보조금 지원이 작품은 과학 연구 (FNRS), 레 미스 드 난 연구소 보르, FNRS 조작 Télévie, 벨기에의 계획 암, 퐁 Lambeau-Marteaux, 퐁 JC Heuson과 퐁 Barsy에 대한 벨기에 기금 폴더 만.

참고 : 모든 표본은 각 환자에서 얻은 정보를 담은 서면 동의 연구소 쥘 보르 데의 의료 윤​​리위원회의 승인을 프로토콜을 사용하여 획득 하였다. 조직 파쇄 1. 준비 <ol><li> 절제된 조직 (수술실에서 절제 악성 및 정상 조직)를 해부 즉시 픽업 훈련받은 사람이 병리 실험실에 있습니다. 종양, NANT는 (가능한 한 종양에서 가장 먼 거리를 촬영) 및 정상 조직의 조각은 정기적으로 (1) 내에 처리 - 인체 조직에 대한 표준 바이오 안전성 절차를 사용하여 BSL2 실험실에서 수술 절제의 3 시간. 프로토콜의 흐름도는도 1에 도시되어있다. </li><li> 모든 조직편 (정상 및 종양 NANT)을 달아 길이, 폭, 높이 (길이 x 폭 x 높이)를 측정한다. 이는 세포의 개체군에 대한 후속 정규화 중요한 단계, 추출 된 RNA 등이며 NOTE : 샘플 크기의 범위는 더 지방이 가능하다면 100 10,000 mm의 3입니다. </li><li> 조직이 실제로 종양의 일부임을 확인하기 위해 H &amp; E 염색 용 유리 슬라이드에 종양 조각을 각인. <ol><li> 종양 조각에 유리 현미경 슬라이드를 누르면 몇 초 동안 손가락으로 부드럽게 압력을 적용하여이 작업을 수행합니다. </li><li> 물에 세척 과정에서 다음 2 분 동안 이소프로판올과 슬라이드를 수정합니다. 마이어의 헤 마톡 실린 30 초 동안 조직을 Counterstain과. </li><li> 물 여섯 화장실에서 슬라이드를 씻으십시오. 15 초 동안 Phloxine B 2 % 얼룩. </li><li> 물 한 욕조와 이소프로판올 및 마무리의 네 화장실 의해 물 한 욕조에 씻으십시오. </li><li> 1 분 드레인에 대한 이소프로판올에 품어. 자일 렌의 두 화장실에 걸린. </li><li> 자일 렌을 기반으로 장착 매체를 마운트합니다. 종양 세포 수 (그림 2)에 대한 검사. 참고 : - 기질, 림프 또는 광고 주로 종양 세포가 각인 된 슬라이드에 충실ipose 세포는 거의 종양 세포 사이에 공간을두고, (그림 2) 남아. </li></ol></li><li> 멸균 사용 - 화학적으로, 무 혈청 조혈 세포 배지 1 ㎖를 함유하는 작은 배양 접시에서 조직 단편을 배치 작은 조각 (2 ㎜ × 2 ~ 1)로 그것을 실온에서 (이하 매체 라 함)와 주사위 메스. </li><li> 기계 dissociator의 C 관 (조직 조각 + 매체) 모두를 전송합니다. </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여 매체의 2 ㎖로 배양 접시와 메스를 씻어 C 관 (해리에 대한 매체의 볼륨 = 3 ㎖)이 추가. </li><li> 단일 세포 현탁액에 조직 조각을 균질화 C 튜브의 기계적 dissociator 프로그램 A.01 (가장 부드러운 프로그램)를 사용합니다. (한 사이클 = 25 초) 장치에서 C 튜브를 놓고 두 번 연속으로 프로그램을 실행합니다. 참고 :이 균질화 절차는 설립과 인간의 유방 조직, 다른 다치 대한 검증되었습니다또는 또는 조직 유형이 다른 프로그램을 사용해야 할 수도 있습니다 먼저 테스트해야합니다. </li><li> 장치에서 C 튜브를 제거하고 50 ML 튜브에 앉아 40 μm의 셀 스트레이너에 직접 균질을 가만히 따르다. 단계 1.6에서와 동일한 파스퇴르 피펫을 사용하여, 셀 스트레이너로 C 튜브에 남아있는 액체를 옮긴다. </li><li> 1 ㎖의 마이크로 피펫 팁을 사용하여 15 ML 튜브에 여과 된 액체를 전송합니다. 일시적으로 셀 스트레이너 및 50 ml의 튜브를 유지. </li><li> 배지 3 ㎖로 추가로 C 튜브를 헹구고 여전히 다시 50 ㎖ 튜브에 장착 셀 스트레이너로, 단계 1.6에서와 동일한 파스퇴르 피펫을 사용하여,이 전송. 부드럽게 연속적으로 용출액 오염을 막기 위해 폐기 된 깨끗한 파스퇴르 피펫 또는 1 ml의 팁을 사용하여 여과기 주위를 이동하여 50 ㎖ 튜브에 unhom​​ogenized 조직에 갇혀 잔류 액의 최대 양을 짜내. </li><li> 거꾸로 t의 셀 스트레이너를 배치그는 원래 C 튜브와 unhom​​ogenized 조직은 다시 C 튜브에 떨어질 수 있도록 매체의 3 ㎖ 씻어. </li><li> A.01 프로그램의 두 사이클 단계 1.7로 다시 균질화. </li><li> 50 ML 튜브에 앉아 셀 스트레이너를 통해이 두 번째 균질을 붓고, (단계 1.10에서와 같이) 3 ㎖ 매체를 다시 C 튜브를 씻어 다시 최대 압박 50 ML 튜브에 앉아 셀 스트레이너에 파스퇴르 피펫으로 전송 셀 스트레이너에 갇혀 잔류 결합 조직으로부터 액체의 양. </li><li> 이 시점에서, ~ 2.5 ml의 부피는 15ml의 튜브이고 ~ 50 ㎖ 튜브에서 9 ㎖의. </li></ol> 조직의 상층 액과 세포의 2. 분리 <ol><li> 실온에서 600 XG에서 15 분 동안 15 ㎖ 중의 균질 물 및 50 ㎖ 튜브를 원심 분리기. </li><li> 깨끗한 튜브에 15 ML 튜브에서 SN을 가만히 따르다 일시적으로 4 ℃에서 저장한다. 이 뜨는 = 차 종양, NANT 또는 정상 TIssue SN (최종 부피 2.5 ml)을 연속적으로 정화와 미래 분석 (아래 참조) -80 ° C에서 저장 이전에 분주합니다. </li><li> 50 ML 튜브에서 상층 액을 제거한다. </li><li> 부드럽게 1ml의 배지의 최종 부피 모두 세포 펠렛을 재현 탁. 요약하면, 첫째 부드럽게 (딱딱한 표면에 튜브를 눌러) 모두 튜브에 세포 펠렛을 휴식. 배지 500 μL와 50 ml의 느슨한 세포 펠렛을 재현 탁하고 제 펠렛을 재현 탁하는 15ml의 튜브에이 세포 현탁액을 전송. 세포의 최대 복구를위한 매체의 두 번째 500 μL 한 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 혈구를 사용하여 생존 세포의 수를 계산하고 : 작은 튜브로 전송 세포 현탁액 10 μL은 트리 판 블루 10 μL (희석 한 1)과 혼합한다. 주 :이 시점에서 세포 현탁액의 분획은 또한 셀 크기, 입도를 평가하는 유동 세포 계측법에 의해 분석 될 수 있고 더 PREC 모집단에 대한 마커의 수가 제한 원한다면이전에 광범위한 분석이나 실험에 균질의 상대적인 세포 분포의 이세 평가. 흐름에 의해 모든 분석은 세포 계측법 개체군의 정상화 CD45 라벨을 통합합니다. </li><li> 실온에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛. 종양, NANT, 또는 정상 조직에서 셀은 추가의 정제 또는 분석을위한 준비가되어 있습니다. 수술과 같은 날에 수행 할 때 이러한 추가 단계가 최상이다. 주 : 유세포 분석뿐만 즉시 1 초 동안 볼 텍싱, 세포 펠렛을 적혈구 세포 용해 완충액 0.4㎖를 첨가하고 방에서 10 분의 최소 배양하여 항체 라벨링 후 용해되어야 잔류 적혈구 세포 분류되지 분석하기 전에 온도 (빛으로부터 보호). </li></ol> 조직 뜨는 3. 명확화 <ol><li> 4 ℃에서 15 분 동안 15,000 XG에서 조직 SN와 1.5 ml의 튜브를 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 t 제거그는 만지거나 펠렛을 방해하지 않고 뜨는. 수와 원하는 분량의 볼륨에 따라 깨끗한 튜브 (또는 튜브)에 전송합니다. </li><li> 향후 사용을 위해 -80 ° C에서 뜨는을 저장합니다. </li></ol> 4. 환자의 혈액 <ol><li> 헤파린 튜브에 정맥 천자에 의한 제어 수술 전에 일 각 환자의 혈액 샘플을 수집합니다. 혈장과 버피 코트를 얻기 위해 브레이크 오프 20 ºC에서 10 분 동안 400 XG에 혈액을 원심 분리기. </li><li> 혈장을 분리하고 20 ºC에서 15 분 동안 10,000 XG에서 원심 분리하여이를 명확히. 향후 사용을 위해 -80 ° C에서 나누어지는 및 저장 플라즈마. 매체에서 버피 코트를 희석 </li><li> 즉시 분석 모집단 분리, DNA / RNA / 단백질 추출 또는 동결에 앞서 표준을 Ficoll-hypaque 구배 원심 분리를 이용하여 단핵 세포를 분리. </li></ol> 5. 유동 세포 계측법 <ol><li> 제조에 따라 라벨 세포빛으로부터 보호 4 ° C에서 R의 지침. 세포 펠렛을 세포 용해 완충액 0.4 mL를 넣은 후 표지 항체 조직편으로부터 세포 현탁액를 Lyse 적혈구. </li><li> 소용돌이는 즉시 1 초간 및 빛으로부터 보호 실온에서 10 분의 최소, 부화. 세척하지 않고 데이터 수집을위한 유동 세포 계수기에 표시된 세포를 전달합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncology+meets+immunology:+the+cancer-immunity+cycle.">Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle.</a> Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).</li><li>Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+'elite+hacker':+breast+tumors+exploit+the+normal+microenvironment+program+to+instruct+their+progression+and+biological+diversity.">An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity.</a> Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).</li><li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. 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A., Guasch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+orthotopic+transplantation+of+epithelial+tumors+in+single-cell+suspension.">Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension.</a> Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).</li><li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+cells+obtained+from+the+blood+but+not+from+the+tumor+can+suppress+T-cell+proliferation+in+patients+with+melanoma.">Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma.</a> Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).</li><li>Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+B+cell+characterization+in+blood,+lymph+nodes,+and+tumors+from+patients+with+malignancies.">Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies.</a> J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).</li><li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+follicular+helper+T+cell+infiltration+predicts+breast+cancer+survival.">CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival.</a> J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).</li><li>Buisseret, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+Infiltrating+Breast+Cancer+:+Density,+Composition+And+Organization.">Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).</li><li>Garaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+B+Cells+Infiltrating+Human+Breast+Cancer.">Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 18 (2014).</li><li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cxcl13-Producing+Follicular+Helper+T+Cells+In+Human+Breast+Cancer.">Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).</li><li>Yee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+endogenous+T+cells+for+adoptive+transfer.">The use of endogenous T cells for adoptive transfer.</a> Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).</li><li>Butler, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+of+human+CD8++T+cells+using+autologous+CD4++T+cell+help.">Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help.</a> PLoS One. 7 (1), 30229 (2012).</li><li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+artificial+antigen+presenting+cells+facilitate+direct+and+efficient+expansion+of+tumor+infiltrating+lymphocytes.">Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes.</a> J Transl Med. 9, 131 (2011).</li></ol>

The authors declare that no conflict of interest exists.

이 연구는 이후의 세포 분류, 추출, 동결 보존 및 / 또는 CD45 + 개체군의 표현형 분석을위한 소화 효소없이 정상 및 악성 유방 조직 균질의 빠른 준비를위한 최적화 된 방법을 설명합니다. 이 실험적인 접근의 목표는 밀접하게 자신의 생체 상태를 반영하고 수술실에서 신선한 조직의 최소한의 조작으로 정상 조직에 비교 TIL의 이미지를 생성하는 것입니다. 지금까지, 우리의 실험실&gt...

The tumor microenvironment is composed of various cell types with numerous studies showing they each play distinct and important roles in tumorigenesis1,2. These include, but are not limited to, infiltrating immune cells, stromal cells, endothelial cells and tumor cells3. Ex vivo studies of tumor infiltrating lymphocytes (TIL; CD45+ cells or leukocytes, which are predominantly lymphocytes in breast tumors) from fresh human tissue samples is made difficult by their low frequency, the small sample sizes often available for research and the potential for loss of viability during extraction. Because immune cells infiltrating tumors are usually present as passengers rather than permanent residents in general they are easier to release from the tissue matrix.
Dissociating tumor tissue while maintaining cellular integrity is technically challenging and has traditionally been performed using a combination of mechanical and enzymatic steps to prepare single cell suspensions4-8. This approach involves lengthy incubation periods and is associated with a significant reduction in cell viability as well as the loss of cell surface receptors by enzymatic cleavage. High quality flow cytometric studies characterizing TIL in the tumor microenvironment as well as clean purifications of CD45+ subpopulations by flow cytometry or antibody-coated beads are more difficult to achieve from enzyme-digested tumor tissue. In addition, the supernatant (SN) from the resulting tumor homogenate is not amenable to further analysis including quantification of secreted proteins (cytokines, chemokines, immunoglobulins or tumor antigens) or experimental treatment of normal cells, because of the potential for protein degradation in the enzymatic digests.
In our search for a method to prepare single cell homogenates from breast tissues [including tumor, non-adjacent non-tumor (NANT) and normal (from mammary reductions) breast tissues] without enzymatic digestion, we tested a variety of mechanical homogenization techniques. Homogenates prepared using a mechanical dissociator had increased cell viability (2-fold) and total cell recovery (2-fold) while preserving surface receptor expression. Enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells suggesting they were all released in the initial homogenate. Thus, this rapid and simple approach allows both qualitative and quantitative assessment of the CD45+ subpopulations present in various normal and malignant human tissues. An added advantage of this approach is that the SN from the initial homogenate (primary tissue SN) can be collected and stored for further analysis or experimentation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="980">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:272px;">Equipment</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:409px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">GentleMacs Dissociator&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:137px;">130-093-235</td>
			<td>BD Medimachine is somewhat equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Centrifuge 5810 R</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>or other standard table top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Centrifuge 5417 R</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>or other standard microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Esco Class II A2 Biosafety Cabinet</td>
			<td>ESCO global</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>or other standard BSL2 hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:163px;">Nikon eclipse TS100</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>or other microscope compatible for a hemacytometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">B&#252;rker Chamber</td>
			<td style="width:163px;">Marienfield&#160;</td>
			<td style="width:137px;">640210</td>
			<td>or other standard hemacytometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Navios Flow Cytometer</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>or other flow cytometer (8-10 color recommended)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:272px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:272px;">Materials</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">GentleMacs C-Tube</td>
			<td style="width:163px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:137px;">130-096-344</td>
			<td>BD Medimachine uses Filcon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Cell Culture Dish</td>
			<td style="width:163px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:137px;">72,710</td>
			<td>or other non-pyrogenic plasticware&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Disposable Scalpel</td>
			<td style="width:163px;">Swann-Morton</td>
			<td style="width:137px;">0510</td>
			<td>or standard single use sterile scalpel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">BD Cell Strainer 40&#181;m</td>
			<td style="width:163px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">734-0002</td>
			<td>or other non-pyrogenic plasticware&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">BD Falcon Tube 50mL</td>
			<td style="width:163px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">352070</td>
			<td>or other non-pyrogenic plasticware&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">BD Falcon Tube 15mL</td>
			<td style="width:163px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">352097</td>
			<td>or other non-pyrogenic plasticware&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">BD FACS Tube 5mL</td>
			<td style="width:163px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">352008</td>
			<td>or other non-pyrogenic plasticware&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Sterile Pasteur Pipette 5 mL&#160;</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">612-1685</td>
			<td>or other non-pyrogenic plasticware&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Microfuge Tube 1.5 mL</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">7805-00</td>
			<td>or other non-pyrogenic plasticware&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:272px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:272px;">Reagents</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">X-Vivo 20</td>
			<td style="width:163px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">BE04-448Q</td>
			<td>serum-free medium recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:163px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">BE17-516F</td>
			<td>standard physiological PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Trypan blue&#160;</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">17942E</td>
			<td>or other vital stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">VersaLyse</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">A09777</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fixable viability Dye eFluor 780&#160;</td>
			<td style="width:163px;">eBioscience</td>
			<td style="width:137px;">65-0865-14</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">anti-CD3 FITC</td>
			<td style="width:163px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:137px;">345763</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">anti-CD3 Vio Blue</td>
			<td style="width:163px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:137px;">130-094-363</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">anti-CD4 PE</td>
			<td style="width:163px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:137px;">345769</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">anti-CD4 APC</td>
			<td style="width:163px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:137px;">130-091-232</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">anti-CD8 ECD</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">737659</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">anti-CD8 PerCP</td>
			<td style="width:163px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:137px;">345774</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">anti-CD19 APC-Vio770</td>
			<td style="width:163px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:137px;">130-096-643</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">anti-CD45 VioGreen</td>
			<td style="width:163px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:137px;">130-096-906</td>
			<td>for flow cytometry experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and rapid protocol to non-enzymatically dissociate fresh human tissues for the analysis of infiltrating lymphocytes

선천성 및 후천성 면역 반응 모두에서 종양 탈출 특징으로 면역 시스템을 무력화하는 악성 세포의 능력은 지금 암의 중요한 특징으로 받아 들여진다. 유방암에 대한 우리의 연구는 종양 침윤 림프구가 종양의 진행과 환자 결과에서 재생하는 적극적인 역할에 초점을 맞추고있다. 이 목표를 향해, ​​우리는 그들의 원래 상태로 그들을 근접 평가하기위한 노력의 일환으로 정상 및 비정상 조직에서 그대로 림프 세포의 신속한 분리를위한 방법론을 개발했다. 표면 수용체 발현 비교하는 효소 - 소화 된 조직을 유지하면서 기계적 dissociator 쇼 모두 증가 된 생존율 및 세포를 회수하여 제조 균질. 또한, 나머지 불용성 물질의 소화 효소는 기본 균질의 양적, 질적 측정 가능성이 진정으로 조직 fragm에 침투 부분 집단을 반영하는 것을 나타내는 추가 CD45 + 세포를 복구하지 않았다천만에. 이러한 균질 림프 세포는 쉽게 면역 (표현형, 확산 등) 또는 분자 (DNA, RNA 및 / 또는 단백질)을 이용하여 특성화 할 수 접근한다. CD45 + 세포는 모집단 정화 시험 관내 팽창 또는 냉동 보관을 위해 사용할 수있다. 이 접근법의 또 다른 장점은 균질 물에서 뜨는 기본 조직과 정상 조직에서 악성 사이토 카인, 케모카인, 면역 글로불린 및 본 항원을 특성화하고 비교하기 위해 사용될 수 있다는 점이다. 이 프로토콜 기능을 매우 잘 인간 유방 조직 및 정상 및 비정상 다양한 조직에 적용 할 수 있어야한다.

시판 티슈 해리 용액 또는 콜라게나 제의 다양한 실험 혼합물의 DNase 및 / 또는 히알루로니다 제 억제제 중 하나와 조직 절편의 소화 효소는 세포 표면 수용체의 다양한 절단. 최초 유방 종양 침윤 CD4 + T 세포에 대한 우리의 연구가 집중, 신속 인해 소화 효소 표준 프로토콜을 사용하여 4-8 표면 CD4 수용체의 절단에 중요한 기술적 문제를 제시 하였다. 우리는 높은 생존 성 림...

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A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.9K 조회수.  Université Libre de Bruxelles. This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.