Este protocolo permite un examen in vitro en profundidad del microambiente ovárico. Permitir a los usuarios determinar el crecimiento y desarrollo del folículo, así como la esteroidogénesis y la abundancia de moléculas inmunes. Una ventaja de esta técnica es la capacidad de evaluar directamente los cambios en el microambiente ovárico y los folículos emergentes y evaluar la interacción única causada por la adición de hormonas específicas.
Esta técnica se puede utilizar para estudiar una variedad de trastornos reproductivos que causan paros foliculares. Por ejemplo, el síndrome de ovario poliquístico. Dado que podemos evaluar directamente el microambiente ovárico in vitro, demostrando el procedimiento estará Brooke Bell, una investigadora de pregrado de mi laboratorio.
Usando pinzas de mandíbula cerada, asegure el ovario, corte por la mitad y comience a eliminar las rodajas exteriores. Asegurarse de que no se corte más de uno a dos milímetros de profundidad de la superficie del ovario para que no se recolecte médula. Corte de tres a cuatro tiras delgadas de la corteza ovárica con un bisturí y coloque las tiras en la tercera placa de Petri llena de PBS.
Corta las tiras en pequeños trozos cuadrados de 0,5 a un milímetro cúbico con una cuchilla de bisturí. Use una regla debajo de las placas de Petri para asegurarse de que las piezas sean de tamaño y grosor similares para hacer piezas consistentes de corteza ovárica. Lave las piezas corticales ováricas en las tres placas de Petri de PBS y campo antibiótico, utilizando pinzas de punta curva para mover las piezas entre lavados.
Mueva las piezas de la corteza a través de la serie de lavados LB-15 y colóquelas en una placa de Petri final llena de LB-15. Etiquete la tapa con la identificación del animal y el lado ovárico. Recolecte cuatro piezas de corteza ovárica por ovario y fíjelas para la histología del día cero y congele piezas adicionales para la purificación del ARN.
Use las piezas de tejido restantes para el cultivo. Prepare un gabinete de seguridad biológica para un lavado final de tejidos y una preparación de cultivo. Desinfecte los suministros con etanol al 70% antes de colocarlos en el gabinete de seguridad biológica.
Mueva todas las piezas de corteza ovárica destinadas al cultivo al gabinete de seguridad biológica y lávelas una vez más en una placa de Petri llena de LB-15. Pipetear 350 microlitros de medio Waymouth por pozo en una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos. Coloque las inserciones de pozo de cultivo sin recubrimiento en cada pozo usando fórceps asegurándose de que no se formen burbujas debajo de la base del inserto.
Coloque con cuidado y delicadeza cuatro piezas de corteza ovárica en la malla de cada inserto sin perforar la malla. Incubar el tejido a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Cambie el medio de cultivo de la corteza ovárica diariamente durante siete días asegurándose de usar el medio Waymouth precalentado.
Durante los cambios de medio, use fórceps para levantar suavemente el inserto del pozo y recoger el medio Waymouth cultivado en tubos de 0,5 mililitros. Vuelva a colocar el inserto en el pozo y agregue 350 microlitros de medio de cultivo fresco dispensándolo entre el lado del inserto y el pozo. Guarde el medio recolectado del cultivo de tejido a menos 20 grados centígrados.
Después de siete días de cultivo, tome imágenes de las piezas de la corteza ovárica utilizando un microscopio de disección con una cámara conectada y un programa de software de imágenes por computadora. Fijar dos piezas de corteza ovárica por pozo en la solución de Bouin para histología y congelar flash a piezas de corteza ovárica en nitrógeno líquido para obtener ARN para el ADNc. Repita este paso para todos los pocillos con tejido, luego recoja el medio desde el séptimo día y guárdelo menos 20 grados.
Permita que las piezas de la corteza ovárica permanezcan inmersas en la solución de Bouin durante aproximadamente 1,5 horas, luego lávelas con etanol al 70% tres veces, mantenga el tejido en etanol al 70% y límpielo diariamente hasta que la solución ya no sea amarilla. La tinción de hematoxilina y eosina se realizó para folículos primordiales, folículos primarios tempranos, folículo primario, folículo secundario y folículo antral. La estadificación del folículo se realizó en una corteza ovárica fijada antes y después del cultivo para evaluar la foliculogénesis.
La diferencia en la morfología determinada por la deposición de colágeno puede indicar fibrosis en la corteza ovárica de las novillas de paso de escalera o control. Aquí se muestra una comparación del área promedio de tinción positiva roja picrosirius por corteza ovárica llena entre el control y las novillas escalonadas. La recolección diaria del medio de cultivo se agrupó durante tres días para evaluar la producción variada de hormonas esteroides, utilizando un radioinmunoensayo.
Los metabolitos esteroides y la producción de citoquinas también se midieron en el medio de cultivo de la corteza ovárica a partir de un pozo para cada animal agrupado durante cuatro días de cultivo. Cuanto más tiempo se sienta el tejido, más difícil puede ser trabajar con él. Es posible que deba practicar cortes precisos.
Esta técnica se utiliza para comprender los efectos sobre las vías de transducción de señales para rescatar el exceso de esteroidogénesis para determinar los efectos del exceso de esteroides en la producción de citoquinas y quimiocinas, y para determinar los efectos sobre la progresión o detención del folículo dentro del tejido ovárico.
