Los autores agradecen al Prof. Thomas Reiner, el Dr. Jacob Houghton, y el Dr. Serge Lyaschenko para conversaciones útiles.

Todos los experimentos con animales en vivo descritos fueron realizados de acuerdo con un protocolo aprobado y con las normas éticas del Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC). 1. La conjugación de DFO-NCS a J591 <ol><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar una solución de 2-5 mg / ml de J591 en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x (pH 7,4) o 0,5 M de tampón HEPES (pH 7,4). </li><li> Disolver DFO-NCS en DMSO seco a una concentración entre 5-10 mM (3.8 a 7.6 mg / ml). Someter a ultrasonidos o vórtice bien la solución con el fin de facilitar la disolución completa. </li><li> Ajustar el pH de la solución J591 a 8,8-9,0 mediante la adición de pequeñas alícuotas (&lt;10 l) de 0,1 M Na 2 CO 3. </li><li> Una vez que la solución de anticuerpo está en el pH correcto, añadir un volumen de la solución DFO-NCS correspondiente a un exceso molar de 3-4 veces del quelante bifuncional. <ol><li> Por ejemPLE, añadir 4-5 l de un 10 mM (7,6 mg / ml) solución de DFO-NCS (40,4 nmol DFO-NCS) a 1 ml de una solución de anticuerpo J591 2 mg / ml (13,3 nmol J591). La cantidad de DMSO en la mezcla final de reacción acuosa no debe exceder de 2% v / v. </li></ol></li><li> Se incuba la reacción durante 30 min a 37 ° C en un bloque de calentamiento agitando a 350 rpm. </li><li> Después de 1 hora a 37 ° C, purificar el inmunoconjugado resultante usando una columna de desalación exclusión preenvasado desechable con un tamaño de 50.000 de peso molecular de corte usando 0,5 M de tampón HEPES (pH 7,4) como el eluyente. Este paso producir una solución de la construcción J591-DFO completado 2 ml. </li><li> Medir la concentración de la J591-DFO construir en un espectrofotómetro UV-Vis. </li><li> Si se desea una mayor concentración de la construcción, concentrar la solución J591-DFO utilizando una unidad de filtro centrífugo con un peso molecular 50.000 de corte. </li><li> Guarde la solución del inmunoconjugado J591-DFO completado a -20 ° C en la oscuridad. </ol> 2. El radiomarcado J591-DFO con 89 Zr PRECAUCIÓN: Este paso del protocolo implica el manejo y manipulación de la radiactividad. Antes de realizar estos pasos o la realización de cualquier otro trabajo con investigadores de radiactividad debe consultar con el Departamento de Seguridad Radiológica de su institución de origen. Se deben tomar todas las medidas posibles para minimizar la exposición a la radiación ionizante. NOTA: En el interés de radioquímica nota de mantenimiento adecuado, la cantidad de radiactividad en la muestra debe ser medido usando un calibrador de dosis y registrada antes y después de los pasos 2.2 a 2.13 en el protocolo a continuación. Esto le ayudará con la determinación precisa de los rendimientos de radioquímica y actividades específicas. <ol><li> Preparar una solución de 0,5-2,0 mg de J591-DFO en 200 l de 0,5 M de tampón HEPES, pH 7,5. </li><li> Verter un volumen de la &lt;sup&gt; 89 solución Zr 4+ acciones (suministrado normalmente en ácido oxálico 1,0 M) correspondiente a 1,0-6,0 mCi (37-222 MBq) en un tubo de microcentrífuga con tapón de rosca de plástico de 2 ml. Ajuste el volumen de esta solución a un total de 300 l usando ácido 1,0 M oxálico. </li><li> Ajustar el pH de la solución de Zr 4+ 89 a 06/08 a 07/05 usando 1,0 M Na 2 CO 3. Comience por la adición de 250 l de 1,0 M Na 2 CO 3 a la solución 89 4+ Zr y, posteriormente, añadir más pequeño (&lt;10 l) alícuotas de la base para conseguir el pH deseado. </li><li> Añadir la cantidad deseada de solución de pH ajustado 89 Zr 4+ a la solución J591-DFO preparado en el Paso 2.1. </li><li> Comprobar el pH de la mezcla de reacción de radiomarcaje para asegurar que cae dentro del intervalo deseado de 06/08 a 07/05. </li><li> Incubar la reacción de radiomarcado durante 60 minutos a RT en un bloque de calentamiento agitando a 350 rpm. </li><li> Después de 60 minutos de incubación, mida la radiolabeling rendimiento de la reacción utilizando la radio-TLC. <ol><li> Para este fin, detectar 1 Ci de la mezcla de reacción de radiomarcaje en una tira de TLC de sílice impregnado. Permitir la alícuota se seque, ejecute el TLC usando un eluyente de DTPA mM (pH 5,5) 50 y analizar la tira TLC usando un escáner de radio-TLC. 89 Zr 4+ unido a la construcción J591-DFO aparecerá en el origen (R f &lt;0,1), mientras que cationes libres 89 Zr 4+ serán quelados con DTPA y eluirán con el frente del disolvente (R f&gt; 0,9). </li><li> Calcular el rendimiento de radiomarcado de la reacción mediante la integración de la radiocromatograma, dividiendo el área bajo la curva de R f 0,0-0,1 por el área total bajo la curva, y multiplicando por 100. </li></ol></li><li> Si el rendimiento de radiomarcado es suficiente (típicamente una actividad específica teórica de&gt; 2 mCi / mg), se extingue la reacción con 5 l de DTPA 50 mM, pH 5,5. </li><li> Se purifica el USI inmunoconjugado resultanteng una columna de desalación de exclusión por tamaño desechable pre-empaquetada con un peso molecular 50.000 de corte usando un eluyente de cualquiera de 0,9% de solución salina estéril con 5 mg / ml de ácido gentísico o acetato de sodio 0,25 M (pH 5,5) con 5 mg de ácido gentísico / ml . Este paso dará lugar a una solución de terminada la radioinmunoconjugado 89 Zr-DFO-J591 2 ml. </li><li> Después de la purificación, verificar la pureza radioquímica del 89 Zr-DFO-J591 uso de la radio-TLC como se describe en el Paso 2.7. </li><li> Calcular el rendimiento global de la reacción de radiomarcaje dividiendo la cantidad de actividad inicialmente añadido a la solución de anticuerpo por la cantidad de radiactividad aislado con el purificada radioinmunoconjugado 89 Zr-DFO-J591. </li><li> Calcular la actividad específica final dividiendo la cantidad de actividad aislada con el purificada 89 Zr-DFO-J591 radioinmunoconjugado por la masa inicial de DFO-J591 en la reacción de radiomarcado. </li><li> Si se desea una mayor concentración, concentrar ésimoe 89 solución de Zr-DFO-J591 utilizando una unidad de filtro centrífugo con un peso molecular 50.000 de corte. NOTA: El ácido gentísico utilizado en la etapa de purificación final es un protector de radio empleado para minimizar la degradación del anticuerpo debido a la radiolisis 46 Mientras que el almacenamiento de la 89 radioinmunoconjugado Zr-DFO-J591 para un máximo de 48 horas a 4 ° C. es posible, no es recomendable. Si el radioinmunoconjugado se va a almacenar, utilizar 0,25 M de acetato de sodio (pH 5,5) con 5 mg / ml de ácido gentísico como el tampón de almacenamiento con el fin de minimizar el riesgo de radiolisis hipoclorito mediada. 47 </li></ol> 3. En Vivo TEP con 89 Zr-DFO-J591 PRECAUCIÓN: Como en la sección Protocolo 2, este paso del protocolo implica el manejo y manipulación de la radiactividad. Antes de realizar estos pasos investigadores deben consultar con el Departamento de Seguridad Radiológica de su institución de origen. Todo posibse deben tomar medidas le minimizar la exposición a la radiación ionizante. <ol><li> En ratones desnudos atímicos macho, implante por vía subcutánea 5 x 10 células de cáncer de próstata LNCaP 6 y permiten éstos crezcan a un xenotrasplante 100-150 mm 3 (3-4 semanas después de la inoculación). 44 </li><li> Diluir el radioinmunoconjugado 89 Zr-DFO-J591 a una concentración de 1,0 mCi / ml en 0,9% de solución salina estéril. </li><li> Inyectar 200 l de la solución 89 Zr-DFO-J591 (200 Ci; 7,4 MBq). En la vena lateral de la cola de los ratones de xenoinjerto-cojinete 48 </li><li> En el punto de tiempo de formación de imágenes deseado (por ejemplo, 12, 24, 48, 72, 96, o 120 horas después de la inyección), anestesiar al ratón con un isoflurano 2%: mezcla de gas de oxígeno. </li><li> Coloque el ratón sobre la cama del pequeño escáner PET animal, y mantener la anestesia durante el análisis utilizando un isoflurano al 1%: mezcla de gas de oxígeno. Antes de colocar el animal en el escáner, verifique la anestesia utilizando el método del dedo del pie-pinch y aplpomada oftálmica y a los ojos del ratón para evitar que se seque durante la anestesia. 49 </li><li> Adquirir los datos de PET para el ratón a través de un análisis estático con un mínimo de 40 millones de eventos coincidentes utilizando una ventana de energía de 350-700 keV y una ventana de tiempo coincidencia de 6 nseg. 50 </li><li> Después de completar la adquisición de la imagen, no deje el ratón sin atención y no lo coloque en una jaula con otros ratones hasta que se haya recuperado la conciencia. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Si bien la construcción, radioinmunoconjugados labled-Zr-DFO radiomarcaje, y las imágenes de 89 es generalmente un procedimiento bastante sencillo, es importante mantener algunas consideraciones clave en mente durante cada paso del proceso. Por ejemplo, tal vez la causa más probable de preocupación durante la etapa de conjugación del procedimiento es la agregación del anticuerpo durante la reacción de conjugación. Este problema es más a menudo un producto de mala mezcla de la reacción de conjugació...

Debido a su notable sensibilidad, afinidad y selectividad, los anticuerpos han sido considerados vectores prometedores para el suministro de radioisótopos a las células cancerosas. Sin embargo, su aplicación en la tomografía por emisión de positrones (PET) se ha visto obstaculizada por la falta de un radioisótopo emisor de positrones adecuados para su etiquetado. 1-3 Una de las consideraciones más importantes en el diseño de radioinmunoconjugados se coincida con el deterioro físico de media la vida del radioisótopo a la farmacocinética in vivo de los anticuerpos. Más específicamente, los anticuerpos a menudo tienen relativamente largos, de varios días biológicos vidas medias y por lo tanto deben ser etiquetados con radioisótopos con vidas medias físicas comparables. Para aplicaciones de imágenes de PET, los anticuerpos han sido tradicionalmente radiomarcado con 64 Cu (t 1/2 = 12,7 horas), 86 Y (t 1/2 = 14,7 horas), o 124 I (t 1/2 = 4,18 d). 4, 5 Sin embargo, cada uno deestos radioisótopos posee importantes limitaciones que dificultan su idoneidad para la imagen clínica. Mientras radioinmunoconjugados marcadas con 86 y 64 Y Cu han demostrado ser prometedor en investigaciones preclínicas, ambos isótopos poseen vidas medias físicas que son demasiado cortos para ser eficaz para formación de imágenes en seres humanos. 124 I, en cambio, tiene una vida media física casi ideal para formación de imágenes con anticuerpos, pero es caro y tiene características de desintegración subóptimas que conducen a la resolución relativamente baja imágenes clínicas. Además, 124 radioinmunoconjugados I-marcado puede estar sujeto a deshalogenación in vivo, un proceso que puede reducir razones de actividad tumor a fondo. 6,7 La unidad para encontrar un radioisótopo emisor de positrones para suplantar 64 Cu, 86 Y, y 124 I en radioinmunoconjugados ha alimentado el reciente aumento de la investigación en 89 anticuerpos Zr-etiquetados. 8-12 Tque la razón para el advenimiento de 89 Zr es sencillo: el radiometal posee propiedades físicas y químicas casi ideal y para su uso en radioinmunoconjugados de PET de diagnóstico 13 89 Zr se produce a través de la 89 Y (p, n) 89 reacción Zr en un ciclotrón usando una. comercialmente disponible y 100% naturalmente abundante objetivo 89 Y 14,15. El metal radiactivo tiene un rendimiento de positrones de 23%, se desintegra con una vida media de 78,4 h, y emite positrones con la relativamente baja de energía de 395,5 keV (Figura 1). 13,16,17 Es importante señalar que 89 Zr también emite una alta energía, 909 keV γ-ray con 99% de eficiencia. Mientras que esta emisión no interfiera con energía con las emitidas 511 keV fotones, requiere consideración adicional en relación con el transporte, la manipulación y la dosimetría. A pesar de esta advertencia, estas características de desintegración en última instancia significa que 89 Zr no sólo tiene una h más favorablealf-vida para formación de imágenes con anticuerpos que 86 Y 64 y Cu pero también puede producir imágenes de mayor resolución de 124 I, que emite positrones con mayores energías de 687 y 975 keV, así como un número de fotones con energías dentro de 100-150 keV de los fotones de positrones creado 511 keV. 13 Por otra parte, 89 Zr es también más seguro de manejar, menos caro de producir, y residualizes en los tumores más eficazmente que su homólogo de yodo radioactivo. 18,19 Una limitación potencial de 89 Zr es que no tiene un Isotopólogo terapéutico, por ejemplo, 86 Y (PET) vs. 90 Y (terapia). Esto impide la construcción de agentes de imagen químicamente idénticos, sustitutos que pueden emplearse como exploradores dosimétricos para sus contrapartes terapéuticas. Dicho esto, las investigaciones sugieren que los anticuerpos 89 Zr-etiquetados tienen potencial como sustitutos de imágenes para 90 Y- y 177 inmunoconjugados marcados con Lu.20,21 Desde un punto de vista químico, como un metal del Grupo IV, 89 Zr existe como un catión 4 en solución acuosa. El ion Zr 4+ está altamente cargada, relativamente grande (radio iónico efectivo = 0,84 Å), y puede ser clasificado como un catión &quot;duro&quot;. Como tal, exhibe una preferencia por ligandos que llevan hasta ocho donantes de oxígeno duros, aniónicos. Fácilmente el quelante más común usado en 89 radioinmunoconjugados marcados con Zr es la deferoxamina (DFO), un sideróforo derivada, quelante acíclico teniendo tres grupos hidroxamato. El ligando coordina de forma estable el catión Zr 4+ rápida y limpia a temperatura ambiente a niveles de pH biológicamente relevantes, y el complejo de Zr-DFO resultante permanece estable durante el curso de varios días en solución salina, suero de la sangre, y la sangre entera. 22 estudios computacionales sugieren fuertemente DFO que forma un complejo con hexacoordinate Zr 4+ en la que el centro metálico se coordina a los tres neutral y tres donantes de oxígeno aniónicos del ligando, así como dos ligandos de agua exógenos (Figura 2). 23,24 El comportamiento in vivo de radioinmunoconjugados que emplean la conjugación de andamio 89 Zr-DFO ha sido en general excelente. Sin embargo, en algunos casos, las imágenes y los estudios de biodistribución agudas han revelado los niveles de actividad elevados en los huesos de los ratones inyectados con 89 anticuerpos Zr-etiquetados, datos que sugiere que la osteophilic 89 Zr 4+ catión se libera de la quelante in vivo y posteriormente mineraliza en el hueso. 25 Recientemente, un número de investigaciones en el desarrollo de nuevos 89 Zr 4+ quelantes particularmente ligandos con ocho donantes de oxígeno han aparecido en la literatura. 24,26,27 Sin embargo, en la actualidad, el DFO es el quelante más ampliamente empleado en 89 radioinmunoconjugados Zr-etiquetados por un amplio margen. Una variedad de diferentesestrategias bioconjugation se han empleado para unir DFO a anticuerpos, incluyendo la química clic bioorthogonal, la reacción del tiol reactiva DFO construye con cisteínas en el anticuerpo, y la reacción del éster activado de soporte de DFO construye con lisinas en el anticuerpo. 4,28- 30 Fácilmente la estrategia más común, sin embargo, ha sido el uso de un derivado de isotiocianato de soporte de DFO, DFO-NCS (Figura 2). 22 Este quelante bifuncional disponible comercialmente robusta y fiable forma, vínculos tiourea covalentes estables con las lisinas de la anticuerpo (Figura 3). En los últimos años, una amplia variedad de 89 radioinmunoconjugados marcados con Zr-DFO han sido reportados en la literatura. Investigaciones preclínicos han sido especialmente abundantes, con anticuerpos que van desde la más conocida el cetuximab, bevacizumab y trastuzumab a anticuerpos más esotéricos como el CD105 de metas de TRC105 y fPSA de metas 5A10. 30-36 Más recientemente, un pequeño número de ensayos clínicos de fase temprana utilizando anticuerpos marcados 89-Zr-DFO han surgido en la literatura. Ensayos Específicamente, los grupos en los Países Bajos han publicado que emplean 89 Zr-DFO-CMAB U36, 89 Zr-DFO-ibritumomab tiuxetan, y 89 Zr-DFO-trastuzumab. 21,32,37 Además, una serie de otros ensayos clínicos con 89 radioinmunoconjugados marcados con Zr están actualmente en curso, incluidas las investigaciones aquí en el Centro de Cáncer Memorial Sloan Kettering utilizando el PSMA de metas de 89 Zr-DFO-J591 por imagen del cáncer de próstata y el 89 Zr-DFO-trastuzumab HER2-dirigido por imagen del cáncer de mama. 23, 30 Además, mientras que los anticuerpos radiomarcados siguen siendo los 89 radiofármacos marcados con Zr más comunes, el metal radiactivo ha sido empleado también cada vez más con otros vectores, incluyendo péptidos, proteínas, y los nanomateriales. 38-43 </sup&gt; La modularidad de este 89 metodología etiquetado Zr-DFO es un enorme activo. El repertorio de anticuerpos de biomarcadores de metas es cada vez mayor, y el interés en la realización de la PET vivo utilizando estas construcciones está creciendo a buen ritmo. Como resultado, creemos que el desarrollo de las prácticas y protocolos más estandarizados podría beneficiar el campo. Una excelente protocolo experimental escrito para DFO-NCS conjugación y 89 Zr radiomarcaje ya ha sido publicada por Vosjan, et al. 22 Creemos que la demostración visual proporcionada por este trabajo podría ayudar aún más a los investigadores nuevos a estas técnicas. En el protocolo a mano, el antígeno de dirección de membrana J591 anticuerpo específico de la próstata se puede utilizar como un sistema modelo para ilustrar (1) la bioconjugación del quelante bifuncional DFO-isotiocianato a un anticuerpo, (2) la radiosíntesis y la purificación de la 89 radioinmunoconjugado Zr-DFO-MAB,y (3) in vivo de formación de imágenes PET con una Zr-DFO-mAb radioinmunoconjugado 89 en un modelo murino de cáncer. 23,44,45

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-SCN-Bn-DFO</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-705</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">[89Zr]Zr-oxalate</td>
			<td>Various, including Perkin-Elmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Caution: Radioactive material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01&#160;</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC805024</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>SGI0001</td>
			<td>Cut into strips 0.5 cm wide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies

La excepcional afinidad, especificidad y selectividad de los anticuerpos a tomar vectores extraordinariamente atractivos para radiofármacos PET-tumorales objetivo. Debido a su vida media biológica de varios días, los anticuerpos deben estar etiquetados con radionucleidos emisores de positrones con relativamente largos de decaimiento físico vidas medias. Tradicionalmente, los isótopos emisores de positrones 124 I (t 1/2 = 4,18 d), 86 Y (t 1/2 = 14,7 h), y 64 Cu (t 1/2 = 12,7 hr) se han utilizado para marcar anticuerpos para imágenes PET. Más recientemente, sin embargo, el campo ha sido testigo de un aumento dramático en el uso del metal radiactivo emisor de positrones 89 Zr en agentes formadores de imágenes de PET basadas en anticuerpos. 89 Zr es un radioisótopo casi ideal para la formación de imágenes PET con inmunoconjugados, ya que posee un medio físico -La vida (t 1/2 = 78,4 hr) que es compatible con la farmacocinética in vivo de anticuerpos y emite un relativamente bajo enopositrones rgy que produce imágenes de alta resolución. Además, los anticuerpos pueden ser francamente etiquetados con 89 Zr usando el quelante de deferoxamina sideróforo derivada (DFO). En este protocolo, el antígeno de dirección de membrana J591 anticuerpo específico de la próstata se puede utilizar como un sistema modelo para ilustrar (1) la bioconjugación del quelante bifuncional DFO-isotiocianato a un anticuerpo, (2) la radiosíntesis y la purificación de un 89 Zr radioinmunoconjugado DFO-mAb, y (3) en vivo de imágenes PET con un 89 Zr-DFO-mAb radioinmunoconjugado en un modelo murino de cáncer.

El primer paso en este protocolo la conjugación de DFO-NCS al anticuerpo es típicamente bastante robusto y fiable. Generalmente, la, inmunoconjugado modificado quelante-purificado puede obtenerse con un rendimiento&gt; 90%, y el uso de 3 equivalentes molares de DFO-NCS en la reacción inicial Conjugación producirá un grado de etiquetado del quelante de aproximadamente 1,0-1,5 DFO / MAB. Los 89 Zr de radiomarcaje y purificación pasos del procedimiento son igualmente sencillo. A las concentraciones descrit...

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The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

El bioconjugación y Radiosíntesis de<sup&gt; 89</sup&gt; Los anticuerpos marcados con Zr-DFO

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

the-bioconjugation-and-radiosynthesis-of-89zr-dfo-labeled-antibodies

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The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

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SCIENTISTS IN ACTION

17.0K vistas.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described. 

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Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

Origami Inspired autoensamblaje de partículas modeladas y Reconfigurable

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Investigación

Química

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Aislamiento y Caracterización química del lípido A de bacterias gram-negativas

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and cleaves intracellular proteins that are essential for neurotransmitter release. BoNT is comprised of a heavy chain (HC), which mediates host cell binding and internalization, and a light chain (LC), which cleaves intracellular host proteins essential for acetylcholine release. While therapies that inhibit toxin binding/internalization have a small time window of administration, compounds that target intracellular LC activity have a much larger time window of administrations, particularly relevant given the extremely long half-life of the toxin. In recent years, small molecules have been heavily analyzed as potential LC inhibitors based on their increased cellular permeability relative to larger therapeutics (peptides, aptamers, etc.). Lead identification often involves high-throughput screening (HTS), where large libraries of small molecules are screened based on their ability to modulate therapeutic target function. Here we describe a FRET-based assay with a commercial BoNT/A LC substrate and recombinant LC that can be automated for HTS of potential BoNT inhibitors. Moreover, we describe a manual technique that can be used for follow-up secondary screening, or for comparing the potency of several candidate compounds.

The botulinum neurotoxin type A light chain (BoNT/A LC) is a metalloprotease that enters motor neurons, cleaves its substrate SNAP-25, and disrupts neurotransmission, thereby resulting in flaccid paralysis. Utilizing a high-throughput-compatible FRET-based assay, large libraries of small molecules can be screened for their impact on BoNT/A LC enzymatic activity.

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

Formación de estructuras biomoleculares ordenada por el auto-ensamblaje de péptidos cortos

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

Síntesis Split-y-piscina y caracterización del péptido Terciario Amida Biblioteca

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Síntesis de Proteínas bioconjugados<em&gt; vía</em&gt; Química cisteína-maleimida

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Miradas en torno a las interacciones de los aminoácidos y péptidos con materiales inorgánicos Uso de una sola molécula de la Fuerza Espectroscopia

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential nutrients. The objective of this work is to demonstrate the qualitative and quantitative analysis of encapsulated fish oil supplements using high-resolution 1H and 13C NMR spectroscopy utilizing two different NMR instruments; a 500 MHz and an 850 MHz instrument. Both proton (1H) and carbon (13C) NMR spectra can be used for the quantitative determination of the major constituents of fish oil supplements. Quantification of the lipids in fish oil supplements is achieved through integration of the appropriate NMR signals in the relevant 1D spectra. Results obtained by 1H and 13C NMR are in good agreement with each other, despite the difference in resolution and sensitivity between the two nuclei and the two instruments. 1H NMR offers a more rapid analysis compared to 13C NMR, as the spectrum can be recorded in less than 1 min, in contrast to 13C NMR analysis, which lasts from 10 min to one hour. The 13C NMR spectrum, however, is much more informative. It can provide quantitative data for a greater number of individual fatty acids and can be used for determining the positional distribution of fatty acids on the glycerol backbone. Both nuclei can provide quantitative information in just one experiment without the need of purification or separation steps. The strength of the magnetic field mostly affects the 1H NMR spectra due to its lower resolution with respect to 13C NMR, however, even lower cost NMR instruments can be efficiently applied as a standard method by the food industry and quality control laboratories.

Here, high-resolution 1H and 13C Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy was used as a rapid and reliable tool for quantitative and qualitative analysis of encapsulated fish oil supplements.

Espectroscopía de RMN como una herramienta robusta para la Evaluación Rápida del perfil lipídico de los suplementos de aceite de pescado

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Síntesis y análisis de espectrometría de masas de peptoides Oligo

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...