
			<td>ninguno</td>
			<td>0.25 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vector)</td>
			<td>0.25 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (síntesis de PGA)</td>
			<td>10 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td>S. meliloti 1021b
</td>
			<td>ninguno</td>
			<td>ninguno detecta</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vector)</td>
			<td>ninguno detecta</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (síntesis de PGA)</td>
			<td>50 x 103 ± 5 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">un atascamiento bacteriano se midió después de 2 horas</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">b Unión bacteriana fue medida después de 18 horas</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Esta tabla ha sido modificada de Matthysse, Deora, Mishra y Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: el efecto de un plásmidos portadores de genes para la síntesis de PGA en Unión de A. tumefaciens A1045 y S. meliloti 1021 a segmentos de raíz de tomate. Para examinar la capacidad de poli-ß-1, 6 -N-acetil-D-glucosamina (PGA) para promover la Unión de las bacterias a las raíces, el efecto de un plásmido que confiere la habilidad de hacer PGA (pMM11) en la Unión de dos cepas de bacterias a la planta las raíces del tomate fue examinado. Ninguna cepa de bacterias demostró Unión significativa a las raíces de tomate en la ausencia del plásmido o ante la presencia del plásmido sin los genes que codifican la síntesis de la PGA (pBBR1mcs). La adición de los plásmidos portadores de genes de síntesis de PGA aumentó vinculante por ambos tipos de bacterias. Porque a. tumefaciens crece más rápido que el enlace de S. meliloti se midió después de 2 h de incubación para a. tumefaciens y 18 h de S. meliloti. Las técnicas utilizadas son las que se describen en el paso 7. Esta tabla ha sido modificada de Matthysse, Deora, Mishra y Torres10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg"> Figura 3 : El efecto de la pMM11 del plásmido lleva los genes de biosíntesis de la PGA en la Unión de a. tumefaciens A1045 S. meliloti 1021 a pelos de la raíz de tomate. Enlace a pelos de la raíz del tomate de la A) a. tumefaciens A1045, B) pMM11 de a. tumefaciens A1045, C) S. meliloti 1021 y D) pMM11 de S. meliloti 1021. Aunque el aumento en la Unión de las dos especies bacterianas es más o menos similar, los detalles del enlace como se ve en el microscopio óptico son muy diferentes. Las técnicas utilizadas son las que se describen en el paso 6. Esta figura ha sido modificada de Matthysse, Deora, Mishra y Torres10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
A veces es posible utilizar Unión a superficies no-biológicos para ayudar a distinguir la contribución de las bacterias y de la planta en una interacción específica. La polysaccharide(UPP) unipolar de a. tumefaciens ha demostrado ser capaz de mediar la Unión bacteriana a una variedad de ambas superficies biológicas y no biológicas30. Calcio se observó que inhiben el atascamiento de a. tumefaciens a sembrar superficies mediadas por la UPP28. Con el fin de determinar si la inhibición por los iones del calcio de Unión bacteriana a las superficies de la planta es debido a un efecto sobre las bacterias o sobre la superficie de la planta, se examinó la Unión de las bacterias a hilos de nylon. Las técnicas se describe en el paso 8.2 fueron utilizados. Semillas de tomate eran superficie esterilizada y germinó en el agua como se describe en el paso 1. Las bacterias fueron cultivadas en medio mínimo con sacarosa y añadidas a las raíces de tomate o hilos de nylon a una concentración final de aproximadamente 105/ml como se describe en el paso 5.1. El efecto del agregado de CaCl2 en Unión bacteriana en raíces de tomate e hilos de nylon fue examinado en el microscopio. La figura 4 muestra una inhibición similar de unión de calcio utilizando cualquier superficie lo que sugiere que el efecto del calcio es principalmente en las bacterias10.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg"> Figura 4 : El efecto del calcio sobre el atascamiento de a. tumefaciens a pelos de la raíz de tomate e hilos de nylon. A. tumefaciens se incubó con raíces de tomate (A y B) o hilos de nylon (C y D) durante 24 h en un 1:10 dilución de sales MS y una 1:20 dilución de medio mínimo AB, 0.4% de sacarosa (A y C) o en un 1:10 dilución de sales MS y 1:20 dilución de medio mínimo AB , 0.4% de sacarosa que contiene 60 mM CaCl2 (B y D)31. El agregado de CaCl2 inhibe Unión bacteriana a raíces e hilos de nylon, lo que sugiere que la inhibición era principalmente debido a un efecto en las bacterias y no en la superficie de la planta. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

Un método sencillo para medir y caracterizar la adherencia bacteriana a las plantas, especialmente las raíces y brotes, se describe en este artículo.

Adherencia de bacterias a las superficies de midieron en el laboratorio de la planta

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

adherence-of-bacteria-to-plant-surfaces-measured-in-the-laboratory

Research

JoVE Journal

Environment

12.5K vistas.  University of North Carolina at Chapel Hill. Un método sencillo para medir y caracterizar la adherencia bacteriana a las plantas, especialmente las raíces y brotes, se describe en este artículo.

Video: Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of electrical transmission between distant cells in an organism requires in vivo, artifact-free recordings of cells embedded within their native environment. The transmission of electrical signals from wounded to unwounded areas in a plant has since long piqued the interest of botanists. The phloem, the living part of the plant vasculature that is spread throughout the plant, has been postulated as a major tissue in electrical transmission in plants. The lack of suitable electrophysiological methods poses many challenges for the study of the electrical properties of the phloem cells in vivo. Here we present a novel approach for intracellular electrophysiology of sieve elements (SEs) that uses living aphids, or other phloem-feeding hemipteran insects, integrated in the electrical penetration graph (EPG) circuit. The versatility, robustness, and accuracy of this method made it possible to record and study in detail the wound-induced electrical signals in SEs of central veins of the model plant Arabidopsis thaliana1. Here we show that EPG-electrodes can be easily implemented for intracellular electrophysiological recordings of SEs in marginal veins, as well as to study the capacity of SEs to respond with electrical signals to several external stimuli. The EPG approach applied to intracellular electrophysiology of SEs can be implemented to a wide variety of plant species, in a large number of plant/insect combinations, and for many research aims.

A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.

Una nueva aplicación de la eléctrica Penetración Gráfico (EPG) para la adquisición y medición de señales eléctricas en el floema Tamiz Elementos

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

Investigación

Medio ambiente

Laboratory Simulation of an Iron(II)-rich Precambrian Marine Upwelling System to Explore the Growth of Photosynthetic Bacteria

A conventional concept for the deposition of some Precambrian Banded Iron Formations (BIF) proceeds on the assumption that ferrous iron [Fe(II)] upwelling from hydrothermal sources in the Precambrian ocean was oxidized by molecular oxygen [O2] produced by cyanobacteria. The oldest BIFs, deposited prior to the Great Oxidation Event (GOE) at about 2.4 billion years (Gy) ago, could have formed by direct oxidation of Fe(II) by anoxygenic photoferrotrophs under anoxic conditions. As a method for testing the geochemical and mineralogical patterns that develop under different biological scenarios, we designed a 40 cm long vertical flow-through column to simulate an anoxic Fe(II)-rich marine upwelling system representative of an ancient ocean on a lab scale. The cylinder was packed with a porous glass bead matrix to stabilize the geochemical gradients, and liquid samples for iron quantification could be taken throughout the water column. Dissolved oxygen was detected non-invasively via optodes from the outside. Results from biotic experiments that involved upwelling fluxes of Fe(II) from the bottom, a distinct light gradient from top, and cyanobacteria present in the water column, show clear evidence for the formation of Fe(III) mineral precipitates and development of a chemocline between Fe(II) and O2. This column allows us to test hypotheses for the formation of the BIFs by culturing cyanobacteria (and in the future photoferrotrophs) under simulated marine Precambrian conditions. Furthermore we hypothesize that our column concept allows for the simulation of various chemical and physical environments &#8212; including shallow marine or lacustrine sediments.

Laboratory Simulation of an IronII-rich Precambrian Marine Upwelling System to Explore the Growth of Photosynthetic Bacteria

We simulated a Precambrian ferruginous marine upwelling system in a lab-scale vertical flow-through column. The goal was to understand how geochemical profiles of O2 and Fe(II) evolve as cyanobacteria produce O2. The results show the establishment of a chemocline due to Fe(II) oxidation by photosynthetically produced O2.

Simulación de un laboratorio de hierro (II) ricos sistema de afloramiento Precámbrico marina para explorar el crecimiento de bacterias fotosintéticas

A conventional concept for the deposition of some Precambrian Banded Iron Formations (BIF) proceeds on the assumption that ferrous iron [Fe(II)] upwelling ...

Procedures of Laboratory Fumigation for Pest Control with Nitric Oxide Gas

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on fresh products and procedures for residue analysis and product quality evaluation. An airtight fumigation chamber containing fresh fruit and vegetables is first flushed with nitrogen (N2) to establish an ultralow oxygen (ULO) environment followed by injection of NO. The fumigation chamber is then kept at a low temperature of 2 - 5 &#176;C for a specified time period necessary to kill a target pest to complete a fumigation treatment. At the end of a fumigation treatment, the fumigation chamber is flushed with N2 to dilute NO prior to opening the chamber to ambient air to prevent the reaction between NO and O2, which produces NO2 and may damage delicate fresh products. At different times after NO fumigation, NO2 in headspace and nitrate and nitrite in liquid samples were measured as residues. Product quality was evaluated after 2 weeks of post-treatment cold storage to determine effects of NO fumigation on product quality. Keeping&#160;O2 from reacting with NO is critical to NO fumigation and is an important part of the protocols. Measuring NO levels is challenging and a practical solution is provided. Possible protocol modifications are also suggested for measuring NO levels in the fumigation chambers as well as residues. NO fumigation has the potential to be a practical alternative to methyl bromide fumigation for postharvest pest control on fresh and stored products. This publication is intended to assist other researchers in conducting NO fumigation research for postharvest pest control and accelerating the development of NO fumigation for practical applications.

This paper describes nitric oxide (NO) fumigation protocols for postharvest pest control. Fumigation chambers are flushed with nitrogen (N2) to establish ultralow oxygen conditions before NO is injected. At the end, chambers are flushed with N2 to dilute NO before exposing products to ambient air to prevent exposure to NO2.

Procedimientos de laboratorio fumigación Control de plagas con Gas de óxido nítrico

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on ...

Experimental Methods of Dust Charging and Mobilization on Surfaces with Exposure to Ultraviolet Radiation or Plasmas

Electrostatic dust transport has been hypothesized to explain a number of observations of unusual planetary phenomena. Here, it is demonstrated using three recently developed experiments in which dust particles are exposed to thermal plasma with beam electrons, beam electrons only, or ultraviolet (UV) radiation only. The UV light source has a narrow bandwidth in wavelength centered at 172 nm. The beam electrons with the energy of 120 eV are created with a negatively biased hot filament. When the vacuum chamber is filled with the argon gas, a thermal plasma is created in addition to the electron beam. Insulating dust particles of a few tens of microns in diameter are used in the experiments. Dust particles are recorded to be lofted to a height up to a few centimeters with a launch speed up to 1 m/s. These experiments demonstrate that photo and/or secondary electron emission from a dusty surface changes the charging mechanism of dust particles. According to the recently developed &#34;patched charge model&#34;, the emitted electrons can be re-absorbed inside microcavities between neighboring dust particles below the surface, causing the accumulation of enhanced negative charges on the surrounding dust particles. The repulsive forces between these negatively charged particles may be large enough to mobilize and lift them off the surface. These experiments present the advanced understanding of dust charging and transport on dusty surfaces, and laid a foundation for future investigations of its role in the surface evolution of airless planetary bodies.

Dust charging and mobilization is demonstrated in three experiments with exposure to thermal plasma with beam electrons, beam electrons only, or ultraviolet (UV) radiation only. These experiments present the advanced understanding of electrostatic dust transport and its role in shaping the surfaces of airless planetary bodies.

Métodos experimentales de polvo de carga y la movilización en las superficies con la exposición a la radiación ultravioleta o Plasmas

Electrostatic dust transport has been hypothesized to explain a number of observations of unusual planetary phenomena. Here, it is demonstrated using ...

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A better mechanistic understanding of these complex plant-microbe interactions will be crucial to improving plant production as well as performing basic ecological studies investigating plant-soil-microbe interactions. Here, a detailed description for ecosystem fabrication is presented, using widely available 3D printing technologies, to create controlled laboratory habitats (EcoFABs) for mechanistic studies of plant-microbe interactions within specific environmental conditions. Two sizes of EcoFABs are described that are suited for the investigation of microbial interactions with various plant species, including Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon, and Panicum virgatum. These flow-through devices allow for controlled manipulation and sampling of root microbiomes, root chemistry as well as imaging of root morphology and microbial localization. This protocol includes the details for maintaining sterile conditions inside EcoFABs and mounting independent LED light systems onto EcoFABs. Detailed methods for addition of different forms of media, including soils, sand, and liquid growth media coupled to the characterization of these systems using imaging and metabolomics are described. Together, these systems enable dynamic and detailed investigation of plant and plant-microbial consortia including the manipulation of microbiome composition (including mutants), the monitoring of plant growth, root morphology, exudate composition, and microbial localization under controlled environmental conditions. We anticipate that these detailed protocols will serve as an important starting point for other researchers, ideally helping create standardized experimental systems for investigating plant-microbe interactions.

Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

This article describes detailed protocols for ecosystem fabrication of devices (EcoFABs) that enable the studies of plants and plant-microbe interactions in highly controlled laboratory conditions.

Protocolos de fabricación (EcoFAB) del ecosistema para la construcción de ecosistemas de laboratorio diseñado para estudiar las interacciones planta-microorganismo

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran insects account for a number of economically substantial pests of plants that cause damage to crops by feeding on phloem sap. The brown marmorated stink bug (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) and the Asian citrus psyllid (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) are hemipteran insect pests introduced in North America, where they are an invasive agricultural pest of high-value specialty, row, and staple crops and citrus fruits, as well as a nuisance pest when they aggregate indoors. Insecticide resistance in many species has led to the development of alternate methods of pest management strategies. Double-stranded RNA (dsRNA)-mediated RNA interference (RNAi) is a gene silencing mechanism for functional genomic studies that has potential applications as a tool for the management of insect pests. Exogenously synthesized dsRNA or small interfering RNA (siRNA) can trigger highly efficient gene silencing through the degradation of endogenous RNA, which is homologous to that presented. Effective and environmental use of RNAi as molecular biopesticides for biocontrol of hemipteran insects requires the in vivo delivery of dsRNAs through feeding. Here we demonstrate methods for delivery of dsRNA to insects: loading of dsRNA into green beans by immersion, and absorbing of gene-specific dsRNA with oral delivery through ingestion. We have also outlined non-transgenic plant delivery approaches using foliar sprays, root drench, trunk injections as well as clay granules, all of which may be essential for sustained release of dsRNA. Efficient delivery by orally ingested dsRNA was confirmed as an effective dosage to induce a significant decrease in expression of targeted genes, such as juvenile hormone acid O-methyltransferase (JHAMT) and vitellogenin (Vg). These innovative methods represent strategies for delivery of dsRNA to use in crop protection and overcome environmental challenges for pest management.

This article demonstrates novel techniques developed for oral delivery of double-stranded RNA (dsRNA) through the vascular tissues of plants for RNA interference (RNAi) in phloem sap feeding insects.

Double-stranded RNA Oral entrega métodos para inducir la interferencia de ARN en floema e insectos Hemipteran alimentación planta de sap

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

Self-standing Electrochemical Set-up to Enrich Anode-respiring Bacteria On-site

Anaerobic respiration coupled with electron transport to insoluble minerals (referred to as extracellular electron transport [EET]) is thought to be critical for microbial energy production and persistence in many subsurface environments, especially those lacking soluble terminal electron acceptors. While EET-capable microbes have been successfully isolated from various environments, the diversity of bacteria capable of EET is still poorly understood, especially in difficult-to-sample, low energy or extreme environments, such as many subsurface ecosystems. Here, we describe an on-site electrochemical system to enrich EET-capable bacteria using an anode as a respiratory terminal electron acceptor. This anode is connected&#160;to a cathode capable of&#160;catalyzing abiotic oxygen reduction. Comparing this approach with electrocultivation methods that use a potentiostat for poising the electrode potential, the two-electrode system does not require an external power source. We present an example of our on-site enrichment utilized in an alkaline pond at the Cedars, a terrestrial serpentinization site in Northern California. Prior attempts to cultivate mineral reducing bacteria were unsuccessful, which is likely due to the low-biomass nature of this site and/or the low relative abundance of metal reducing microbes. Prior to implementing our two-electrode enrichment, we measured the vertical profile of dissolved oxygen concentration. This allowed us to place the carbon felt anode and platinum-electroplated carbon felt cathode at depths that would support anaerobic and aerobic processes, respectively. Following on-site incubation, we further enriched the anodic electrode in the laboratory and confirmed&#160;a distinct microbial community compared to the surface-attached or biofilm communities normally observed at the Cedars. This enrichment subsequently led to the isolation of the first electrogenic microbe from the Cedars. This method of on-site microbial enrichment has the potential to greatly enhance the isolation of EET-capable bacteria from low biomass or difficult to sample habitats.

On-site microbial enrichment or in situ cultivation techniques can facilitate the isolation of difficult-to-culture microbial taxa, especially from low-biomass or geochemically extreme environments. Here, we describe an electrochemical set-up without using an external power source to enrich microbial strains that are capable of extracellular electron transport (EET).

Preparación electroquímica autónomo para enriquecer bacterias respirando de ánodo en el sitio

Anaerobic respiration coupled with electron transport to insoluble minerals (referred to as extracellular electron transport [EET]) is thought to be ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

La prueba de infección de planta: Spray y mediada por la herida la inoculación con el patógeno de planta Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for assessing plant responses to chemicals and other substances of interest is presented. This system is highly efficient in obtaining homogeneous and healthy seedlings of the C3 and C4 model species Arabidopsis thaliana and Setaria viridis, respectively. The sterile cultivation avoids algae and microorganism contamination, which are known limiting factors for plant normal growth and development in hydroponics. In addition, this system is scalable, enabling the harvest of plant material on a large scale with minor mechanical damage, as well as the harvest of individual parts of a plant if desired. A detailed protocol demonstrating that this system has an easy and low-cost assembly, as it uses pipette racks as the main platform for growing plants, is provided. The feasibility of this system was validated using Arabidopsis seedlings to assess the effect of the drug AZD-8055, a chemical inhibitor of the target of rapamycin (TOR) kinase. TOR inhibition was efficiently detected as early as 30 min after an AZD-8055 treatment in roots and shoots. Furthermore, AZD-8055-treated plants displayed the expected starch-excess phenotype. We proposed this hydroponic system as an ideal method for plant researchers aiming to monitor the action of plant inducers or inhibitors, as well as to assess metabolic fluxes using isotope-labeling compounds which, in general, requires the use of expensive reagents.

A simple, versatile, and low-cost in vitro hydroponic system was successfully optimized, enabling large-scale experiments under sterile conditions. This system facilitates the application of chemicals in a solution and their efficient absorption by roots for molecular, biochemical, and physiological studies.

Sistema hidropónico de un Flexible bajo costo para evaluar las respuestas de la planta a moléculas pequeñas en condiciones estériles

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

An Optimized Rhizobox Protocol to Visualize Root Growth and Responsiveness to Localized Nutrients

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive harvest or expensive equipment. We present a customizable and affordable rhizobox method that allows the non-destructive visualization of root growth over time and is particularly well-suited to studying root plasticity in response to localized resource patches. The method was validated by assessing maize genotypic variation in plasticity responses to patches containing 15N-labeled legume residue. Methods are described to obtain representative developmental measurements over time, measure root length density in resource-containing and control patches, calculate root growth rates, and determine 15N recovery by plant roots and shoots. Advantages, caveats, and potential future applications of the method are also discussed. Although care must be taken to ensure that experimental conditions do not bias root growth data, the rhizobox protocol presented here yields reliable results if carried out with sufficient attention to detail.

Visualizing and measuring root growth in situ is extremely challenging. We present a customizable rhizobox method to track root development and proliferation over time in response to nutrient enrichment. This method is used to analyze maize genotypic differences in root plasticity in response to an organic nitrogen source.

Un protocolo de Rhizobox optimizada para visualizar el crecimiento de las raíces y la capacidad de respuesta a nutrientes localizadas

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive ...