Este trabajo fue apoyado por becas fromthe Fondo Belga para la Investigación Científica (FNRS), Les Amis de l&#39;Institut Bordet, FNRS-Opération Télévie, Cáncer del Plan de Bélgica, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson y Fonds Barsy.

NOTA: Todos los especímenes fueron adquiridos utilizando un protocolo aprobado por el Comité de Ética Médica del Instituto Jules Bordet con el consentimiento informado por escrito obtenido de cada paciente. 1. Preparación del homogeneizado de tejido <ol><li> Diseccionar tejidos resecados (tejido maligno y normal resecado de la sala de operaciones) están en el laboratorio de patología por personal capacitado para su recogida inmediata. Tumor, NANT (tomada la distancia más alejada del tumor como sea posible) y fragmentos de tejido normal se procesan de forma rutinaria plazo de 1 - 3 horas de la escisión quirúrgica en un laboratorio BSL2 usando procedimientos de bioseguridad estándar para los tejidos humanos. Un diagrama de flujo del protocolo se ilustra en la Figura 1. </li><li> Pesar todos los fragmentos de tejido (normal, NANT y tumorales) y medir la longitud, anchura y altura (largo x ancho x alto). Este es un paso importante para la posterior normalización de las subpoblaciones de células, el ARN extraído, etc. NOTE: El rango de tamaño de la muestra es de 100 a 10.000 mm 3 con nada de grasa si es posible. </li><li> Pie de imprenta el fragmento del tumor en un portaobjetos de vidrio para tinción H &amp; E para verificar que el tejido es en realidad parte del tumor. <ol><li> Para ello, pulsando un microscopio portaobjetos de vidrio en el fragmento del tumor y aplicar una suave presión con los dedos durante unos segundos. </li><li> Fijar el portaobjetos con isopropanol durante 2 min seguido de una etapa de lavado en agua. Contratinción el tejido durante 30 segundos con hematoxilina de Mayer. </li><li> Lave la diapositiva en seis baños de agua. Teñir en Floxina B 2% durante 15 s. </li><li> Lave en un baño de agua, seguido de cuatro baños de isopropanol y terminar con un baño de agua. </li><li> Incubar en isopropanol durante 1 min y de drenaje. Claro en dos baños de xileno. </li><li> Montar con medio de montaje basado xileno. Examine para celularidad tumoral (Figura 2). NOTA: Principalmente, las células tumorales se adhieren a la diapositiva improntado - el estroma, linfoide o adipose células raramente permanecen, dejando espacios entre las células tumorales (Figura 2). </li></ol></li><li> Coloque el fragmento de tejido en un pequeño plato de cultivo que contiene 1 ml de la, medio de células hematopoyéticas libre de suero definido químicamente (en lo sucesivo denominado medio) a temperatura ambiente y trocea en pedazos pequeños (~ 1 - 2 mm 2) utilizando un estéril bisturí. </li><li> Transferir todo (fragmentos de tejido + medio) a un tubo disociador C mecánica. </li><li> Enjuague la placa de Petri y el bisturí con 2 ml de medio con una pipeta Pasteur y añadir esta al tubo C (volumen de medio para la disociación = 3 ml). </li><li> Utilice la A.01 programa disociador mecánico para tubos C (el programa más suave) para homogeneizar los fragmentos de tejido en una suspensión de células individuales. Coloque el tubo de C en el aparato y ejecutar el programa dos veces seguidas (un ciclo = 25 segundos). NOTA: Este procedimiento de homogeneización se ha establecido y validado por el tejido mamario humano, otra tumo tejido o tipos pueden necesitar usar un programa diferente y debe ser probado primero. </li><li> Retire el tubo C del aparato y decantar el homogeneizado directamente en un filtro de células de 40 micras sentado en un tubo de 50 ml. Usando la misma pipeta Pasteur como en el paso 1.6, transferir cualquier líquido restante en el tubo C para el filtro de células. </li><li> Transferir el líquido filtrado en un tubo de 15 ml con una punta de micropipeta 1 ml. Temporalmente mantener el filtro de células y su tubo 50 ml. </li><li> Enjuague el tubo C con un adicional de 3 ml de medio y transferir este, de nuevo utilizando la misma pipeta Pasteur como en el paso 1.6, para el filtro de células todavía sentado en el tubo de 50 ml. Exprima una cantidad máxima del líquido residual atrapado en el tejido no homogeneizada en el tubo de 50 ml moviendo suavemente alrededor del filtro con una pipeta Pasteur limpia o 1 ml punta que posteriormente desechado para evitar contaminar el eluido. </li><li> Coloque el colador celular al revés de tél tubo C original y enjuague con 3 ml de medio para que el tejido no homogeneizada cae de nuevo en el tubo C. </li><li> Vuelva a homogeneizar como en el paso 1.7 para dos ciclos del programa A.01. </li><li> Verter esta segunda homogeneizado a través del filtro de células sentado en el tubo de 50 ml, lavar el tubo C de nuevo con medio de 3 ml (como en el paso 1,10) y transferir con la pipeta Pasteur para el filtro de células sentado en el tubo de 50 ml de nuevo apretando un máximo cantidad de líquido desde el tejido conectivo residual atrapado en el filtro de células. </li><li> En este punto, un volumen de ~ 2,5 ml es en el tubo de 15 ml y ~ 9 ml en el tubo de 50 ml. </li></ol> 2. La separación del sobrenadante de tejidos y células <ol><li> Centrifugar los homogeneizados en los 15 ml y 50 ml tubos durante 15 min a 600 xg a temperatura ambiente. </li><li> Decantar el SN desde el tubo de 15 ml en un tubo limpio y almacenar temporalmente a 4 ° C. Este sobrenadante = tumor primario, NANT o Ti normalesDICIÓN SN (volumen final de 2,5 ml) se precisó y alicuotó antes de su almacenamiento a -80 ° C para análisis futuros (ver más abajo). </li><li> Desechar el sobrenadante del tubo de 50 ml. </li><li> Resuspender suavemente ambos sedimentos celulares en un volumen final de 1 ml de medio. Brevemente, primero romper suavemente el sedimento celular en ambos tubos (tocando el tubo sobre una superficie dura). Resuspender el sedimento celular suelta en los 50 ml con 500 l de medio y transferir la suspensión celular al tubo de 15 ml para resuspender el pellet segundos. Repita este paso una vez con los segundos 500 l de medio para la recuperación máxima de las células. </li><li> Transferencia de 10 l de la suspensión celular a un tubo pequeño, mezcle con 10 l de azul de tripano (dilución 1: 1) y contar el número de células viables utilizando un hemocitómetro. NOTA: En este punto una fracción de la suspensión celular puede también ser analizada por citometría de flujo para evaluar el tamaño celular, granularidad y si se desea un número limitado de marcadores subpoblación para más precise evaluación de la distribución relativa de célula en el homogeneizado antes de extenso análisis o experimentación. Todos los análisis por citometría de flujo incorporan etiquetado CD45 para la normalización de las subpoblaciones. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Las células del tumor, NANT, o tejido normal están ahora listos para la purificación adicional o análisis. Estos pasos adicionales son mejores cuando se realizan en el mismo día de la cirugía. NOTA: Para el análisis de citometría de flujo pero no de clasificación de células de las células rojas de la sangre residual debe ser lisadas después del marcaje de anticuerpos mediante la adición de 0,4 ml de sangre roja tampón de lisis celular al sedimento celular, inmediatamente agitación durante 1 seg y la incubación de un mínimo de 10 min en la sala de temperatura (protegido de la luz) antes del análisis. </li></ol> 3. Aclaración del sobrenadante de Tejidos <ol><li> Centrifugar los tubos de 1,5 ml con SN tejido a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Retire con cuidado tél sobrenadante sin tocar o alterar el sedimento. Transferir a un tubo limpio (o tubos) dependiendo del número y volumen de alícuotas deseados. </li><li> Almacenar el sobrenadante a -80 ° C para uso futuro. </li></ol> 4. sangre del paciente <ol><li> Se recoge una muestra de sangre de cada paciente como un control por punción venosa en tubos heparinizados el día antes de la cirugía. Centrifugar la sangre a 400 xg durante 10 min a 20 ºC con el freno para obtener el plasma y la capa leucocitaria. </li><li> Retire el plasma y clarificar por centrifugación a 10.000 xg durante 15 min a 20 ºC. Alícuota y almacenar plasma a -80 ° C para uso futuro. Se diluye la capa leucocitaria en medio </li><li> Separar las células mononucleares utilizando estándar de centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque antes del análisis inmediato, el aislamiento subpoblación, ADN / ARN / extracción de la proteína o la criopreservación. </li></ol> 5. Citometría de Flujo <ol><li> Las células de la etiqueta según fabricacióninstrucciones del r a 4 ° C, protegido de la luz. Lisar las células rojas de la sangre en las suspensiones de células a partir de fragmentos de tejido después del marcaje de anticuerpos mediante la adición de 0,4 ml de tampón de lisis celular al sedimento celular. </li><li> Vortex inmediatamente durante 1 segundo e incubar un mínimo de 10 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. Pasar las células marcadas en un citómetro de flujo para la adquisición de datos sin lavar. </li></ol>

<ol>
	<li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncology+meets+immunology:+the+cancer-immunity+cycle.">Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle.</a> Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).</li><li>Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+'elite+hacker':+breast+tumors+exploit+the+normal+microenvironment+program+to+instruct+their+progression+and+biological+diversity.">An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity.</a> Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).</li><li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. 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A., Guasch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+orthotopic+transplantation+of+epithelial+tumors+in+single-cell+suspension.">Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension.</a> Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).</li><li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+cells+obtained+from+the+blood+but+not+from+the+tumor+can+suppress+T-cell+proliferation+in+patients+with+melanoma.">Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma.</a> Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).</li><li>Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+B+cell+characterization+in+blood,+lymph+nodes,+and+tumors+from+patients+with+malignancies.">Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies.</a> J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).</li><li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+follicular+helper+T+cell+infiltration+predicts+breast+cancer+survival.">CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival.</a> J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).</li><li>Buisseret, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+Infiltrating+Breast+Cancer+:+Density,+Composition+And+Organization.">Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).</li><li>Garaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+B+Cells+Infiltrating+Human+Breast+Cancer.">Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 18 (2014).</li><li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cxcl13-Producing+Follicular+Helper+T+Cells+In+Human+Breast+Cancer.">Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).</li><li>Yee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+endogenous+T+cells+for+adoptive+transfer.">The use of endogenous T cells for adoptive transfer.</a> Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).</li><li>Butler, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+of+human+CD8++T+cells+using+autologous+CD4++T+cell+help.">Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help.</a> PLoS One. 7 (1), 30229 (2012).</li><li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+artificial+antigen+presenting+cells+facilitate+direct+and+efficient+expansion+of+tumor+infiltrating+lymphocytes.">Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes.</a> J Transl Med. 9, 131 (2011).</li></ol>

The authors declare that no conflict of interest exists.

Este estudio describe un método optimizado para la rápida preparación de los homogeneizados de tejidos normales y malignos de mama sin digestión enzimática para la clasificación posterior de células, la extracción, la criopreservación y / o análisis fenotípico de CD45 + subpoblaciones. El objetivo de este enfoque experimental es para producir imágenes de la TIL que refleja de cerca su estado in vivo y compararlos con los tejidos normales con mínima manipulación de los tejidos frescos de...

The tumor microenvironment is composed of various cell types with numerous studies showing they each play distinct and important roles in tumorigenesis1,2. These include, but are not limited to, infiltrating immune cells, stromal cells, endothelial cells and tumor cells3. Ex vivo studies of tumor infiltrating lymphocytes (TIL; CD45+ cells or leukocytes, which are predominantly lymphocytes in breast tumors) from fresh human tissue samples is made difficult by their low frequency, the small sample sizes often available for research and the potential for loss of viability during extraction. Because immune cells infiltrating tumors are usually present as passengers rather than permanent residents in general they are easier to release from the tissue matrix.
Dissociating tumor tissue while maintaining cellular integrity is technically challenging and has traditionally been performed using a combination of mechanical and enzymatic steps to prepare single cell suspensions4-8. This approach involves lengthy incubation periods and is associated with a significant reduction in cell viability as well as the loss of cell surface receptors by enzymatic cleavage. High quality flow cytometric studies characterizing TIL in the tumor microenvironment as well as clean purifications of CD45+ subpopulations by flow cytometry or antibody-coated beads are more difficult to achieve from enzyme-digested tumor tissue. In addition, the supernatant (SN) from the resulting tumor homogenate is not amenable to further analysis including quantification of secreted proteins (cytokines, chemokines, immunoglobulins or tumor antigens) or experimental treatment of normal cells, because of the potential for protein degradation in the enzymatic digests.
In our search for a method to prepare single cell homogenates from breast tissues [including tumor, non-adjacent non-tumor (NANT) and normal (from mammary reductions) breast tissues] without enzymatic digestion, we tested a variety of mechanical homogenization techniques. Homogenates prepared using a mechanical dissociator had increased cell viability (2-fold) and total cell recovery (2-fold) while preserving surface receptor expression. Enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells suggesting they were all released in the initial homogenate. Thus, this rapid and simple approach allows both qualitative and quantitative assessment of the CD45+ subpopulations present in various normal and malignant human tissues. An added advantage of this approach is that the SN from the initial homogenate (primary tissue SN) can be collected and stored for further analysis or experimentation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="980">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:272px;">Equipment</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:409px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">GentleMacs Dissociator&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:137px;">130-093-235</td>
			<td>BD Medimachine is somewhat equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Centrifuge 5810 R</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>or other standard table top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Centrifuge 5417 R</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>or other standard microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Esco Class II A2 Biosafety Cabinet</td>
			<td>ESCO global</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>or other standard BSL2 hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:163px;">Nikon eclipse TS100</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>or other microscope compatible for a hemacytometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">B&#252;rker Chamber</td>
			<td style="width:163px;">Marienfield&#160;</td>
			<td style="width:137px;">640210</td>
			<td>or other standard hemacytometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Navios Flow Cytometer</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>or other flow cytometer (8-10 color recommended)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:272px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:272px;">Materials</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">GentleMacs C-Tube</td>
			<td style="width:163px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:137px;">130-096-344</td>
			<td>BD Medimachine uses Filcon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Cell Culture Dish</td>
			<td style="width:163px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:137px;">72,710</td>
			<td>or other non-pyrogenic plasticware&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Disposable Scalpel</td>
			<td style="width:163px;">Swann-Morton</td>
			<td style="width:137px;">0510</td>
			<td>or standard single use sterile scalpel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">BD Cell Strainer 40&#181;m</td>
			<td style="width:163px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">734-0002</td>
			<td>or other non-pyrogenic plasticware&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">BD Falcon Tube 50mL</td>
			<td style="width:163px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">352070</td>
			<td>or other non-pyrogenic plasticware&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">BD Falcon Tube 15mL</td>
			<td style="width:163px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">352097</td>
			<td>or other non-pyrogenic plasticware&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">BD FACS Tube 5mL</td>
			<td style="width:163px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">352008</td>
			<td>or other non-pyrogenic plasticware&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Sterile Pasteur Pipette 5 mL&#160;</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">612-1685</td>
			<td>or other non-pyrogenic plasticware&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Microfuge Tube 1.5 mL</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">7805-00</td>
			<td>or other non-pyrogenic plasticware&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:272px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:272px;">Reagents</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">X-Vivo 20</td>
			<td style="width:163px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">BE04-448Q</td>
			<td>serum-free medium recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:163px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">BE17-516F</td>
			<td>standard physiological PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Trypan blue&#160;</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">17942E</td>
			<td>or other vital stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">VersaLyse</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">A09777</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fixable viability Dye eFluor 780&#160;</td>
			<td style="width:163px;">eBioscience</td>
			<td style="width:137px;">65-0865-14</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">anti-CD3 FITC</td>
			<td style="width:163px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:137px;">345763</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">anti-CD3 Vio Blue</td>
			<td style="width:163px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:137px;">130-094-363</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">anti-CD4 PE</td>
			<td style="width:163px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:137px;">345769</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">anti-CD4 APC</td>
			<td style="width:163px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:137px;">130-091-232</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">anti-CD8 ECD</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">737659</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">anti-CD8 PerCP</td>
			<td style="width:163px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:137px;">345774</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">anti-CD19 APC-Vio770</td>
			<td style="width:163px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:137px;">130-096-643</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">anti-CD45 VioGreen</td>
			<td style="width:163px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:137px;">130-096-906</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and rapid protocol to non-enzymatically dissociate fresh human tissues for the analysis of infiltrating lymphocytes

La capacidad de las células malignas para evadir el sistema inmune, caracterizado por el escape del tumor de ambos respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, se acepta ahora como un sello importante de cáncer. Nuestra investigación sobre el cáncer de mama se centra en el papel activo que desempeñan linfocitos infiltrantes de tumores en la progresión tumoral y la evolución del paciente. Hacia este objetivo, hemos desarrollado una metodología para el aislamiento rápido de células linfoides intactos de tejidos normales y anormales en un esfuerzo para evaluar los próximo a su estado nativo. Los homogeneizados preparados usando un espectáculo disociador mecánica tanto una mayor recuperación de la viabilidad celular y preservando al mismo tiempo la expresión receptor de superficie en comparación tejidos digeridos con enzima para. Por otra parte, la digestión enzimática del material insoluble restante no se recuperó células CD45 + adicionales que indican que las mediciones cuantitativas y cualitativas en el homogeneizado primaria probablemente reflejen realmente la infiltración de las subpoblaciones en la Fragm tejidoent. Las células linfoides en estos homogeneizados pueden ser fácilmente caracterizado usando inmunológica (fenotipo, la proliferación, etc.) o molecular (ADN, ARN y / o proteína) enfoques. Células CD45 + también pueden ser utilizados para la purificación subpoblación, la expansión in vitro o crioconservación. Un beneficio adicional de este enfoque es que el sobrenadante tejido primario a partir de los homogeneizados se puede utilizar para caracterizar y comparar citocinas, quimiocinas, inmunoglobulinas y antígenos presentes en tejidos normales y malignos. Este funciones de protocolo extremadamente bien para los tejidos de mama humanos y deberían ser aplicables a una amplia variedad de tejidos normales y anormales.

La digestión enzimática de fragmentos de tejido, ya sea con soluciones disponibles en el mercado de disociación de tejido o diversas mezclas de laboratorio de colagenasa, DNasa y / o inhibidores de hialuronidasa, escinden una amplia variedad de receptores en la superficie de las células. Nuestros estudios, se centró inicialmente en las células T CD4 + que infiltran los tumores de mama, se presentaron rápidamente con un problema técnico importante debido a la escisión de los receptores de CD4 de la su...

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A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Un protocolo simple y rápida para no enzimáticamente disociarse Tejidos Humanos frescas para el Análisis de los linfocitos infiltrantes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

a-simple-rapid-protocol-to-non-enzymatically-dissociate-fresh-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.9K vistas.  Université Libre de Bruxelles. This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.