Name: techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks
Uploaded: 2015-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks at

Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support. 
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z): 
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.

注：すべての手順は、ロイヤルビクトリア朝の瞳と耳病院アニマルリサーチ＆倫理委員会によって承認された（RVEEH AEC;＃10-199AB）。被験者は、国民健康と（2013）と「動物虐待防止法」医学研究審議会の「ケアと科学的な目的のための動物の使用のための実践のオーストラリアの規範」に従って処理した（;および修正1986）。全ての外科的、臨床的評価および電気生理学的手順は、全身麻酔下で実施し、全ての努力が苦痛を最小限にするために行われた。 1.除核および固定注：存在する場合、デバイスのケーブルまたは硝子体切除ポートの周りに余分な世話をして、コンパニオン原稿16で詳細に説明し摘出し、固定手順に従ってください。簡単に言えば、これは含む： <ol><li>経心冷たい中立ブフェ続い温かい生理食塩水で件名を灌流赤ホルマリン。 </li><li>目印として機能するように眼球に縫合糸を結ぶ。 </li><li>デバイスのケーブルとすべての添付ファイルのパッチ/タブを維持し、目16を脱核。 </li><li> 36時間 - 18ダビッドソンのソリューションに目をポスト修正。 </li><li> 8時間 - 6、50％エタノールに移します。 </li><li>解剖まで、70％エタノールと冷蔵（4℃）に移します。 </li></ol> 2.電極の取り外しおよび解剖。 注：すべての網膜上のインプラントは、同一のフォームファクタを有することになるが、一般的に電極アレイと、柔軟で適合性担体材料のいくつかの形態が存在する。網膜に仮止めされたデバイスは、金属タックが一緒にこれらを維持し、配列と目のバックを貫通タック穴を備えています。 <ol><li>インプラントとは、網膜に固定されている点をの視覚化。 <ol><li> 15度のブレードを使用すると、周トランス角膜切開を行い、EXPに角膜のキャップを外す根底にある虹彩とレンズOSE。 </li><li> 15度のブレードを用いて、網膜上インプラントと、その場で金属タックと房が露出、レンズの小帯線維をdisinsertとTOTOにレンズを取り外してください。 </li></ol></li><li>インプラントと研究が行われているに応じて、さらに解剖の前に余分な成分を取り除く。 注：この例では、評価されて網膜上の配列はコンフォーマルシリコーンキャリア内に収容されたプロトタイプの気密性 ​​ダイヤモンド電極と電子回路パッケージから成る（社内で製造し、20を参照）。 <ol><li>ここでは、慎重にメスで細かい切開によってダイヤモンド電極パッケージを抽出します。網膜のタックと白金配線の残党（ 図2）と一緒に、インプラントのシリコーン体のままにしておきます。エンベデッドアレイ/ハウジングは、調査中のデバイス設計の一部ではない場合は、この手順（2.2）を省略する。 </li></ol></li><li>慎重に所望の配向で粘着性および周囲組織を含むサンプルを分析。強膜、脈絡膜と網膜を含む眼の奥から、全層ストリップをカットする細かい解剖ハサミを使用してください。タックに隣接するすべての網膜層を示す、タックの長手方向の断面を与えるサンプルを取る（ 図2） 注：サンプルのための所望の向きは、所望の特定の結果に応じて異なる場合があります。一つは光学ディスクにタック損傷の近接性を調べることを望む場合は、その後、光学ディスクは、サンプル内に含まれるべきである。 </li></ol> 3.脱水、埋め込み、取り付け、研削、染色、およびイメージング<ol><li>プログレッシブエタノール段階での3日間のサンプルを脱水： <ol><li>回2時間、70％エタノール中でサンプルを脱水する。 </li><li> O / Nを2回2時間、80％エタノール中でサンプルを脱水し。 </li><li> 2時間、90％エタノールで試料を脱水TWICE。 </li><li> O / Nを2回2時間、100％エタノール中でサンプルを脱水し。 </li></ol></li><li>回2時間で100％アセトンでサンプルを脱水。 <ol><li>アセトンからサンプルを取り出し、室温でそれ空気が乾燥するように光学顕微鏡下でそれを観察する。エポキシにサンプルを移し、それが/崩壊をカールを開始する直前に（3.4ステップを参照してください）​​。 注：崩壊した細胞収縮で軟組織の結果から液体を除去する。組織カーリング/崩壊が発生したときの感謝を経験して開発されている。 </li></ol></li><li>製造者の指示に従って医療グレードのエポキシ樹脂を準備します。樹脂を硬化させ、室温で1時間または24時間のいずれか、55℃を用いる。気泡の除去のために約50ミリバール〜5分間の真空チャンバ内の場所。沸騰するエポキシ混合物が発生します過度の真空として手動で真空を調節し、脱ガスを効果的に発生しません 注：ステップ3.2と同時にステップ3.3を実行します。 </li><li> SAMPを埋め込むル明確なエポキシ樹脂中。適切な密閉可能な容器内に脱気したエポキシで眼組織を浸し、硬化させるために、室温でO / Nを残す。 </li><li>サイズ変更や硬化エポキシブロックを再埋め込 ​​むことによって所望の向き（ 図2）でサンプルを埋め込 ​​むように注意してください。 （ - 図3A黄色カップ）タックの長軸は、金型の底部に平行に配向されるように、眼組織を含むリサイズブロック-埋め込 ​​む再。 </li><li>シリコンカーバイド紙（; 図3C及び3E 800グリッドで始まる）を使用して- （手動研削、上の水と250回転230）研削試料ホルダーに樹脂をマウントし、サンプルを挽く。 </li><li>染色のために、3のためにトルイジンブルー染色で地面を浸し- 5分、または汚れが発達するまで（ 図3F）。 </li><li>水道水（ 図3G）で洗い流してください。 </li><li>の細胞層を可視化するハイパワー解剖スコープを持つ画像標本の地面網膜（ 図3H）。エアエポキシ界面での回折を滑らかに試料上記エポキシの上面に蒸留水の液滴を適用する。サンプルを照らすために光ファイバ「グースネック」光源を使用してください。 </li><li> （試料ホルダーの最小正確で再現研削増分は20μmである）ほど試料の予め設定された厚さを研削、毎回3.9 - 繰り返し3.6ステップ。 </li></ol>

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	<li>Shepherd, R. K., Shivdasani, M. N., Nayagam, D. A., Williams, C. E., Blamey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+prostheses+for+the+blind.">Visual prostheses for the blind.</a> Trends Biotechnol. 31, 562-571 (2013).</li><li>Santos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+the+inner+retina+in+retinitis+pigmentosa.">Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa.</a> Arch Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).</li><li>Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+perception+in+a+blind+subject+with+a+chronic+microelectronic+retinal+prosthesis.">Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis.</a> Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).</li><li>Roessler, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiographic+findings+folowing+tack+fixation+of+a+wireless+epiretinal+retina+implant+device+in+blind+RP+patients.">Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).</li><li>Chow, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+artificial+silicon+retina+microchip+for+the+treatment+of+vision+loss+from+retinitis+pigmentosa.">The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa.</a> Arch Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).</li><li>Zrenner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+electronic+chips+allow+blind+patients+to+read+letters+and+combine+them+to+words.">Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words.</a> Proc Biol Sci. 278, 1489-1497 (2011).</li><li>Fujikado, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+of+semichronically+implanted+retinal+prosthesis+by+suprachoroidal-transretinal+stimulation+in+patients+with+retinitis+pigmentosa.">Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 4726-4733 (2011).</li><li>Saunders, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+surgical+procedure+for+implantation+of+a+prototype+suprachoroidal+retinal+prosthesis.">Development of a surgical procedure for implantation of a prototype suprachoroidal retinal prosthesis.</a> Clin Experiment Ophthalmol. , (2013).</li><li>Lee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+microelectrode+arrays+for+artificial+retinal+implants+using+liquid+crystal+polymers.">Development of microelectrode arrays for artificial retinal implants using liquid crystal polymers.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5859-5866 (2009).</li><li>Sakaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transretinal+electrical+stimulation+with+a+suprachoroidal+multichannel+electrode+in+rabbit+eyes.">Transretinal electrical stimulation with a suprachoroidal multichannel electrode in rabbit eyes.</a> Jpn J Ophthalmol. 48, 256-261 (2004).</li><li>Majji, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+histological+and+electrophysiological+results+of+an+inactive+epiretinal+electrode+array+implantation+in+dogs.">Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).</li><li>Walter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+implantation+of+electrically+inactive+epiretinal+microelectrode+arrays+in+rabbits.">Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits.</a> Retina. 19, 546-552 (1999).</li><li>Ray, A., Chan, L., Thomas, B., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prolonged+stimulation+at+the+electrode-retina+interface.">Effects of prolonged stimulation at the electrode-retina interface.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 1285-1287 (2006).</li><li>Colodetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+damaging+electrical+stimulation+in+the+retina.">Pathology of damaging electrical stimulation in the retina.</a> Experimental eye research. 85, 23-33 (2007).</li><li>Nayagam, D. A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Electrical+Stimulation+with+a+Suprachoroidal+Retinal+Prosthesis:+A+Preclinical+Safety+and+Efficacy+Study.">Chronic Electrical Stimulation with a Suprachoroidal Retinal Prosthesis: A Preclinical Safety and Efficacy Study.</a> PLoS One. 9, e97182 (2014).</li><li>Nayagam, D. A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Processing+Eyes+Implanted+With+a+Retinal+Prosthesis+for+Localized+Histopathological+Analysis.">Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50411 (2013).</li><li>Laube, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+surgical+techniques+for+implantation+of+a+wireless+intraocular+epiretinal+retina+implant+in+Gottingen+minipigs.">Development of surgical techniques for implantation of a wireless intraocular epiretinal retina implant in Gottingen minipigs.</a> Graefe's Archive For Clinical And Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 250, 51-59 (2012).</li><li>Gerding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+evaluation+of+intraocular+titanium+tacks+for+the+mechanical+stabilization+of+posterior+segment+ocular+implants.">Successful long-term evaluation of intraocular titanium tacks for the mechanical stabilization of posterior segment ocular implants.</a> Mat.-wiss. u. Werkstofftech. 32, 903-912 (2001).</li><li>Seo, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+retinal+tack+for+the+epiretinal+&#64257;xation+of+the+polyimide+electrode+array.">Silicon retinal tack for the epiretinal &#64257;xation of the polyimide electrode array.</a> Current Applied Physics. 6, 649-653 (2006).</li><li>Hadjinicolaou, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+of+retinal+ganglion+cells+with+diamond+and+the+development+of+an+all+diamond+retinal+prosthesis.">Electrical stimulation of retinal ganglion cells with diamond and the development of an all diamond retinal prosthesis.</a> Biomaterials. 33, 5812-5820 (2012).</li><li>Briggs, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+round+window+and+cochleostomy+approaches+with+a+prototype+hearing+preservation+electrode.">Comparison of round window and cochleostomy approaches with a prototype hearing preservation electrode.</a> Audiol Neurootol. 11, 42-48 (2006).</li><li>Shepherd, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cochlear+implant+electrode+array+for+use+in+experimental+studies.">An improved cochlear implant electrode array for use in experimental studies.</a> Hear Res. 277, 20-27 (2011).</li><li>Tykocinski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+electrode+position+in+the+human+cochlea+using+various+perimodiolar+electrode+arrays.">Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays.</a> Am J Otol. 21, 205-211 (2000).</li><li>Hardie, N. A., MacDonald, G., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+imaging+and+3D+reconstruction+of+mammalian+cochlea+by+fluorescent+confocal+microscopy.">A new method for imaging and 3D reconstruction of mammalian cochlea by fluorescent confocal microscopy.</a> Brain Res. 1000, 200-210 (2004).</li></ol>

Authors have nothing to disclose. Irfan Durmo is an employee of Cochlear Ltd.

標準的な組織学的技術は、金属、ガラス、さらにはダイヤモンドブレードでこれらのオブジェクトを切削制限によるその場で硬い金属インプラントを処理することができません。我々の仲間紙16には、修正された全眼固定技術の使用は、人為的な網膜剥離を減少させることができることを示した。現在の原稿では、 その場で人工内耳の21-23を可視化するための確立された研削·研磨技術は、網膜人工器官用に変更した。網膜に電極アレイを固定するために使用されるチタンタックは、epiretinally、周囲の眼組織と共にエポキシに包埋した。この樹脂ブロックは、次に、適切に配向され、次第に地面/金属タックにすぐ隣接する組織形態を明らかにするために研磨した。様々な深さでのブロックの研磨面の画像は、強力な解剖顕微鏡で撮影した。可視化とつの評価：このテクニックはするのに便利です網膜上インプラントに隣接する組織応答をる。移植片の移植に関連した外科的外傷を評価する。硬質の金属成分に対する生物学的反応を決定する。インプラントと網膜表面との間の距離を測定する。 この技術は、眼における網膜タックまたは他の硬質（ 例えば、金属製）のオブジェクトに隣接する領域のインサイチュ可視化のための将来の安全性試験に有用であろう。これはepiretinally網膜にタックプロテーゼの前臨床安全性を評価する直接的な適用を有する。また、網膜下の場所に位置してインプラントと接触している網膜の領域における組織の損傷を評価するために有用であり得る。 技術が正しく行われたことを確認するためにいくつかの方法がある。各段階で、網膜は、眼の外側の層に付着したまま必要があります。総人工網膜剥離がある場合、これはインド語あり固定に問題があることを食べた。サンプルが埋め込まれ、最終的な樹脂中に再配向される場合には網膜がブロックの研削面と直交に近くなるはずブロックする。これは、斜めのカットを最小限に抑えることができます。これは、（例えば網膜タックなど）オブジェクトを横断するのに必要な（既知のステップサイズの）増分研削ステップの数は、オブジェクトの寸法に応じて相関していることを確認することが有用である。 技術は、いくつかの方法で最適化することができる。研削プロセスに関連付けられたエポキシブロックの表面に傷が次第に細かいグレードの研磨を低減することができる。本研究のために、我々は、800 1000、1200、2400、4000グレードのシリコンカーバイド紙を使用した。ダイヤモンドペーストは、表面仕上げを改善するために使用することができる。微細な表面仕上げを高品質な画像が得られるが、追加の研磨時間を犠牲に。この技術の成果を改善するための別の重要な検討事項は、OPTIの選択と品質ですcsの、照明、画像キャプチャのために使用した。他の基本的な組織学的染色 - 特にニッスル染色は、トルイジンブルーの代わりに使用することができるが、さらなる最適化を必要とする場合がある。シミは、樹脂だけでなく、組織（ 例えば 、エオシン）、したがって、浅いポリッシュが背景変色を除去するための染色後に必要になることがありますを染色する。専門汚れ、蛍光色素および免疫組織化学的染色は行われませんでしたが、非常に特定の結果が望まれない限り、各研削レベルでこれらの汚れを実行するためにかなりの時間が必要である可能性が高い。しかし、埋め込 ​​みステップ（ステップ3.4）24の前に、全体として組織を染色することが可能である。 この技術の主な制限は、したがって、それは、研削、研磨の各段階での倍率の多様で多くの（おそらく冗長）の画像をキャプチャすることが賢明である、関心領域が離れて粉砕された後、それを取得することができないことである。それはあるまた、それぞれの研削深さ調整のために小さな増分を使用することが重要。この技術の他の制限は、組織をスライドガラス上にマウントし、標準（透過）光学顕微鏡で観察と比較して光学倍率および解像度のものである。プロトタイピングおよび新規なインプラント装置の安全性を評価する目的のために、肉眼的病理評価が主要な関心である。この技術は、網膜のタックに関連付けられ、臨床的に関連する損傷を観察するための効率的な方法を提供する。練習では、グラインドを収集するために必要な時間は、与えられた試料（一度埋め込まれた）ポリッシュと写真、それはセクションにパラフィンブロックまたは凍結切片を取ると時間に匹敵する。 網膜インプラントの範囲外の用途に拡張することが、本技術の可能性もあります。この技術は、インプラント抽出feasibないハード·インプラントに隣接する組織を評価するのに適しているルまたはインタフェースを損傷する。例えば、この技術は、いくつかの深部脳または末梢神経電極、薬物送達のためのカニューレ、血管ステントのような従来の組織学的技術を用いて切断することができない金属（ 例えば 、白金、ニチノールなど ）から作られたインプラントを評価するために拡張することができるまたは整形外科人工器官。

網膜色素変性症（RP）は、神経活動に、光子の形態では、光伝達を担う網膜の最外層中の細胞である光受容体の広範な喪失を引き起こす遺伝性疾患である。重要なことは、RP​​の患者は、一般的にはまだ機能している彼らの網膜の他の層の残留ニューロンを持っている。網膜補綴は、視経路1,2を活性化するために電気刺激をこれらの生き残ったニューロンを標的とすることによって、これらの患者にいくつかの制限された視力を回復することが可能である。臨床試験の知覚の結果は初期の結果を約束して示されており、最近になって一部のデバイスは、商業的使用のために承認されている。 epiretinally 3,4、網膜下に5,6とsuprachoroidally 7,8：現在、臨床網膜補綴物が配置されている中で、3つの主要な解剖学的位置があります。異なるデバイスは、異なる材料を利用し、そのフォームがカスタマイズされています彼らが移植されている場所へ。しかし、それらはすべて、電気パルスで網膜の残留ニューロンを活性化することによって、視覚的な知覚を作成します。 初期配置または後続の継続的な力の機械的効果に起因する周囲の組織損傷への医療用補綴物のための可能性がある。網膜補綴移植可能な刺激器の場合には、電気的パラメータが安全な範囲内であるべきである追加の考慮事項がある。デバイスは、厳密に臨床設定9-15に進む前に、前臨床試験で試験されなければならないので、患者の安全性は、最も重要である。私たちのコンパニオンの記事では、脈絡膜上腔16内に配置インプラント周囲の目のローカライズされた組織病 ​​理を評価するための方法を説明した。本論文では、我々は、前臨床（feの中で、epiretinally網膜にタック電極アレイの周囲の眼組織を視覚化するための技術を説明ライン）モデル（ 図1）。 網膜上の位置は、視覚的な人工器官の位置を特定するための最も一般的に利用される位置である。ここに位置する電極アレイは、一般的に、目17-20のすべての層を貫通する金属タックと網膜に固定されている。本論文に記載された技術の前に、正確にすぐにタックを取り囲む網膜および他の組織を評価することは困難であった。中性緩衝ホルマリンを使用して、標準的な眼の固定は、タックの固定点に対する網膜と強膜の差動移動による人為網膜損傷が生じた。したがってタックと網膜上の配列によって生じた実際の損害を正確に観察することができませんでした。金属物が容易に伝統的な組織学的装置で切断することができないように加えて、眼組織を区画すると、 その場での網膜のタックを用いて行うことができませんでした。組織学的処理の前にタックを除去することでもあったこれはまた、人為的な網膜損傷につながったとして望ましくない。 本研究の目的は二重であった：タック及び網膜上インプラントアレイによる損傷を確実に評価することができるように、1）網膜剥離アーチファクトを削減する。 2）それを除去せずにタックに隣接する網膜のアーキテクチャを可視化した。人為的な網膜剥離を減少させる、（関連記事16に記載されているように）目的1を達成するために、新たな固定技術を利用した。目的2を達成するために、我々は本来人工内耳電極21〜23 のその場観察にために開発され、研削、および研磨技術、埋め込 ​​みを修正した。人工網膜の損傷を最小限にし、したがって、タックと網膜上の配列によって生じる潜在的な被害の正確な評価を可能にしながら、この原稿に記載された方法は、その場でタックへの周囲の網膜の視覚化と隣接することができます。

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Chem-Supply</td><td>AA008</td><td>Propanone BHD Medical grade</td></tr><tr><td>Epo-Tek 301 Epoxy</td><td>Epoxy Technology</td><td>Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70-75% v/v</td><td>Merck PTY LTD</td><td>4.10261</td><td>Alcohol</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck PTY LTD</td><td>90143</td><td>Alcohol</td></tr><tr><td>Toluidine blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TegraPol grinding/polishing machine</td><td>Struers</td><td>TegraPol-25</td><td></td></tr><tr><td>AccuStop specimen holder</td><td>Struers</td><td>Accustop</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>Objective lens</td><td>Leica</td><td>2.0x Planapo Objective</td><td></td></tr><tr><td>Digital Microscope Camera</td><td>Leica</td><td>DFC-420C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Software</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>Application Suite v4.1.0</td><td></td></tr></tbody></table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

固定プロトコールは、実質的に網膜16の人工剥離および層間剥離を減少させた。エポキシブロック内の試料の配向は、記載される二段階埋め込みプロセスを使用して一貫して達成した。増分研削手順は、最適な結果を達成するために、手先の器用さの適度なレベルを必要としますが、増分の分解能を細かく制御を提供し、調整可能試料ホルダーによって助けられた。全ての場合において、（n = 5）の粘着性が配置され、地面/望ましいと一貫性のある結果で研磨。鋲に隣接した網膜は解決可能であったし、適切に染色された。グレードP＃800の炭化ケイ素紙エポキシ樹脂ブロックの表面を研磨すると、埋め込まれた組織の細胞マクロ画像に十分であった。より高いグレードの紙、またはダイヤモンドスラリーは、必要に応じて、さらに、任意の所与の深さの表面を研磨するために使用することができる。解剖顕微鏡および光ファイバ「グースネック」ガーゼトンのソースは、接地ブロック及び包埋組織試料の表面を撮像するのに適していることが分かった。光源の位置は、顕微鏡で最高の照明およびコントラストを与えた位置と角度を見つけるために試行錯誤によって変化させた。ブロックの表面に蒸留水の液滴を加えてサンプルの上に、エポキシ空気界面での光路回折および/ ​​または滑らかな歪みを減少させるのに有用であった。 図4をチタン網膜に直接隣接して可視化網膜組織の画像例を示しているこの技術を用いてタック。非人工網膜剥離と折りたたみは、シリコーン（ 図4A）の両側に見ることができます。タックシャフトがシリコーンに埋め込まれて表示される。タックの頭は、網膜と強膜に浸透した。シリコン（ 図4C）の未染色網膜両側における非人為的な網膜剥離があります。技術はTHER、この例では、次のことを示しているeは、斜め挿入角度による片側網膜のタックおよび圧縮に隣接する網膜組織崩壊である。提示される画像は、単に技術の成功のイラストは、一般的には粘着性の損傷組織病理のではない代表的なものであることに注意してください。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig1highres.jpg" /> 網膜上電極アレイの図1の配置。後部強膜、脈絡膜と網膜の縮退拡大断面を示す、眼の（A）の模式図（光受容体を欠いている）。電極アレイは、網膜上電極アレイの青、epiretinally貼付。（B）コンピュータ支援、図面に描かれている。 、集積回路（「チップ」）および電極パッケージ。 B、​​チタン網膜タック。 cを医療グレードのシリコーンハウジングとD、リード出口点。パネルAは、オリジナルのillustratiから変更バイオニックビジョンオーストラリアの提供礼儀上、著作権ベスクローチェ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig2highres.jpg" /> 図2.電極の除去と、目の解剖。 その場での網膜上のタックと除核ネコの目の高ダイナミックレンジマクロ写真。（A）デビッドソンの固定液とポストの固定は、網膜アーキテクチャ16維持するために、除核の目を解剖した。電極アレイパッケージが、シリコーンキャリアから除去された残りのインプラントのタック（矢印）およびシリコーン本体と（破線の正方形の輪郭は、電極アレイの元の場所を示す）。（B）眼に隣接した長手方向断面を解剖しタック（破線）。タックは、強膜によって主に安定化されたアイカップ（矢印）の後壁に埋め込まれたままである。除去された電極アレイの下の網膜を含むセクションは、標準的な組織学的処理16（左セグメント）のために調製したがタックを含む組織切片は、樹脂包埋研削（右セグメント）のために調製した。 0.5ミリメートル刻みで定規は各パネルの下端に表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig3highres.jpg" /> 図3.エポキシ埋め込 ​​みタック及び網膜組織の研削 、 エポキシ埋め込 ​​みと整列した組織サンプルの写真を、研削、染色および粘着性および網膜組織のイメージング（A）のtac<html> k個のサンプルは、エポキシ樹脂ブロックに包埋した。金型を用いて、試料を長手方向の平面は、型の底部と平行になるように配向させた。研削（B）はタックサンプルを含む硬化エポキシブロック（C）エポキシブロック粉砕試料ホルダーに装着し、準備（D）試料を基本組織のように撮像されたセクションは、網膜細胞層とタックの長手方向軸を含む配向した。（E）試料をロータリーグラインダー上にシリコンカーバイド紙を用いて粉砕した。（F）の地面ブロックは、網膜層を識別するためにトルイジンブルーで染色した。（G）ブロックを、過剰染色を除去し、水道水でリンスした。（H）トルイジンブルーは網膜層を染色し、粘着性が高出力解剖スコープを使用して画像化した。 広告/ 52348 / 52348fig4highres.jpg &quot;/&gt; 図4.ハイとタックと網膜の低消費電力の画像。さまざまな点で研削加工画像中には、タックの縦断面を示す、解剖スコープで撮影した（アスタリスク）の目を貫通し、強膜を終了（ &#39;S&#39; ）、シリコーン（ハッシュ）、トルイジンブルー染色し、染色されていない網膜（R &#39;&#39;）を隣接する。これらは単に本可視化技術を実証する例の画像であり、すべての網膜上インプラントまたはタック挿入組織学の結果の代表ではないことに注意してください。プラチナ配線のグランド残党（ &#39;W&#39;）パネルADに表示されている。（A）低消費電力、網膜と強膜を貫通タックの非染色画像。網膜剥離の（B）ハイパワー画像と隣接する未染色網膜に折りたたみタックシャフトの中央の画像A.（C）低電力画像シリコーンキャリア。 <strオング&gt;（D）は、別々のサンプルで、画像C.（E）中のタックの中央の高パワー画像、無シリコーンキャリアと、タック柄の下のトルイジンブルー染色した網膜の高倍率画像は直前に示されている。タックシャフト（F）ノーマルトルイジンブルー染色した網膜のアーキテクチャを研削（GCL：網膜神経節細胞層、INL：内顆粒層、ONL：外顆粒層と、PR：光受容体; T：ネコタペート芝）は、同じ研削技術を用いて視覚化。各パネルのスケールバーは、以下のとおりです。AとC = 2ミリメートル。 BとD =500μmの。 E = 200程度。 F =100μmである。

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Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

網膜タックと2部網膜上インプラント：ローカライズされた病理組織学的分析のための人工網膜を移植した処理の目のための技術

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

11.5K ビュー.  Bionics Institute. Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis. 

ビデオ: Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

網膜色素上皮生理学と病態の研究のための実験的モデル

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

神経科学

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

ローカライズされた病理組織学的分析のための人工網膜を移植処理アイズのための技術

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

医学

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal pigmented epithelium (RPE) is a key pathobiological event in AMD. To understand the mechanisms that lead to RPE dysfunction, mouse models can be utilized by researchers. It has been established by previous studies that mice can develop RPE pathologies, some of which are observed in the eyes of individuals diagnosed with AMD. Here, we describe a phenotyping protocol to assess RPE pathologies in mice. This protocol includes the preparation and evaluation of retinal cross-sections using light microscopy and transmission electron microscopy, as well as that of RPE flat mounts by confocal microscopy. We detail the common types of murine RPE pathologies observed by these techniques and ways to quantify them through unbiased methods for statistical testing. As proof of concept, we use this RPE phenotyping protocol to quantify the RPE pathologies observed in mice overexpressing transmembrane protein 135 (Tmem135) and aged wild-type C57BL/6J mice. The main goal of this protocol is to present standard RPE phenotyping methods with unbiased quantitative assessments for scientists using mouse models of AMD.

Mouse models can be useful tools for investigating the biology of the retinal pigmented epithelium (RPE). It has been established that mice can develop an array of RPE pathologies. Here, we describe a phenotyping protocol to elucidate and quantify RPE pathologies in mice using light, transmission electron, and confocal microscopy.

加齢黄斑変性症マウスモデルにおける網膜色素性上皮病変を評価および定量化するためのプロトコル

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

遺伝学

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

マウス網膜を使用してCNSにおける血管再生の評価

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

緑内障誘導の手順<em&gt;インビボ</em&gt;ラットモデルと全体のマウント網膜準備

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

生物学

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in retinal diseases, and testing therapeutic interventions. The ex vivo electroretinogram (ERG) allows the quantification of contributions from individual cell types in the isolated retina by addition of specific pharmacological agents and evaluation of tissue-intrinsic changes independently of systemic influences. Retinal light responses can be measured using a specialized ex vivo ERG specimen holder and recording setup, modified from existing patch clamp or microelectrode array equipment. Particularly, the study of ON-bipolar cells, but also of photoreceptors, has been hampered by the slow but progressive decline of light responses in the ex vivo ERG over time. Increased perfusion speed and adjustment of the perfusate temperature improve ex vivo retinal function and maximize response amplitude and stability. The ex vivo ERG uniquely allows the study of individual retinal neuronal cell types. In addition, improvements to maximize response amplitudes and stability allow the investigation of light responses in retina samples from large animals, as well as human donor eyes, making the ex vivo ERG a valuable addition to the repertoire of techniques used to investigate retinal function.

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Modification of existing multielectrode array or patch clamp equipment makes the ex vivo electroretinogram more widely accessible. Improved methods to record and maintain ex vivo light responses facilitate the study of photoreceptor and ON-bipolar cell function in the healthy retina, animal models of eye diseases, and human donor retinas.

大小眼の網膜機能を研究するための Ex Vivo 網膜電図のセットアップと条件の最適化

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

げっ歯類の外科的緑内障に対する辺縁血管神経叢の全周焼灼

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

新しいヒトの言語性の高いレティナル文化技術の特徴付け

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular cells. Isolating, culturing, and sustaining retinal neurons in vitro have technical and biological limitations. Culturing retinal explants may overcome these limitations and offer a unique ex vivo model to study the cross-talk between various retinal cells with well-controlled biochemical parameters and independent of the vascular system. Moreover, retinal explants are an effective screening tool for studying novel pharmacological interventions in various retinal vascular and neurodegenerative diseases such as diabetic retinopathy. Here, we describe a detailed protocol for retinal explants' isolation and culture for an extended period. The manuscript also presents some of the technical problems during this procedure that may affect the desired outcomes and reproducibility of the retinal explant culture. The immunostaining of the retinal vessels, glial cells, and neurons demonstrated intact retinal capillaries and neuroglial cells after 2 weeks from the beginning of the retinal explant culture. This establishes retinal explants as a reliable tool for studying changes in the retinal vasculature and neuroglial cells under conditions that mimic retinal diseases such as diabetic retinopathy.

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

This protocol presents and describes steps for the isolation, dissection, culturing, and staining of retinal explants obtained from an adult mouse. This method is beneficial as an ex vivo model for studying different retinal neurovascular diseases such as diabetic retinopathy.

網膜神経血管疾患研究のための ex vivo モデルとしての成体マウス網膜網膜の外植片

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular ...