Name: adherence of bacteria to plant surfaces measured in the laboratory
Uploaded: 2018-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory at JoVE.com

El autor agradece a Susan Whitfield para la preparación de las figuras y Camille Martin y Hillary Samagaio para asistencia con algunos de los experimentos.

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	<li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere:+a+review.">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).</li><li>Beuchat, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+factors+influencing+survival+and+growth+of+human+pathogens+on+raw+fruit+and+vegetables.">Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruit and vegetables.</a> Microbes Infect. 4, 413-423 (2002).</li><li>Berger, C. 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El autor declara que ella no tiene competencia financieras intereses.

Es importante ser consciente de todas las superficies que las bacterias pueden adherirse durante el experimento. Así se pueden subestimar las bacterias que son capaces de unirse a cristal si se realiza un recuento viable usando tubos de vidrio y pipetas. Si las plantas se cultivan en agar o suelo y algunos del agar o suelo permanece en las plantas las bacterias pueden enlazar el material adherido en lugar de a las plantas. Por otro lado, lavar la superficie de la planta, particularmente en el caso de las raíces, puede quitar capas superficiales naturales tales como mucosa y alterar así los resultados de pruebas de adherencia.
Es importante estar seguro de que las bacterias se añade a la mezcla de incubación siguen vivas durante el experimento. Así rutinariamente se hagan recuentos de células viables de bacterias libres como adjuntadas. Algunas mutaciones bacterianas o tratamientos pueden reducir la tasa de crecimiento bacteriano o causan la muerte de una fracción de la población bacteriana. Bacterias vivas y muertas no sean distinguibles en el microscopio a menos que se utilizan tinciones especiales. Existe un kit de tinción útil para bacterias muertas o vivir que depende de la exclusión de los tintes de las bacterias vivas. Sin embargo, si una población mixta de especies bacterianas entonces recuento viable de la especie de interés es probablemente el método más fácil para determinar si la incubación ha resultado en la muerte bacteriana.
Composición medio influirá en crecimiento y supervivencia bacteriana. Exudado de raíz y materiales liberados de la herida y cortar los sitios proporcionará sustrato para crecimiento bacteriano modesto. Fosfato, nitrógeno y hierro tienden a ser limitante en estas condiciones. Cationes divalentes como calcio y magnesio pueden influir en la adherencia. En algunos casos fuente de carbono puede influir en la adherencia. pH es también importante. En general el pH de la rizosfera es entre 5.5 y 6.5.
Es necesario tener cuidado en el uso de bacterias con resistencia a los antibióticos. Los antibióticos más frecuentemente utilizados son la rifampicina y ácido nalidíxico. La resistencia a estos antibióticos es generalmente debido a mutaciones en genes cromosómicos (ARN polimerasa y la girasa, respectivamente) y por lo tanto no puede ser fácilmente transferido a otra cepa durante la incubación. Este tipo de resistencia no resulta en la degradación o modificación del antibiótico. Las bacterias de la marca con un marcador de genes portados por el plásmido no se recomienda a menos que el plásmido no puede transferirse a otras bacterias. La resistencia a los antibióticos no debe ser debido a la degradación o química modificación del antibiótico como antibióticos bacterias sensibles entonces serán capaces de crecer en placas de antibióticos si se ubican cerca de las bacterias resistentes.
Los métodos descritos en este documento son útiles para pequeños tamaños de muestra o experimentos donde las muestras deban ser contenida (por ejemplo, experimentos con patógenos humanos). Para tamaños de muestra grande (sobre 100 g de material o de más de 50 plantas) otros métodos o modificación drástica de estos métodos serían necesarios10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. la presencia de grandes cantidades de microorganismos distintos de las especies estudiadas también puede plantear problemas importantes. Posibles soluciones incluyen el uso de bacterias marcadas con una proteína fluorescente o resistencia a los antibióticos como se describe en los pasos 6.1.2 y 7.3. Sin embargo, cuando las bacterias de interés son raros individuos en una población grande de otros microorganismos estos marcadores no pueden ser suficientes para permitir una evaluación clara de los números de las bacterias estudiadas.
Todos los métodos descritos aquí son métodos de laboratorio en. Modificaciones menores se necesitarían estudios de invernadero. Más modificaciones mayores están probable que sean necesarios para estudios de campo donde protozoos, insectos y otros animal variación de depredación y el clima complican la provisión de condiciones definidas para los experimentos. En el futuro estos métodos pueden ampliarse para incluir las interacciones de dos o más microorganismos en la superficie de la planta.

La medición de Unión bacteriana a las superficies de la planta se ha convertido en importante en tres situaciones diferentes. La primera situación es el examen de la transmisión de los patógenos humanos en planta superficies1,2,3. El objetivo aquí es para prevenir el atascamiento bacteriano o eliminar o matar bacterias encuadernadas y así reducir la transmisión de la enfermedad en material vegetal. La segunda situación es el examen de la Unión de patógenos de plantas a sembrar superficies4. Una vez más el objetivo aquí es para evitar vinculante o eliminar o matar bacterias encuadernadas y así reducir la enfermedad. La tercera situación es el examen de la fijación de las bacterias simbióticas o promoción de crecimiento vegetal5,6. El objetivo aquí es promover bacterias vinculante y así al aumento de la salud de las plantas y cultivos los rendimientos.
Las técnicas para medir la Unión bacteriana a superficies descritas en este artículo la planta son baratos y relativamente fáciles de realizar. Los únicos requisitos son un microscopio y materiales encontrados generalmente en un laboratorio de bacteriología. Para algunas técnicas un sonicador de baño es útil. Las técnicas descritas están diseñadas para atar los experimentos realizados con muestras relativamente pequeñas. De Unión se realizan en el laboratorio, aunque es posible modificar algunas de estas técnicas para el uso en el invernadero o en el campo.
Estas técnicas se han utilizado para medir la Unión bacteriana a las raíces, brotes, hojas de corte, corte frutas y tomates intactos en el laboratorio7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Se han utilizado también para medir la colonización de raíces de plantas que crecen en el suelo o arena en el laboratorio16. Las técnicas se han utilizado muchas especies bacterianas incluyendo tumefaciens de la agrobacteria, Sinorhizobium meliloti, Escherichia coli, Salmonella enterica y Pseudomonas fluorescens. Una útil descripción de métodos para evaluar la interacción de a. tumefaciens con superficies puede encontrarse en Morton y Fuqua (2012)17. En todos los casos los tamaños de la muestra participantes eran pequeños, generalmente menos que las plantas de 25-50. Las técnicas descritas son adecuadas para uso con patógenos humanos que deben mantenerse independientes durante los experimentos.

<table><tbody><tr><td>light microscope</td><td>any</td><td>N/A</td><td>phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required.</td></tr><tr><td>seeds</td><td>any&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>make a note of the seed lot number and the cultivar</td></tr><tr><td>bleach</td><td>any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>bath sonicator</td><td>any scientific supply company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>nutrient agar&amp;nbsp;</td><td>Difco&amp;nbsp;</td><td>001-01-8</td><td></td></tr><tr><td>soytone</td><td>Difco&amp;nbsp;</td><td>24360</td><td></td></tr><tr><td>Sand</td><td>sea sand Fisher Scientific</td><td>S25</td><td></td></tr><tr><td>sand</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td>conetainers</td><td>Stuewe &amp;amp; Sons, Inc.</td><td>Ray-Leach cone-tainers</td><td>many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow</td></tr><tr><td>parafilm</td><td>any scientific supply company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MS salts</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>parrafin</td><td>any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>centrigfuge</td><td>any scientific company</td><td>N/A</td><td>to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed</td></tr><tr><td>vortex mixer</td><td>any scientific company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micrometer</td><td>ACCU-SCOPE Accessories</td><td>A3145</td><td></td></tr><tr><td>Sedgwick-rafter counting cell</td><td>Hauser Scientific</td><td>HS3800</td><td></td></tr><tr><td>probe-clip press-seal incubatin chamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359483</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>naladixic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n8878</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead stain</td><td>In Vitrogen Molecular Bioprobes</td><td>L7007</td><td></td></tr></tbody></table>

adherence of bacteria to plant surfaces measured in the laboratory

Este manuscrito describe un método para medir la Unión bacteriana a las superficies de la planta axénicos en el microscopio óptico y mediante el uso de recuento de células viables. Materiales de planta usados incluyen raíces, brotes, hojas y cortan de frutas. Los métodos descritos son baratos, fácil y conveniente para pequeños tamaños de muestra. Enlace se mide en el laboratorio y puede utilizarse una variedad de medios de incubación y las condiciones. Puede determinarse el efecto de inhibidores. Situaciones que promueven e inhiben la Unión también pueden ser evaluadas. En algunos casos es posible distinguir si varias condiciones modificar enlace debido principalmente a sus efectos sobre la planta o en las bacterias.

A. tumefaciens coloniza las superficies radiculares. Con el fin de determinar si la producción bacteriana de la celulosa desempeña un papel en la colonización de la raíz, los efectos de las mutaciones bacterianas que impiden la síntesis de celulosa fueron examinados16. Se utilizaron las técnicas descritas en los pasos 1,3 y 7.1. Semillas de tomate eran superficie esterilizada y germinadas en agua estéril. Cuando las raíces fueron aproximadamente 2 cm de largo fueron sumergidas en una suspensión de 105 bacterias / mL y plantados en el suelo pasteurizado en contenedores. Las plantas fueron cultivadas durante 14 días a 25 ° C en un ciclo oscuro h 12 h luz/12. Después de la indicada veces las plantas fueron removidos de los contenedores. Las raíces fueron lavadas y sonicadas en un sonicador de baño para eliminar las bacterias encuadernadas. Números de bacterianos se determinaron utilizando el recuento de células viables. La figura 2 muestra el efecto de dos diversas mutaciones de celulosa-menos en la capacidad de las bacterias para colonizar las raíces de tomate. Aunque las desviaciones estándar de las mediciones eran tan altas como 0.9 log10 (un problema común con este tipo de medición) la reducción en el atascamiento de los mutantes menos celulosa es claramente evidente y podemos concluir que la producción bacteriana de celulosa ayuda a la bacteria en la colonización de raíces de tomate.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg"> Figura 2 : Raíz de la colonización de tipo salvaje y menos celulosa mutantes de a. tumefaciens. Log10 número total de bacterias por cm longitud de la raíz de raíces de tomate inoculadas con cepa de tipo salvaje a. tumefaciens C58 y mutantes menos celulosa C58:1 y C58:A60. Los números que aparecen son el medio de un mínimo de cuatro experimentos separados. Las barras indican las desviaciones estándar de los medios. Las raíces se inocularon por inmersión en una suspensión de 105 bacterias / mL para un minuto. Las plantas fueron cultivadas en contenedores y las bacterias libremente adherentes fueron quitadas por el lavado de las raíces en lavado tampón en un frasco de vidrio. Bacterias firmemente adheridas fueron quitadas usando un sonicador de baño y la suspensión resultante plateado para determinar recuento viable16. Esta figura ha sido modificada de Matthysse y McMahan. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Se examinó el papel de exopolisacáridos en la Unión de e. coli y otras bacterias a brotes de alfalfa. Algunos brotes de enfermedad diarreica por e. coli O157: H7 se trazaron a brotes de alfalfa contaminada. Unión de las bacterias de tipo silvestre y mutantes incapaces de hacer distintos exopolisacáridos se midió usando los métodos descritos en los pasos 1.1, 5.1 y 7.2. Brotes de alfalfa fueron superficie esterilizada y germinó un día en agua estéril a 25 ° C en la oscuridad. Cuatro brotes con las capas de semilla adjuntadas fueron colocados en platos de plástico estériles que contiene 5 mL de agua. Las bacterias cultivadas en caldo Luria fueron agregadas a una concentración final de aproximadamente 5 x 103 / mL. Los brotes inoculados se incubaron a 25 ° C en la oscuridad durante 3 días. Los brotes fueron lavados dos veces en 5 mL de agua estéril en un vial por inversión vigorosa y homogeneizó en lavado Tampón utilizando un homogeneizador de vidrio teflón motorizado. Experimentos anteriores utilizando bacterias marcan con un plásmido portador del gen GFP demostrado ningunas bacterias internalizadas aunque fácilmente se observaron bacterias superficiales. Los resultados se muestran en la tabla 1. Examinaron a dos cepas de e. coli O157: H7. En ambas cepas la producción de poli-β-1, 6-glucurónico acid(PGA) parece hacer la contribución más grande a la Unión del patógeno e. coli a las superficies de la planta. Ácido colónico también desempeñó un papel significativo en la Unión. Mientras que la reducción en el atascamiento en celulosa menos mutantes fue significativa no era tan grande como para los otros dos polisacáridos.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Efectos de las mutaciones en los Genes de producción de exopolisacárido en encuadernación de E. coli O157: H7 brotes y capas de semilla abiertas</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Cepa bacteriana</td>
			<td rowspan="2">Mutación o genotipo (fenotipo relevante)</td>
			<td colspan="2">Sesión número10 de bacterias límite por brote o Testa</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alfalfa brotesb
</td>
			<td>Capas de semilla abiertas</td>
		</tr>
<tr>
<td>86-24</td>
			<td>Ninguno (tipo salvaje)</td>
			<td>4.7 ± 0.6</td>
			<td>5.6 ± 0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624N</td>
			<td>
yhjN (celulosa-minus)</td>
			<td>2,9 ± 0,7c
</td>
			<td>3.5 ± 0.6c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>C 8624</td>
			<td>
wcaD (colon menos ácido)</td>
			<td>de 1,8 ± 0,7c
</td>
			<td>2.4 ± 0,5c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624P</td>
			<td>
Camp (PGA-minus)</td>
			<td>< 1.0c
</td>
			<td>± 1.0 1.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4A</td>
			<td>Ninguno (tipo salvaje)</td>
			<td>5.6 ± 0,2</td>
			<td>6.1 ± 0.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AN</td>
			<td>
yhjN (celulosa-minus)</td>
			<td>4.8 ± 0.8d
</td>
			<td>4.1 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AC</td>
			<td>
wcaD (colon menos ácido)</td>
			<td>3,9 ± 0,5c
</td>
			<td>4.8 ± 0.8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AP</td>
			<td>
Camp (PGA-minus)</td>
			<td>< 1.0c
</td>
			<td>1,2 ± 0,7c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">una media ± desviación estándar de un mínimo de tres mediciones de la cantidad (log10) de bacterias límite después de 3 días.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">b brotes fueron lavados antes de la medición.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">c significativamente diferente del tipo silvestre: P < 0.01.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">d significativamente diferente del tipo silvestre: P < 0.05.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Esta tabla ha sido modificada de Matthysse, Deora, Mishra y Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: efectos de mutaciones en genes de producción de exopolisacárido en Unión de E. coli O157: H7 a brotes. Para determinar el papel de exopolisacáridos y lipopolisacáridos en la Unión del patógeno e. coli O157: H7 cepas de brotes de alfalfa, la Unión de un conjunto de mutantes para los brotes y abiertas capas de semilla fue examinada usando los métodos se describe en el paso 6. Los resultados mostraron que poli-ß-1, 6 -N-acetil-D-glucosamina (PGA) parece ser esencial para la Unión a brotes y eso ácido de la celulosa y colanic son necesarios para la máxima unión de e. coli O157. Esta tabla ha sido modificada de Matthysse, Deora, Mishra y Torres10.
Con el fin de determinar si la producción de PGA es suficiente causar el atascamiento bacteriana a las superficies, un plásmido (pMM11) llevando el operón clonado los genes necesarios para la PGA de codificación producción fue introducida en dos diferentes bacterias que no Normalmente podrá enlazar a las raíces de tomate10. A. tumefaciens A1045 es un mutante de la cepa de tipo salvaje C58 que no puede hacer el glucano cíclico-β-1, 2 y tampoco se unen para plantar superficies29. Sinorhizobium meliloti 1021 que forma nódulos radiculares en alfalfa es incapaz de enlazar no leguminosas incluyendo tomate12. Las técnicas descritas en los pasos 1.1, 5.1, 6.3 y 7.1 se utilizan para determinar si la capacidad de hacer PGA generalmente aumentar Unión bacteriana a las superficies radiculares. Semillas de tomate eran superficie esterilizada y germinadas en agua estéril. Raíces se corta en segmentos de 1 cm de longitud y se colocaron en agua estéril y se inocularon las bacterias. Como estas dos especies de bacterias crecen a tasas diferentes, Unión se midió en diferentes momentos para permitir que cantidades aproximadamente iguales de crecimiento bacteriano. La presencia de la pMM11 del plásmido causó un aumento significativo similar en el número de bacterias dependientes de ambas especies (tabla 2)10. También se observó un aumento significativo en la Unión en el microscopio óptico, pero el enlace fue muy diferente para las dos especies (figura 3). A. tumefaciens A1045 obligado como bacterias individuales a la superficie de la raíz. S. meliloti atado en grandes grupos en los que sólo algunas de las bacterias fueron Unidos directamente a la raíz y la mayoría de las bacterias fueron unida a otras bacterias. Este ejemplo muestra que el simplemente analizando los números de destino sin incluir observaciones microscópicas de bacterias puede dar una impresión errónea de los resultados de un experimento. Aunque ambos métodos (recuento de células viables y observaciones microscópicas) muestran que pMM11 mayor atascamiento bacteriano a las raíces de tomate, el tipo de enlace por la producción de PGA fue diferente para las dos especies bacterianas10.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">El efecto de la pMM11 del plásmido en la Unión de bacterias a las raíces de tomate</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cepa bacteriana</td>
			<td>Plásmido</td>
			<td>Limitado número de bacterias por mm de longitud de raíz</td>
		</tr>
<tr>
<td>A. tumefaciens A1045un
</td>
			<td>ninguno</td>
			<td>0.25 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vector)</td>
			<td>0.25 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (síntesis de PGA)</td>
			<td>10 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td>S. meliloti 1021b
</td>
			<td>ninguno</td>
			<td>ninguno detecta</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vector)</td>
			<td>ninguno detecta</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (síntesis de PGA)</td>
			<td>50 x 103 ± 5 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">un atascamiento bacteriano se midió después de 2 horas</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">b Unión bacteriana fue medida después de 18 horas</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Esta tabla ha sido modificada de Matthysse, Deora, Mishra y Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: el efecto de un plásmidos portadores de genes para la síntesis de PGA en Unión de A. tumefaciens A1045 y S. meliloti 1021 a segmentos de raíz de tomate. Para examinar la capacidad de poli-ß-1, 6 -N-acetil-D-glucosamina (PGA) para promover la Unión de las bacterias a las raíces, el efecto de un plásmido que confiere la habilidad de hacer PGA (pMM11) en la Unión de dos cepas de bacterias a la planta las raíces del tomate fue examinado. Ninguna cepa de bacterias demostró Unión significativa a las raíces de tomate en la ausencia del plásmido o ante la presencia del plásmido sin los genes que codifican la síntesis de la PGA (pBBR1mcs). La adición de los plásmidos portadores de genes de síntesis de PGA aumentó vinculante por ambos tipos de bacterias. Porque a. tumefaciens crece más rápido que el enlace de S. meliloti se midió después de 2 h de incubación para a. tumefaciens y 18 h de S. meliloti. Las técnicas utilizadas son las que se describen en el paso 7. Esta tabla ha sido modificada de Matthysse, Deora, Mishra y Torres10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg"> Figura 3 : El efecto de la pMM11 del plásmido lleva los genes de biosíntesis de la PGA en la Unión de a. tumefaciens A1045 S. meliloti 1021 a pelos de la raíz de tomate. Enlace a pelos de la raíz del tomate de la A) a. tumefaciens A1045, B) pMM11 de a. tumefaciens A1045, C) S. meliloti 1021 y D) pMM11 de S. meliloti 1021. Aunque el aumento en la Unión de las dos especies bacterianas es más o menos similar, los detalles del enlace como se ve en el microscopio óptico son muy diferentes. Las técnicas utilizadas son las que se describen en el paso 6. Esta figura ha sido modificada de Matthysse, Deora, Mishra y Torres10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
A veces es posible utilizar Unión a superficies no-biológicos para ayudar a distinguir la contribución de las bacterias y de la planta en una interacción específica. La polysaccharide(UPP) unipolar de a. tumefaciens ha demostrado ser capaz de mediar la Unión bacteriana a una variedad de ambas superficies biológicas y no biológicas30. Calcio se observó que inhiben el atascamiento de a. tumefaciens a sembrar superficies mediadas por la UPP28. Con el fin de determinar si la inhibición por los iones del calcio de Unión bacteriana a las superficies de la planta es debido a un efecto sobre las bacterias o sobre la superficie de la planta, se examinó la Unión de las bacterias a hilos de nylon. Las técnicas se describe en el paso 8.2 fueron utilizados. Semillas de tomate eran superficie esterilizada y germinó en el agua como se describe en el paso 1. Las bacterias fueron cultivadas en medio mínimo con sacarosa y añadidas a las raíces de tomate o hilos de nylon a una concentración final de aproximadamente 105/ml como se describe en el paso 5.1. El efecto del agregado de CaCl2 en Unión bacteriana en raíces de tomate e hilos de nylon fue examinado en el microscopio. La figura 4 muestra una inhibición similar de unión de calcio utilizando cualquier superficie lo que sugiere que el efecto del calcio es principalmente en las bacterias10.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg"> Figura 4 : El efecto del calcio sobre el atascamiento de a. tumefaciens a pelos de la raíz de tomate e hilos de nylon. A. tumefaciens se incubó con raíces de tomate (A y B) o hilos de nylon (C y D) durante 24 h en un 1:10 dilución de sales MS y una 1:20 dilución de medio mínimo AB, 0.4% de sacarosa (A y C) o en un 1:10 dilución de sales MS y 1:20 dilución de medio mínimo AB , 0.4% de sacarosa que contiene 60 mM CaCl2 (B y D)31. El agregado de CaCl2 inhibe Unión bacteriana a raíces e hilos de nylon, lo que sugiere que la inhibición era principalmente debido a un efecto en las bacterias y no en la superficie de la planta. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

Un método sencillo para medir y caracterizar la adherencia bacteriana a las plantas, especialmente las raíces y brotes, se describe en este artículo.

Adherencia de bacterias a las superficies de midieron en el laboratorio de la planta

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

adherence-of-bacteria-to-plant-surfaces-measured-in-the-laboratory

Research

JoVE Journal

Environment

12.6K vistas.  University of North Carolina at Chapel Hill. Un método sencillo para medir y caracterizar la adherencia bacteriana a las plantas, especialmente las raíces y brotes, se describe en este artículo.

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In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Ensayo in vitro de la adhesión bacteriana a las células epiteliales de mamíferos

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Investigación

Inmunología e Infección

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Ingeniería bacterias adherentes mediante la creación de un único operón sintético curli

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Bioingeniería

Detección de colonización rizobacteriana en Arabidopsis thaliana

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized method for measuring bacterial colonization in the rhizosphere is necessary to improve reproducibility. We first cultured sterile A.thaliana in hydroponic conditions and then inoculated the bacterial cells in the rhizosphere at a final concentration of OD600 of 0.01. At 2 days post-inoculation, the root tissue was harvested and washed three times in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. The roots were then weighed, and the bacterial cells colonized on the root were collected by vortex. The cell suspension was diluted in a gradient with a phosphate-buffered saline (PBS) buffer, followed by plating onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. The plates were incubated at 37 &#176;C for 10 h, and then, the single colonies on LB plates were counted and normalized to indicate the bacterial cells colonized on roots. This method is used to detect bacterial colonization in the rhizosphere in mono-interaction conditions, with good reproducibility.

Autor destacado: Mejora de la colonización de rizobacterias en las raíces de las plantas para mejorar la eficiencia de los fertilizantes microbianos

Colonization of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) in the rhizosphere is essential for its growth-promoting effect. It is necessary to standardize the method of detection of bacterial rhizosphere colonization. Here, we describe a reproducible method for quantifying bacterial colonization on the root surface.

Medición de la colonización bacteriana en raíces de Arabidopsis thaliana en condiciones hidropónicas

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

Medio ambiente

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, rhizosphere colonization by plant growth-promoting bacteria (PGPB) can increase the health or the development of host plants relative to uncolonized plants. However, in field settings, bacterial treatments with PGPB often do not provide substantial benefits to crops. One explanation is that this may be due to loss of the PGPB during interactions with endogenous soil microbes over the lifespan of the plant. This possibility has been difficult to confirm, since most studies focus on the initial colonization rather than maintenance of PGPB within rhizosphere communities. It is hypothesized here that the assembly, coexistence, and maintenance of bacterial communities are shaped by deterministic features of the rhizosphere microenvironment, and that these interactions may impact PGPB survival in native settings. To study these behaviors, a hydroponic plant-growth assay is optimized using Arabidopsis thaliana to quantify and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after transfer to different growth environments. This system&#8217;s reproducibility and utility are then validated with the well-studied PGPB Pseudomonas simiae. To investigate how the presence of multiple bacterial species may affect colonization and maintenance dynamics on the plant root, a model community from three bacterial strains (an Arthrobacter, Curtobacterium, and Microbacterium species) originally isolated from the A. thaliana rhizosphere is constructed. It is shown that the presence of these diverse bacterial species can be measured using this hydroponic plant-maintanence assay, which provides an alternative to sequencing-based bacterial community studies. Future studies using this system may improve the understanding of bacterial behavior in multispecies plant microbiomes over time and in changing environmental conditions.

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Here we describe a hydroponic plant growth assay to quantify species presence and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after their transfer into different growth environments.

Monitoreo de la Colonización Y Mantenimiento Bacterial en Arabidopsis thaliana Roots en un Sistema Hidropónico Flotante

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Use of Fimbrial Rod for F18ab Fimbriae+ STEC Colonization to Host Cells

Type 1 fimbriae are important virulence determinants of some Gram-negative pathogens, which promote bacterial colonization. The fimbrial rod is primarily composed of multiple copies of the major fimbrial subunit FimA. FimH adhesin, however, is present as a fibrillar tip structure that drive bacteria binding to host cellular mannose containing receptor. Here, we provide protocols to evaluate and compare the function of type 1 fimbrial subunits in F18ab fimbriae+ Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC). We found that both FimA and FimH are required for bacterial adhesion, invasion, and biofilm formation. Deleting fimA gene showed much more reduction in bacterial adhesion and invasion to porcine intestinal columnar epithelial cells IPEC-J2, than that of fimH mutant. Biofilm formation was significantly reduced in both mutants with an equal level. In addition, qPCR demonstrated that either fimA or fimH deletion down-regulated the bacterial flagella and F18 fimbriae genes expression, while up-regulated adhesin was involved in diffuse adherence-I (AIDA-I) gene expression, suggesting the co-regulation of cell surface-localized adhesins in F18ab fimbriae+ STEC.

Use of Fimbrial Rod for F18ab Fimbriae+ STEC Colonization to Host Cells

Here we present a protocol to study the function of fimbriae in bacterial colonization.

Type 1 fimbriae are important virulence determinants of some Gram-negative pathogens, which promote bacterial colonization. The fimbrial rod is primarily ...

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

C. parapsilosis (Cp) is an emerging cause of bloodstream infections in certain populations. The&#160;Candida clade, including Cp, is increasingly developing resistance to the first and the second line of antifungals. Cp is frequently isolated from hands and skin surfaces, as well as the GI tract. Colonization by Candida predisposes individuals to invasive bloodstream infections. To successfully colonize or invade the host, yeast must be able to rapidly adhere to the body surfaces to prevent elimination by host defense mechanisms. Here we describe a method to measure adhesion of Cp to immobilized proteins under physiologic fluid shear, using an end-point adhesion assay in a commercially available multichannel microfluidic device. This method is optimized to improve reproducibility, minimize subjectivity, and allow for the fluorescent quantification of individual isolates. We also demonstrate that some clinical isolates of Cp show increased adhesion when grown in conditions mimicking a mammalian host, whereas a frequently used lab strain, CDC317, is non-adhesive under fluid shear.

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

Adhesion is an important first step in colonization and pathogenesis for Candida. Here, an in vitro assay is described to measure adhesion of C. parapsilosis isolates to immobilized proteins under fluid shear. A multichannel microfluidics device is used to compare multiple samples in parallel, followed by quantification using fluorescence imaging.

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