NOTA: Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional Animal Vida útil Cuidado y Uso y todos los animales y los procedimientos de acuerdo con la Guía Nacional Research Council para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 10. 1. Fabricación Globo y Presión ventricular izquierda Monitoreo del Circuito <ol><li> Construya globos LV según Miller et al. 11 En un vaso de precipitados con una barra de agitación, mezcla 9,5 ml de agua destilada, 14,2 ml de jarabe de maíz de luz y 33,8 g de sacarosa, y el calor en un plato caliente, mezclar hasta que se disuelva el azúcar . Continuar solución de calefacción hasta que alcanza aproximadamente 150 ºC. NOTA: Muchos métodos existen para construir globos LV incluyendo modificación de consejos de condones y se aferran construcción de película 9,12. Nos encontramos con el método anterior sea relativamente fácil de construir globos sin fugas, sin embargo una ventaja de globos papel film incluye la caracterización previa para frequen apropiadarelaciones CY-9 de respuesta. </li><li> Romper hebras de espagueti secos en trozos de unos 5 cm de largo y sumergir un lado de cada pieza alrededor de 1 cm de profundidad en la solución de azúcar y poco a poco eliminar. </li><li> Coloque el extremo seco de la banda de pasta en un bloque de espuma de poliestireno y suspender por lo que la mezcla de azúcar gotea y forma un molde de forma de lágrima. Deja O / N en un desecador por lo que el molde se endurece. </li><li> Al día siguiente, sumergir los moldes en gel de dispersión de silicona. Coloque hebras de pasta de nuevo en bloque de espuma de poliestireno y colocar en horno aa 37 ºC durante 2 horas o hasta que se seque. Repita este paso una vez más que se aplican dos capas de silicona. </li><li> Una vez seco, el lugar en el agua durante varias horas para ayudar en la eliminación del globo del molde. Globos en tienda a la solución de azida de sodio 0,02%. </li><li> Utilice una extracción de sangre 23 G configurar para producir una cánula globo personalizado cortando una aguja para crear una punta roma y la colocación de las muescas en la aguja. </li><li> Conecte el tubo a una presión transproductor y enjuague con agua, manteniendo la tubería y cánula completamente sumergidos para evitar que entre aire en el sistema. Coloque un globo que ha sido llenado con agua sobre la cánula y el uso de suturas de seda 2-0 para atar sobre cánula. Globos de prueba por la capacidad para mantener la presión (~ 100 mmHg durante al menos 1 hora) </li></ol> 2. Preparación del sistema de perfusión aislada del corazón <ol><li> Inicialmente, lavar y calentar el sistema. Encienda un baño de agua tibia circulador 37 ºC que se ha conectado al aparato Langendorff, y rellenar depósito de regulación con agua destilada. Conecte un nuevo filtro de fibra de vidrio para tubos que desembocan en el aparato y encienda la bomba para eliminar el sistema. Durante el tiempo de preparación, controlar la temperatura del agua expulsada desde el bloque de Langendorff utilizando una sonda de temperatura, para asegurar que baño de agua se ajusta con precisión. También, encender una bomba de circulación refrigerado y se puso a 20 ºC que se utilizará durante la parada cardiopléjica del corazón. </li><li> YOn Mientras tanto preparar las siguientes soluciones. Preparar 1 l de solución de cardioplejía (NaCl 110 mM, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl 2, 10 mM NaHCO3) y el filtro. Además, preparar 2 L de KHB (NaCl 118 mM, 4,8 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,7 mM MgSO 4, 2 mM Na-piruvato, dextrosa 6 mM, 24,9 mM NaHCO 3 (pre-aireada con CO 2) , 1,4 mM CaCl 2 (añadido pasado). Una vez disuelto, eliminar precipitados por filtración en un matraz de vidrio utilizando un embudo sinterizado 5 micras. Coloque un poco en un plato pequeño en hielo para ser utilizado durante la cirugía y el aislamiento. </li><li> Oxigenar el líquido de perfusión (KHB) con 95% de O2 / 5% de CO 2 durante al menos 30 min antes de su uso. Sistema Perfuse Langendorff con KaJaB para eliminar cualquier resto de agua del sistema y tampón de reserva. Para los ratones, ajustar la velocidad inicial de la bomba a ~ 2,0 ml / min. Coloca 2-0 y 4-0 suturas de seda cerca de cánula de perfusión. Haga funcionar la bomba hasta que el tubo y el aparato se llenan ingenioh perfundido y garantizar la strup burbuja se llena de líquido de perfusión. NOTA: Para largos períodos de perfusión y función estable se recomienda instalar un filtro de fibra de vidrio en línea (~ 1 m) en el circuito de perfusión, a percibir los precipitados que podrían formar coágulos en el corazón </li></ol> 3. Ratón Cirugía 3.1) Ratón Anestesia y Manejo <ol><li> Prepare la jeringa con la dosis de anestesia de 80 mg / kg de ketamina y 5 mg / ml mezcla de xilazina, y añadir estéril al 0,9% de solución salina para que aparezca volumen a 0,2 ml. Inyectar heparina IP (50 l de solución de 1000 U / ml). </li><li> Coloca el ratón de nuevo en contenedor de transporte (~ 10 a 20 min) y esperar a que se pierda la conciencia como la heparina en vigor. Periódicamente hacer una pizca dedo del pie para controlar el dolor reflejo. </li></ol> 3.2) Remover el Corazón <ol><li> Una vez que el ratón es totalmente inconsciente y no responde a pizca dedo del pie, asegurar a una mesa de operaciones apropiado usando alfileres o 25 G<html> puntas de jeringa a través de las extremidades. Realizar una toracotomía para exponer el corazón. Corte un pequeño agujero justo debajo del esternón y extender el corte a los lados del ratón evitando el diafragma. </li><li> Cortar rápidamente el diafragma y luego se corta rápidamente por los lados de la caja torácica. Voltear hacia atrás de la caja torácica como una concha de almeja para exponer la cavidad torácica. Sujete con suavidad el corazón, coloque unas tijeras debajo y quitar el corazón. NOTA: Es esencial para eliminar rápidamente el corazón una vez que se expone en la cavidad torácica y los pulmones no son funcionales. </li></ol> 3.3) Limpiar el Corazón <ol><li> Coloque el corazón en el plato que contiene hielo KaJaB frío y recortar los trozos grandes de tejido pulmonar adjuntos. Utilice pinzas para recoger el corazón y localizar la aorta. Apriete suavemente el corazón y buscar sangre que aparece, ya que este debe ser el extremo abierto de la aorta. Utilice unas pinzas de punta fina para mantener el corazón por el extremo abierto de la aorta. </li></ol>e &quot;&gt; 4. Montaje del Corazón, A partir de perfusión, y colocar el globo 4.1) Montaje y canulación del Corazón <ol><li> Antes de transportar el corazón al aparato Langendorff, encender la bomba de asegurar que la presión de perfusión es baja (~ 20 mmHg). Mantenga el corazón por la aorta justo debajo de la cánula. El uso de otro conjunto de pinzas de punta fina, abra cuidadosamente la aorta y deslice corazón para arriba sobre la cánula. Mantenerlo en su lugar con un juego de pinzas y luego usar un clip de bordes suaves para asegurar temporalmente a la cánula. NOTA: montaje rápidamente el corazón a la cánula de perfusión es crítico para una buena preparación. Con la experiencia, los procedimientos de apertura de la cavidad torácica, hasta el montaje del corazón deben tomar entre 1 y 2 minutos. </li><li> Ate e iniciar la perfusión de la siguiente manera, utilizando 4-0 sutura de seda aorta seguro a la cánula directamente debajo del clip. Asegúrese de que el empate es también alrededor de la cánula aórtica de metal, por lo que la aorta no quede amarrado al apretarel nudo. Una vez que un empate se coloca con firmeza, quite el clip. </li><li> Use suturas de seda adicionales para sujetar la aorta con seguridad a la cánula asegurándose de atar abajo las ramas de los vasos que pueden estar saliendo de la aorta. Estos a menudo se pueden observar por fugas de perfusión o disparar hacia fuera de la aorta. NOTA: Durante las etapas iniciales de la perfusión de la sangre debe ser lavado con el corazón y el corazón entero debería aparecer un color rosa suave. Decoloraciones oscuras que no se lavan a cabo indican áreas isquémicas probablemente debido a la embolia de aire o coágulos y el corazón no debe ser utilizado. </li></ol> 4.2) El establecimiento de Medición de perfusión y LVP <ol><li> Poco a poco aumentar la presión de perfusión y aumentar la velocidad de la bomba hasta que la presión de perfusión llega a 70 mmHg. NOTA: Las presiones de perfusión estándar para la perfusión del ratón pueden ser 70 a 90 mmHg, pero debe mantenerse constante de animal a animal dentro de un experimento. </li><li> Limpiar el tejido restante (pulmón, tiroides etc.) Que todavía puede estar unido al corazón. Utilice unas tijeras para cortar la aurícula izquierda con el fin de crear una abertura en el ventrículo izquierdo. </li><li> Coloque el globo en el soporte y desinflar. Coloque la cánula globo cerca de la cánula aórtica, directamente sobre la abertura en el ventrículo izquierdo. Inserte cuidadosamente el globo a la baja en el ventrículo izquierdo mientras mantiene el corazón en su lugar para la aorta no se rompa. </li><li> Una vez que está en su lugar lentamente comenzar a inflar el globo hasta que la PTDVI alcanza ~ 8 mmHg. Coloque la sonda de temperatura contra la parte inferior del corazón por lo que mide la temperatura del efluente. </li></ol> 4.3) Medición Basal <ol><li> Sellar el corazón en una cámara de perfusión con camisa de agua. Durante este tiempo perfundir continuamente el corazón con KHB, y asegúrese de que la temperatura sigue aumentando. Controlar la temperatura y ajustar el baño de agua en consecuencia hasta que alcanza aproximadamente ~ 37 ºC. NOTA: Control temperatUre en las fases iniciales de la perfusión es fundamental como flujos coronarios y, posteriormente, la temperatura puede variar de corazón a corazón. Temperatura del perfundido efluente se monitorizó para la temperatura deseada del miocardio a través de una sonda de temperatura colocado en el ápice del corazón. Además, en comparación con otros protocolos de perfusión Langendorff, el corazón no está sumergido en el CP o KaJaB durante la perfusión o arresto, esto se hace principalmente para ajustar rápidamente la temperatura, así como proporcionar la entrega CP eficiente sin difusión. </li><li> Comenzar a grabar de forma continua la medición funcional utilizando un sistema de adquisición de datos conectado a los sensores apropiados, incluyendo la presión de perfusión, la presión ventricular izquierda (transductor de presión conectado a LVP globo), la temperatura y los parámetros electrofisiológicos (EKG, MAP si está equipado) (apego será de acuerdo a los fabricantes y específica a los sensores individuales y sistema de adquisición de datos). Una vez que el efluente KHB llega a ~ 37 ºC durante al menos 15<html> min y parámetros funcionales cardíacos son estables, tenga en cuenta el momento de las mediciones de referencia. NOTA: Los criterios de inclusión / exclusión se aplican a cada corazón. Un LVDP de &lt;60 mmHg al inicio del estudio indica un corazón que debe ser removido de su análisis. Además, el flujo coronario&gt; 4,5 ml / min, o incapacidad para mantener la presión de perfusión al inicio del estudio probablemente indica una fuga o aorta desgarrado. También cualquier corazones que tienen áreas claras isquémicos que pueden ser confirmados visualmente (es decir, coágulos) o reducciones de isquemia asociada exhiben en la función cardiaca (es decir, el aumento de PDFVI, extremadamente arrítmico) se eliminan del análisis. </li><li> Medir el flujo coronario a través de la colección del efluente coronario en un cilindro graduado de 1 min. Cierre de la cámara y permitir la temperatura y función para volver a los valores basales. Alternativamente medir el flujo coronario de forma continua en la línea de perfusión a través de una sonda de flujo colocado después del circuito de descarga de presión. </li></ol>&quot;&gt; 5. Iniciación cardioplégico Arresto <ol><li> Colocar 100 ml de tampón de cardioplegia fría en otro depósito y. transferir el depósito cánula KHB al depósito de cardioplegia. </li><li> Separe la carcasa con camisa de agua y el circuito de calentamiento de la perfusión del baño de agua caliente y conectarse a la máquina refrigerante utilizando tubería desconexiones rápidas. Utilice calefacción y refrigeración circuladores independientes para permitir cambios rápidos de temperatura del corazón y perfusión. </li><li> Siga la burbuja de aire que consigue introduce en el tubo durante el interruptor, y una vez que alcanza cerca del corazón aislado iniciar la temporización para cardioplegia. Entregar cardioplejía durante 2 min. Después de la dosis inicial parar la bomba. Asegúrese de detener el corazón en diástole y estar cerca de la temperatura CP deseada. NOTA: Una trampa de burbujas suficiente es necesario para evitar embolias de aire en el corazón. Alternativamente, un sistema de suministro para ambos depósitos conmutadas por una llave de paso puede ser construido fácilmente, sin embargo encontramos seguiring la pequeña burbuja de aire que se introduce cuando el intercambio de la cánula entre los depósitos, un método fácil de la entrega CP momento dado potencialmente diferentes velocidades de la bomba entre los experimentos (es decir, debido a ratón / rata, la presión de perfusión, la resistencia del filtro, etc.) </li><li> Mantener el corazón en cardioplejía durante 2 horas a ~ 20 ºC. Cada media hora durante la CP encender la bomba de nuevo durante 1 minuto por lo que se administra otra dosis. NOTA: dosis intermitentes de CP cada 30 min resultados en el deterioro funcional del corazón sin necrosis del tejido. Los períodos más largos entre las dosis de CP (es decir,&gt; 45 min) pueden dar lugar a la necrosis y la contractura isquémica y sería más apropiado para un modelo de lesión necrótica asociada a la isquemia sin protección. </li></ol> 6. La reperfusión <ol><li> Al final de CP, transferir la cánula depósito de vuelta a la oxigenada KHB. Conectar los circuitos de control de temperatura en el termostato de calefacción y encienda la bombaa comenzar la reperfusión. En este punto el cardioplejia hace desaparecer, observar el aumento de la temperatura y el corazón comienza a latir de nuevo después de 2-4 min de reperfusión. Cuando se inicia el corazón el latido del corazón es lento ya menudo arrítmico. NOTA: Por lo general, no es un gran aumento de la LVP diastólica (es decir, aumento ≤10 mmHg), que suele ser característico en modelos de isquemia puros. Las arritmias pueden persistir hasta bien entrada la reperfusión y en ocasiones tendrán el corazón para ser desfibrilación. Esto se puede lograr con el uso de un conjunto estimulador a voltajes más altos (~ 10-50 V) y electrodos colocados en la base y el ápice del corazón. </li><li> Permitir que el corazón reperfundir durante 30 min, y durante este período de tiempo tomar mediciones del flujo coronario según sea necesario. Medir el flujo coronario por recoger el efluente con un cilindro graduado durante 30-60 seg. </li></ol> 7. Recolección de Tejidos <ol><li> Desinflar el globo y retirarlo desde el ventrículo izquierdo. Tome el corazón de lacánula y pesarlo. En los experimentos iniciales, al menos una rebanada transversal del corazón debe ser tomado y TTC tiñe para evaluar necrosis para asegurar que el corazón está libre de cualquier lesión necrótica. </li><li> Recoger las rebanadas del corazón para los estudios de microscopía, pesos húmedo / seco, etc. El resto o todo el corazón debe congelarse rápidamente colocando en nitrógeno líquido. Tienda corazones congelados en un congelador de -80 ºC. NOTA: Para la medición de compuestos de fosfato de alta energía (es decir, el ATP, fosfato de creatina), los corazones se debe congelar inmediatamente. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Los métodos de detalles de protocolo precedentes para evaluar el aturdimiento miocárdico secundaria a isquemia global asociado con parada cardiopléjica. En nuestras manos este protocolo produce una reducción aproximada del ~ 40% de la función cardíaca (LVDP, +/- dP / dt) con cambios mínimos en la frecuencia cardíaca en el punto de tiempo posterior a la reperfusión 30 min. A medida que el corazón está reperfunde y recalentado todos los parámetros de la función cardíaca se reducen en los puntos iniciales de ...

Aturdimiento miocárdico se define como reversible reducción de la actividad contráctil a pesar de la restauración del flujo sanguíneo adecuado después de un breve período de isquemia o períodos prolongados de insultos isquémicos con 1,2,3,4,5 cardioprotección. El método presentado se utiliza específicamente para modelar insultos isquémicos clínicamente relevantes que pueden resultar en alteraciones reversibles en la función contráctil (es decir, los insultos isquémicos asociados con la cirugía cardíaca utilizando parada cardiopléjica, breves períodos de isquemia, angina de pecho, etc.). En contraste con los estudios de isquemia grave (infarto de miocardio, necrosis) fue desarrollado este protocolo para evaluar la recuperación funcional del miocardio y la cardioprotección sin lesión de los tejidos, remodelación, y la muerte celular. La mayoría del trabajo se analiza un protocolo de parada cardiopléjica estándar con elementos similares a una cirugía cardíaca utilizando la hipotermia y la entrega cardioplejía intermitente. Prot miocardioreflexión durante la mayoría de las cirugías cardíacas se basa en cardioplegia y bypass cardiopulmonar. Aunque cardioplejía soluciones y estrategias (CP) varían ampliamente (sangre, cristaloide, frío, caliente etc.) los elementos más comunes son 1) la hiperpotasemia y / u otras estrategias para detener el corazón en diástole, limitando así la utilización de energía resultante de la contracción miocárdica, y 2) la hipotermia para ralentizar el metabolismo y ayudar a mantener la ATP y otras reservas de energía mientras arrestado. Soluciones de cardioplejía actuales proporcionan protección al corazón contra los insultos isquémicos que de otro modo resultarían letales. Sin embargo, las estrategias cardioprotectoras durante insultos isquémicos quirúrgicos no son perfectos, y la lesión isquémica leve resultante puede dar lugar a una disfunción contráctil cardiaca reversible pesar de un flujo sanguíneo adecuado (aturdimiento miocárdico), acidosis, daños cardiomiocitos, y los efectos vasculares incluyendo la perfusión coronaria reducida y el vasoespasmo. Este protocolo se diferenciaa partir de modelos de isquemia del corazón aislado estándar evaluación de infarto de miocardio e isquemia severa en que se evalúa insultos isquémicos más suaves que puede resultar en la función cardiaca deteriorada siguiente breve isquemia o insultos isquémicos asociados con la parada cardiopléjica. (Para una revisión de técnicas de perfusión Langendorff y I / R en ver 6-8). Para obtener directrices generales y un análisis exhaustivo de los parámetros experimentales asociadas con aislados de ratones corazones perfundidos ver Sutherland e t al. 2003 9 La técnica que aquí se presenta detalla el equipamiento necesario, reactivos, pasos, estrategias y consejos para inducir de manera fiable impresionante en los corazones de ratón. Pequeñas modificaciones son necesarias para aplicar la técnica a ratas. Brevemente corazones aislados de ratones se Langendorff perfundidos durante aproximadamente 30 minutos con tampón fisiológico Krebs-Henseleit (KHB), seguidos por el frío paro cardiaco protegida a través de la entrega de una hipotermia hipercaliémicasolución de cardioplejía ic. Tras la detención, la recuperación funcional cardíaca se controla durante el recalentamiento y la reperfusión del corazón con KHB. Los cambios en el grado de recuperación de la función contráctil cardiaca pueden ser evaluados para evaluar agentes cardioprotectores y diferentes estrategias de cardioprotección.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Cardioplegia Solution (St Thomas II)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >Symbol / Concentrations (mM)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>NaCl; 110</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>KCl; 16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium Chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>CaCL2; 1.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>MgCL2; 16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Bicarbonate</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>NaHCO3; 10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Krebs-Heinslet Buffer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>NaCl; 118</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>KCl; 4.8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium Sulfate</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>MgSO4; 1.7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Bicarbonate</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>NaHCO3; 24.9</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Phosphate (monobasic)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>KH2PO4; 1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium Chloride</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>CaCL2; 1.4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Pyruvate</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Na pyruvate; 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>C6H12O6; 6</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Balloon reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corn Syrup</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spaghetti</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicon Dispersion Gel</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >styrofoam block</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >lab oven/incubator ( 50C)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Langendorff Perfusion equipment</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heated water circulator</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cooling water circulator</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Perfusion pump capable of 2-30 ml/min</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inline perfusion filters - 1 um glass fiber</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Small graduated cylinder (~10 mL)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >perfusion resevoir (1L)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cardioplegia resevoir (~200 mL)</td>
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			<td></td>
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		<tr >
			<td >gas bubbler</td>
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		<tr >
			<td >95/5 O2/CO2 mix</td>
			<td ></td>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical tools and reagents</td>
			<td ></td>
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		<tr >
			<td >Metzenbaum and Potz surgical scissors</td>
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		<tr >
			<td >two Dumont size 5 forceps</td>
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			<td >ketamine</td>
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		</tr>
		<tr >
			<td >xylazine</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >heparin</td>
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		</tr>
		<tr >
			<td >small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silk 2-0 and 4-0 sutures</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest

El siguiente protocolo es de utilidad para evaluar la función cardiaca deteriorada o elevando insultos isquémicos moderados miocardio. La técnica es útil para el modelado de la lesión isquémica asociada con numerosas fenómeno clínicamente relevante, incluyendo cirugía cardíaca con parada cardiopléjica y bypass cardiopulmonar, la cirugía sin CEC, trasplante, angina, isquemia breve, etc. El protocolo presenta un método general para modelar hipotermia arresto cardioplégica hipercaliémica y reperfusión en los corazones de roedores que se centran en la medición de la función contráctil del miocardio. En resumen, un corazón de ratón se perfunde en el modo de Langendorff, equipado con un globo intraventricular, y se registran los parámetros funcionales cardíacos iniciales. Tras la estabilización, el corazón se somete a breves infusión de una solución de cardioplejía hipotermia cardioprotector para iniciar arresto diastólica. Cardioplegia se entrega de forma intermitente durante 2 horas. El corazón está entonces reperfundido y Warmed para las temperaturas y la recuperación de la función miocárdica normotérmicos se supervisa. El uso de este protocolo los resultados en función contráctil cardiaca deprimida confiable libres de daño en el tejido miocárdico bruto en roedores.

La Figura 1 presenta los resultados típicos de un experimento del ratón. LVP (línea roja), dP / dt (línea verde), y la temperatura (línea morada) se registraron continusouly sobre ~ 3 horas. Las letras indican a - medida de referencia, b, c, d, e - la entrega de la solución de cardioplejía, f - inicio de la reperfusión, g, h, i, j - medición de flujo cornary durante la reperfusión. Nota, LVDP deprimido y dP / dt en la reperfusión en comparación con la línea base. Figura 1B ...

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Murine Isolated Heart Model of Myocardial Stunning Associated with Cardioplegic Arrest

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

Murino Aislado Modelo Corazón de aturdimiento miocárdico asociado a paro cardioplégico

The following protocol is of use to evaluate impaired cardiac function or myocardial stunning following moderate ischemic insults. The technique is useful ...

murine-isolated-heart-model-myocardial-stunning-associated-with

Research

JoVE Journal

Medicine

11.6K vistas.  Brown University. The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

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A Murine Closed-chest Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ischemia and reperfusion. Immune response includes cytokine expression and release or secretion of endogenous ligands of innate immune receptors. Activation of innate immunity can potentially modulate infarct size. We have modified an existing murine closed-chest model using hanging weights which could be useful for studying myocardial pre- and postconditioning and the role of innate immunity in myocardial ischemia and reperfusion. This model allows animals to recover from surgical trauma before onset of myocardial ischemia.
Volatile anesthetics have been intensely studied and their preconditioning effect for the ischemic heart is well known. However, this protective effect precludes its use in open chest models of coronary artery ligation. Thus, another advantage could be the use of the well controllable volatile anesthetics for instrumentation in a chronic closed-chest model, since their preconditioning effect lasts up to 72 hours. Chronic heart diseases with intermittent ischemia and multiple hit models are other possible applications of this model.
For the chronic closed-chest model, intubated and ventilated mice undergo a lateral blunt thoracotomy via the 4th intercostal space. Following identification of the left anterior descending a ligature is passed underneath the vessel and both suture ends are threaded through an occluder. Then, both suture ends are passed through the chest wall, knotted to form a loop and left in the subcutaneous tissue. After chest closure and recovery for 5 days, mice are anesthetized again, chest skin is reopened and hanging weights are hooked up to the loop under ECG control.
At the end of the ischemia/reperfusion protocol, hearts can be stained with TTC for infarct size assessment or undergo perfusion fixation to allow morphometric studies in addition to histology and immunohistochemistry.

Surgical trauma induces an inflammatory response. Cytokines and endogenous ligands are known to modulate myocardial infarct size following ischemia and reperfusion. We present a modified closed-chest model of murine ischemia and reperfusion using hanging weights to minimize effects of thoracotomy.

Un murino tórax cerrado modelo de isquemia y reperfusión miocárdica

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ...

Investigación

Medicina

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Modelo murino de Curación de Heridas

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Un modelo murino de isquemia-reperfusión miocárdica lesión a través de la ligadura de la arteria descendente anterior

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other biologicals that enhance angio- or vasculogenesis into the infarct border zone (IBZ), tissue perfusion is improved, and the myocardium can be protected from further damage. For maximum therapeutic effect, it is hypothesized that the regenerative substance is best delivered to the IBZ. This requires accurate injections and has led to the development of new injection techniques. To validate these new techniques, we have designed a validation protocol based on myocardial tissue analysis. This protocol includes whole-heart myocardial tissue processing that enables detailed two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) analysis of the cardiac anatomy and intramyocardial injections. In a pig, myocardial infarction was created by a 90-min occlusion of the left anterior descending coronary artery. Four weeks later, a mixture of a hydrogel with superparamagnetic iron oxide particles (SPIOs) and fluorescent beads was injected in the IBZ using a minimally-invasive endocardial approach. 1 h after the injection procedure, the pig was euthanized, and the heart was excised and embedded in agarose (agar). After the solidification of the agar, magnetic resonance imaging (MRI), slicing of the heart, and fluorescence imaging were performed. After image post-processing, 3D analysis was performed to assess the IBZ targeting accuracy. This protocol provides a structured and reproducible method for the assessment of the targeting accuracy of intramyocardial injections into the IBZ. The protocol can be easily used when the processing of scar tissue and/or validation of the injection accuracy of the whole heart is desired.

This protocol describes a novel method for the 3D comparison of whole-heart myocardial tissue with MRI. This is designed for the accurate assessment of intramyocardial injections in the infarct border zone of a chronic porcine model of myocardial infarction.

El análisis del tejido de miocardio entero en 3D del corazón

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

The Inverted Heart Model for Interstitial Transudate Collection from the Isolated Rat Heart

The present protocol describes a unique approach that enables the collection of cardiac transudate (CT) from the isolated, saline-perfused rat heart. After isolation and retrograde perfusion of the heart according to the Langendorff technique, the heart is inverted into an upside-down position and is mechanically stabilized by a balloon catheter inserted into the left ventricle. Then, a thin latex cap &#8211; previously cast to match the average size of the rat heart &#8211; is placed over the epicardial surface. The outlet of the latex cap is connected to silicon tubing, with the distal opening 10 cm below the base level of the heart, creating slight suction. CT continuously produced on the epicardial surface is collected in ice-cooled vials for further analysis. The rate of CT formation ranged from 17 to 147 &#181;L/min (n = 14) in control and infarcted hearts, which represents 0.1-1% of the coronary venous effluent perfusate. Proteomic analysis and high performance liquid chromatography (HPLC) revealed that the collected CT contains a wide spectrum of proteins and purinergic metabolites.

This protocol describes a method to collect cardiac interstitial fluid from the isolated, perfused rat heart. To physically separate interstitial transudate from coronary venous effluent perfusate, the Langendorff perfused heart is inverted, and the transudate (interstitial fluid) formed on the cardiac surface is collected using a soft latex cap.

El Modelo Invertido del Corazón para la Colección de Transudado Intersticial del Corazón de la Rata Aislada

The present protocol describes a unique approach that enables the collection of cardiac transudate (CT) from the isolated, saline-perfused rat heart. ...

Murine Oropharyngeal Aspiration Model of Ventilator-associated and Hospital-acquired Bacterial Pneumonia

Murine infection models are critical for understanding disease pathogenesis and testing the efficacy of novel therapeutics designed to combat causative pathogens. Infectious pneumonia is among the most common infections presented by patients in the clinic and thus warrants an appropriate in vivo model. Typical pneumonia models use intranasal inoculation, which deposits excessive organisms outside the lung, causing off-target complications and symptoms, such as sinusitis, gastritis, enteritis, physical trauma, or microparticle misting to mimic aerosol spread more typical of viral, tuberculous, or fungal pneumonia. These models do not accurately reflect the pathogenesis of typical community- or healthcare-acquired bacterial pneumonia. In contrast, this murine model of oropharyngeal aspiration pneumonia mimics the droplet route in healthcare-acquired pneumonia. Inoculating 50 &#181;L of the bacteria suspension into the oropharynx of anesthetized mice causes reflexive aspiration, which results in pneumonia. With this model, one can examine the pathogenesis of pneumonia-causing pathogens and new treatments to combat these diseases.

Infectious pneumonia is among the most common infections in human. An appropriate in vivo model is critical for understanding disease pathogenesis and testing the efficacy of novel therapeutics. With this murine oropharyngeal aspiration pneumonia model, one can examine the pathogenesis and new treatments against these deadly infections.

Modelo murino de aspiración orofaríngea de neumonía bacteriana asociada a la ventilación y adquirida en el Hospital

Murine infection models are critical for understanding disease pathogenesis and testing the efficacy of novel therapeutics designed to combat causative ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Modelo de infarto de miocardio murino usando ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

Un modelo de criolesiones para estudiar el infarto de miocardio en el ratón

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

Establishing a Swine Model of Post-myocardial Infarction Heart Failure for Stem Cell Treatment

Although advances have been achieved in the treatment of heart failure (HF) following myocardial infarction (MI), HF following MI remains one of the major causes of mortality and morbidity around the world. Cell-based therapies for cardiac repair and improvement of left ventricular function after MI have attracted considerable attention. Accordingly, the safety and efficacy of these cell transplantations should be tested in a preclinical large animal model of HF prior to clinical use. Pigs are widely used for cardiovascular disease research due to their similarity to humans in terms of heart size and coronary anatomy. Therefore, we sought to present an effective protocol for the establishment of a porcine chronic HF model using closed-chest coronary balloon occlusion of the left circumflex artery (LCX), followed by rapid ventricular pacing induced with pacemaker implantation. Eight weeks later, the stem cells were administered by intramyocardial injection in the peri-infarct area. Then the infarct size, cell survival, and left ventricular function (including echocardiography, hemodynamic parameters, and electrophysiology) were evaluated. This study helps establish a stable preclinical large animal HF model for stem cell treatment.

We sought to establish a swine model of heart failure induced by left circumflex artery blockage and rapid pacing to test the effect and safety of intramyocardial administration of stem cells for cell-based therapies.

Establecer un modelo porcino de infarto de infarto post-miocardio insuficiencia cardíaca para el tratamiento de células madre

Although advances have been achieved in the treatment of heart failure (HF) following myocardial infarction (MI), HF following MI remains one of the major ...

Myocardial Infarction by Percutaneous Embolization Coil Deployment in a Swine Model

Myocardial infarction (MI) is the leading cause of mortality worldwide. Despite the use of evidence-based treatments, including coronary revascularization and cardiovascular drugs, a significant proportion of patients develop pathological left-ventricular remodeling and progressive heart failure following MI. Therefore, new therapeutic options, such as cellular and gene therapies, among others, have been developed to repair and regenerate injured myocardium. In this context, animal models of MI are crucial in exploring the safety and efficacy of these experimental therapies before clinical translation. Large animal models such as swine are preferred over smaller ones due to the high similarity of swine and human hearts in terms of coronary artery anatomy, cardiac kinetics, and the post-MI healing process. Here, we aimed to describe an MI model in pig by permanent coil deployment. Briefly, it comprises a percutaneous selective coronary artery cannulation through retrograde femoral access. Following coronary angiography, the coil is deployed at the target branch under fluoroscopic guidance. Finally, complete occlusion is confirmed by repeated coronary angiography. This approach is feasible, highly reproducible, and emulates the pathogenesis of human non-revascularized MI, avoiding the traditional open-chest surgery and the subsequent postoperative inflammation. Depending on the time of follow-up, the technique is suitable for acute, sub-acute, or chronic MI models.

Myocardial infarction (MI) animal models that emulate the natural process of the disease in humans are crucial to understanding pathophysiological mechanisms and testing the safety and efficacy of new emergent therapies. Here, we describe an MI swine model created by deploying a percutaneous embolization coil.

Infarto de miocardio por despliegue de bobina de embolización percutánea en un modelo porcino

Myocardial infarction (MI) is the leading cause of mortality worldwide. Despite the use of evidence-based treatments, including coronary revascularization ...