Work was funded by MRC grant G1002118.

Todo o trabalho animal foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais sob licença pela UK Home Office (número de licença do projeto PPL 60/1726 e 60/4026). Nota: os animais da casa, de acordo com os requisitos legais do Reino Unido em uma luz 14 horas e 10 horas de fotoperíodo escuro. Realizam experimentos com animais utilizando ratinhos C57BL6J tipo selvagem, ratos Tau-GFP que têm expressão ubíqua da proteína fluorescente verde (GFP), 8, e ratinhos Thy1-YFP com expressão ocasional de proteína fluorescente amarela (YFP) em um subconjunto de células neuronais 9: tanto linhagens transgênicas foram criados em um fundo C57Bl6J. 1. Condições de Trabalho e Preparação de Instrumentos <ol><li> Realiza toda a preparação de meios, a dissecção de tecidos, e trabalho de cultura numa câmara de fluxo laminar, para assegurar esterilidade: isto evita a necessidade da adição de antibióticos para meios. </li><li> Sempre permitir mídia / placas de cultura / pratos de embrião para equilibrardurante pelo menos 1 hora, num forno de 37 ° C (meio de dissecção / pratos de embriões) ou 37 ° C, 5% de CO2 (meio de cultura e as placas), antes de ser utilizado. </li><li> Mergulhe pipetas de vidro em solução 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) por cerca de uma hora, e depois deixar secar. Puxe pipetas na chama de um bico de Bunsen, dobrando o vidro como você faz isso, para produzir finamente desenhadas pipetas de vidro curvo. Após a pipeta é puxado, fazer um corte limpo com um cortador de vidro. Forno esterilizar a 160 ° C durante cerca de 45 min. NOTA: A loja destas pipetas de vidro que serão necessários para transferir ovários e folículos. </li></ol> 2. Preparação de Dissecção e Meios de Cultura <ol><li> Prepare Dissection Medium. <ol><li> Dissolve-se 3 mg / ml de BSA em meio de Leibowitz L15 e através de um filtro de esterilização de 0,2 mm de poro, filtro 25 mm de diâmetro. </li></ol></li><li> Neonatal Cultura Ovário. <ol><li> Para preparar o meio de cultura ovário neonatal, fazer 1 ml de meio para each ovário que serão cultivadas. Dissolve-se 3 mg / ml de BSA em Minimal Essencial-α Meios (aMEM) e através de um filtro de esterilização de 0,2 mm de poro, filtro 13 mm de diâmetro para um tubo estéril. </li><li> Para preparar as placas para cultura ovário neonatal, adicionar 1 ml de meio de cultura neonatal ovário para cada poço (um ovário por poço) de uma placa de 24 poços. Utilizando uma pinça relojoeiro estéreis, coloque uma membrana de policarbonato em cima do meio em cada superfície bem, brilhante para cima. UV esterilizar membranas antes do uso. </li></ol></li><li> Cultura folículo. <ol><li> Para preparar o meio de cultura folicular, Meios suplemento α-Mínimo Essencial com 1 UI / ml de hormona folículo recombinante humano estimulador, 5 ug / ml de ácido ascórbico e 5% v / v de soro obtidas a partir de ratinhos fêmea adultos. Filtrar através de uma esterilização de poro 0,2, filtro 13 mm de diâmetro para um tubo estéril. </li><li> Filtrar esterilizar o óleo de silicone através de um filtro de diâmetro de poro de 0,45 um, 25 mm, para um tubo estéril. </li><li> Para preparar plates, coloque 30 gotas ul de folículo meio de cultura em cada poço de uma cultura de não-tecido tratado de 96 poços de microtitulação round-bem placa, usando apenas a linha superior de cada placa (para permitir que os folículos para ser transferidos para novas linhas a cada dia mais de o período de cultura). Cuidadosamente sobrepor médio com 70 l de óleo de silicone esterilizados, para evitar a evaporação média. </li></ol></li><li> Folículo-ovário Co-cultura. <ol><li> Prepare meio de co-cultura folículo do ovário como para a cultura do folículo na etapa 2.3.1 acima, tornando-se 1 ml de meio para cada co-cultura folículo do ovário sendo configurado. </li><li> Para preparar as placas, adicionar 1 ml de meio para cada poço de uma placa de 24 poços. Utilizando fórceps de relojoeiro estéreis, colocar uma membrana Nucleopore no topo do meio em cada superfície bem, brilhante para cima. UV esterilizar membranas antes do uso. </li></ol></li></ol> 3. Neonatal Ovário Dissecção e Cultura <ol><li> Coloque 1 ml de meio de dissecção em cada estéril prato embrião vidro. </li> &lt;li&gt; Cull filhotes de rato recém-nascidos com idade entre 0 e pós-natal dia 5, abate por decapitação acordo com os regulamentos UK Home Office. </li><li> Agarrar a pele que cobre a parede abdominal usando um par de fórceps de dissecação fina e fazer uma grande incisão na parede do corpo e pele. Abra a incisão para que todo o abdômen está exposto. A bexiga é geralmente ingurgitadas nesta fase e pode ser perfurada para tornar mais fácil a dissecção. </li><li> Mova as tripas para fora do caminho usando uma pinça de relojoeiro. Seguir os cornos uterinos da bexiga até o rim de cada lado. O ovário está localizada logo abaixo do rim, na parte superior do útero e aparece como uma estrutura de nuvem sob um microscópio de dissecação. </li><li> Segure o ovário delicadamente com uma pinça de relojoeiro, e usar a tesoura para cortar o seu apego ao útero. Transferir o par de ovários em placas contendo meio de dissecação de embriões pré-aquecido. </li><li> Realizar dissecção multa de ovários sob um microscópio de dissecação em um sta aquecidage (37 ° C). Use agulhas de insulina para aparar o saco bursal e qualquer excesso de material, incluindo a trompa de Falópio, até que apenas o ovário permanece. </li><li> Transferir cada ovário dentro do poço de uma placa de cultura preparada no passo 2.2.2, utilizando uma pipeta de vidro curvo finamente desenhadas, um ovário no topo de cada uma das membranas (ver Figura 1A). Cultura em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Mudar a forma cada segundo dia. Usar uma pipeta para trocar 50% do meio em cada poço para pré-gaseados meio fresco: colocar a ponta da pipeta na borda da cavidade de forma a evitar a perturbação da membrana. </li><li> Manter culturas para até 6 dias. </li><li> No final da cultura, congelar médio e fixar ou congelar ovários após uma breve lavagem em PBS, como requerido. <ol><li> Corrigir ovários em fixador de Bouin por 90 min para análise histológica, ou em 10% de formalina tamponada neutra por 90 min para análise imuno. Encaixar congelar ovários, colocando em tecidoum tubo de polipropileno, colocando o tubo em gelo seco durante 5-10 minutos antes de congelar a -70 ° C para subsequente proteína ou extracção de ARNm. </li></ol></li></ol> 4. Folículo Dissecção e Cultura <ol><li> Cull 19-23 dias de idade, os ratinhos do sexo feminino e isolar os ovários. Molhar a pele com etanol 70% antes de fazer qualquer incisões. Aperte a pele usando uma pinça terminou sem corte e fazer uma grande incisão no abdômen com tesouras de dissecação, que penetra através da pele e da parede do corpo. </li><li> Mova o intestino para fora do caminho, utilizando um conjunto mais fino de instrumentos de dissecção e localize o útero. Seguir o útero até o ovário, que está localizado abaixo do rim de cada lado. </li><li> Delicadamente, agarrando o ovário usando um par de fórceps relojoeiro, cortar o apego ovários para o útero com tesouras de dissecação finas. Evite coletando muito da camada de gordura de ovário. Recolha os ovários e transferir para um pratos embrião contendo meio de dissecção pré-aquecido. </li><li> Remover a bolsa ovárica usando agulhas de insulina para aparar o saco bursal e qualquer excesso de material, incluindo a trompa de Falópio, até que apenas o ovário permanece. Cerca de reduzir pela metade a cada ovário usando agulhas de insulina. </li><li> Transferir cuidadosamente cada ovário-metade em um vidro de relógio individual contendo 1 ml de meio de dissecção. Cobrir cada vidro de relógio com uma lâmina de vidro para evitar a evaporação do meio e para assegurar a esterilidade. </li><li> Vidros de relógio da loja contêm metades de ovário num forno de 37 ° C até ser necessário, mas realizar o passo seguinte dissecção o mais rapidamente possível. Descartar tecido armazenado nesta forma durante mais de uma hora. </li><li> Transferência de vidro de relógio contendo uma metade de uma fase de ovário microscópio aquecida a 37 ° C numa câmara de fluxo laminar. Aproximadamente dissecar ovário em pedaços grandes, utilizando duas agulhas de insulina, a fim de identificar folículos pré-antrais final como se segue: estes irão conter 2-3 camadas de células da granulosa e ter um diâmetro de cerca de 180-200 mm. </li><li> Dissecar manualmente qualquer ifolículos dentified usando uma agulha de insulina e um 30 x 0,25 milímetros agulha de acupuntura que tem sido assegurado em um suporte de agulha. Tenha cuidado para remover a maior parte do estroma circundante, mas não danificar a lâmina basal de folículos (ver Figura 1B). </li><li> Use uma pipeta de vidro curvo finamente desenhado para transferir cuidadosamente folículos dissecados em um vidro de relógio coleta contendo meio de dissecção pré-aquecido. Tenha cuidado para manter os folículos dentro da seção de calibre fino de pipeta para evitar a perda de folículos. </li><li> Folículos medir com precisão usando uma retícula ocular calibrado montado em um microscópio de dissecação. </li><li> Selecione os folículos para a cultura só se eles medem 190 ± 10 mm de diâmetro. Além disso, selecionar apenas folículos esféricas saudáveis ​​para a cultura; estes serão translúcido, sem áreas atréticos escuros, e ter uma lâmina basal intacta, juntamente com alguns tecidos thecal anexado: descartar qualquer folículos que não se encaixam nessa descrição. Um rendimento de entre 10-15 folículos por ovário é bom. </li><li> Usar uma pipeta de vidro curvo finamente desenhadas para transferir um único folículo para dentro do poço de uma placa composta como no passo 2.3.3 supra. Cuidadosamente coloque o folículo no fundo do poço (e não na camada superior de óleo). Cultura em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Folículos de cultura para até 6 dias, movendo-se folículos em um meio fresco bem contendo todos os dias. <ol><li> Preparar a próxima linha na placa de 96 poços como na preparação de placa no passo 2.3.3 supra. Retorno placa à incubadora durante pelo menos uma hora, para permitir o equilíbrio. Transferir folículos em poços frescas de meio, usando uma pipeta de vidro finamente desenhado. </li><li> Se em qualquer ponto na cultura folículos são para ser deixado durante dois dias antes de se mudar para meio fresco, colocar cada folículo em um mínimo de 60 ul (em vez de 30 uL) de gotas de meio de cultura folículo. </li></ol></li><li> Para a coleta de dados sobre o crescimento do folículo, medir folículos diariamente, usando um eyepiece retícula colocada num microscópio de dissecação. A camada de óleo irá distorcer medições do diâmetro do folículo, por isso o trabalho fora do coeficiente de calibração para o set-up. </li><li> No final da cultura, congelar médio e fixar ou congelar tecido para análise subsequente, tal como no passo 3.10 acima. </li><li> Folículo-folículo Co-cultura. <ol><li> Cultura dois folículos juntos, para investigar as interações entre folículos. Cultura tal como acima, mas colocar dois folículos lado-a-lado, em contacto, em um poço. </li><li> Coloque 100 ul de gotas de meio de cultura folículo em cada poço de uma cultura não-tecido tratado com 96 poços de microtitulação de placa plana poços, sobrepondo meio com 100 ul de óleo de silicone esterilizados. Não transferir folículos em poços frescos como no passo 4.13 acima, mas em vez disso utilizar uma ponta fina em gel de 50% de mudar o meio todos os outros dias. </li><li> A fim de identificar origens de tecidos dentro da co-cultura, co-cultura de folículos de cada um de uma fonte diferente genético, por exemplo one do ovário de um ratinho de tipo selvagem, e o outro a partir do ovário de um rato com expressão ubíqua de GFP. Se utilizando GFP ou tecido YFP, minimizar a exposição do tecido a luz tanto quanto possível, durante a cultura, e através dos passos de fixação / processamento subsequentes. NOTA: É normal que os dois folículos a crescer juntos em uma única unidade, &quot;duas folículo &#39;(ver Figura 1C). </li></ol></li></ol> 5. Folículo-Ovário co-culturas <ol><li> Dissecar ovários e folículos fora como nos pontos 3 e 4 acima. </li><li> Coloque um ovário neonatal no topo de uma membrana, numa placa preparado como no passo 2.4.2 supra. Cuidadosamente coloque um único folículo em contacto com um pólo do ovário neonatal, utilizando uma pipeta de vidro curvo finamente desenhadas. Cultura em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2 durante até 5 dias. </li><li> A fim de distinguir entre o tecido de origem dentro da co-cultura, use ovários e folículos de dois diferentes, de modources, por exemplo, um de um rato do tipo selvagem, e um de um rato com expressão ubíqua da GFP. </li><li> Substituir 500 ul de meio por dia como no passo 3.8 acima, mas utilizando um meio de cultura folículo. Durante a co-cultura, o folículo frequentemente torna-se encapsulada pelo ovário (Figura 1D). </li><li> No final da cultura, congelar médio e fixar ou congelar tecido para análise subsequente, tal como no passo 3.10 acima. </li></ol> 6. Fixação, Immunocytochemistry e imagem de tecido cultivado <ol><li> No final da cultura, lavar o tecido em PBS e transferir para 100 ul (folículo) ou 1 ml (ovário) de 10% de formalina tamponada neutra, e fixar durante 1 h em gelo. Mover através de 3 lavagens de 1x PBS a 4 ° C. </li><li> Para imunocitoquímica, em folículos, a transferência entre 96 cavidades de uma placa de microtitulação de poços rodada poços, utilizando uma pipeta de vidro curvo finamente desenhadas, com cada poço contendo diferentes lavagens ou tratamentos. </li><li> Para immunocytochemistry em Ovaries (ou ovário folículo-co-culturas), incorporar em 4% em gel de agarose e seção em 50 mm usando um vibrotome. Secções de flutuador nos poços de uma placa de 24 poços para aplicar lavagens ou tratamentos, a remoção com uma pipeta. </li><li> Para imagem: transferir seções de agarose para lâminas de vidro planas e montar com meio de montagem; ou folículos de transferência (ou complexos folículo-folículo) para lâminas de vidro da cavidade e montar com que não endureça meio de montagem. Espécimes de imagem usando um microscópio confocal. </li></ol>

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	<li>Brien, M. J., Pendola, F. L., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+protocol+for+in+vitro+development+of+mouse+oocytes+from+primordial+follicles+dramatically+improves+their+developmental+competence.">A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence.</a> Biol. Reprod. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li><li>Fortune, J. E., Yang, M. Y., Muruvi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+earliest+stages+of+follicle+development:+follicle+formation+and+activation.">The earliest stages of follicle development: follicle formation and activation.</a> Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 67, 203-216 (2010).</li><li>McLaughlin, M., Kinnell, H. L., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+phosphatase+and+tensin+homologue+(PTEN)+in+human+ovary+in+vitro+results+in+increased+activation+of+primordial+follicles+but+compromises+development+of+growing+follicles.">Inhibition of phosphatase and tensin homologue (PTEN) in human ovary in vitro results in increased activation of primordial follicles but compromises development of growing follicles.</a> Mol. Hum. Reprod. 20 (8), 736-744 (2014).</li><li>Morgan, S., Lopes, F., Gourley, C., Anderson, R. A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin+and+doxorubicin+induce+distinct+mechanisms+of+ovarian+follicle+loss;+imatinib+provides+selective+protection+only+against+cisplatin.">Cisplatin and doxorubicin induce distinct mechanisms of ovarian follicle loss; imatinib provides selective protection only against cisplatin.</a> PLoS One. 8 (7), e70117 (2013).</li><li>Murray, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth+and+oocyte+competence+in+the+in+vitro+cultured+mouse+follicle:+effects+of+gonadotrophins+and+steroids.">Follicular growth and oocyte competence in the in vitro cultured mouse follicle: effects of gonadotrophins and steroids.</a> Mol Hum Reprod. 14 (2), 75-83 (2008).</li><li>Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effect+of+follicle-follicle+interactions+and+declining+follicle-stimulating+hormone+on+murine+follicle+health+in+vitro.">Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro.</a> Biol. Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).</li><li>Campbell, L., Trendell, J., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cells+migrating+from+the+thecal+layer+of+ovarian+follicles.">Identification of cells migrating from the thecal layer of ovarian follicles.</a> Cell Tissue Res. 353 (1), 189-194 (2013).</li><li>Pratt, T., Sharp, L., Nichols, J., Price, D. J., Mason, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+and+transgenic+mice+ubiquitously+expressing+a+tau-tagged+green+fluorescent+protein.">Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein.</a> Dev. Biol. 228 (1), 19-28 (2000).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Maiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reply+to:+cisplatin-induced+primordial+follicle+oocyte+killing+and+loss+of+fertility+are+not+prevented+by+imatinib.">Reply to: cisplatin-induced primordial follicle oocyte killing and loss of fertility are not prevented by imatinib.</a> Nat. Med. 18 (8), 1172-1174 (2012).</li><li>Spears, N., Bruin, d. r., Gosden, J. P., G, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+follicular+dominance+in+co-cultured+mouse+ovarian+follicles.">The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles.</a> J. Reprod. Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).</li><li>Desmeules, P., Devine, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+ovotoxicity+of+cyclophosphamide+metabolites+on+cultured+mouse+ovaries.">Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries.</a> Toxicol. Sc. 90 (2), 500-509 (2006).</li><li>Tagler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+extracellular+matrix+remodelling+via+ascorbic+acid+enhances+the+survival+of+primary+ovarian+follicles+encapsulated+in+alginate+hydrogels.">Promoting extracellular matrix remodelling via ascorbic acid enhances the survival of primary ovarian follicles encapsulated in alginate hydrogels.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (7), 1417-1429 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Descrevemos aqui vários sistemas de cultura que podem ser utilizados para apoiar o desenvolvimento de folículos ovarianos do rato in vitro, usando ovários neonatais inteiras contendo apenas os estágios mais adiantados do folículo, folículos ovarianos pré-antrais individuais e também co-culturas dos dois tecidos. Cultura de ovários neonatal mouse suporta desenvolvimento ovariano cedo, a iniciação crescimento particularmente folículo até o estágio de folículo secundário. A gama de idades de camundongos recém-nascidos podem ser usados ​​para estas culturas, em função das fases de desenvolvimento de interesse. Se os ovários são obtidos a partir de camundongos recém-nascidos, a formação do folículo será em andamento, mas ainda não completa: cultura apoiará pelo menos parcialmente, a formação do folículo contínuo seguido de crescimento do folículo. Alternativamente, a utilização de ovários de ratos cerca de quatro a cinco dias de idade (por formação de folículos tempo que é já completos) resulta em cultura de um maior número de folli primordial e crescentegos 12. Aspectos benéficos do método específico descrito aqui incluem o uso de membranas de policarbonato flutuantes que permitem uma maior oxigenação do tecido, e cultura num meio básico que consiste em apenas aMEM e BSA, evitando o uso de aditivos não definidos, tais como soro. Cultura de todo ovários não parece apoiar o desenvolvimento para além do estágio de folículo secundário, com posterior desenvolvimento que exige uma mudança de técnica, como a dissecação de complexos celulares folículo-granulosa do ovário neonatal culta 1. Fases posteriores do desenvolvimento folicular pode ser desenvolvido in vitro, dissecou-se para fora indivíduo, folículos pré-antrais final intactas, que podem ser cultivados para a fase pré-ovulatória em cultura, mantendo a sua estrutura tridimensional. O uso de folículos intactos para esta técnica de cultura mantém a relação entre os diferentes componentes foliculares como ocorre in vivo. This sistema de cultura pode ser usado para obter oócitos que podem suportar a fertilização e subsequente desenvolvimento embrionário. Oócitos fertilizável também pode ser obtido a partir de ovários de ratinho neonatal, utilizando um protocolo de cultura inicial muito como aqui descrito, seguida por uma segunda fase durante a qual os complexos oócito-granulosa são cultivadas in vitro 1. Outros sistemas utilizados com bastante frequência hoje incluem a cultura de folículos do ovário ou do tecido que tenha sido encapsuladas num material de hidrogel de alginato, tais como, para fornecer suporte (ver, por exemplo, Tagler et ai. 13). Grande parte do foco de desenvolvimento do método agora é para melhorar as técnicas de cultivo para os ovários e folículos dos mamíferos maiores, com o objectivo a longo prazo de obtenção de oócitos fertilizável de folículos primordiais de uma variedade de espécies, incluindo humanos. Em qualquer dado momento, os folículos dos ovários de mamíferos contêm em uma gama de fases de desenvolvimento, com interactions entre folículos que afectam a sua regulação. Este aspecto da função ovariana é mal compreendido e difícil de examinar in vivo. O último método descrito aqui usa sistemas de co-cultura para apoiar o desenvolvimento de diferentes estágios de folículos in vitro. Se necessário, um ou ambos os tecidos podem ser pré-tratadas in vivo ou in vitro antes da co-cultura. Sistemas de co-cultura como este oferecem uma maneira ideal para examinar as interações folículo-foliculares, por exemplo, como crescimento, folículos antrais afetar o pool de folículos primordiais, aspectos da biologia do ovário que provaram difícil examinar até agora. Técnicas de cultura de ovário integrais são bastante simples, embora dissecção cuidadosa é necessária para evitar danos nos tecidos acidental. Dissecção de folículos individuais é uma técnica especializada, exigindo a prática repetida antes de folículos na fase certa pode ser dissecado para fora do ovário intacto e sem danos. É críticodissecar folículos individuais cuidadosamente, ou danos sofridos durante o protocolo de dissecção pode resultar em morte folículo durante o período de cultura subseqüente. Onde folículos são colocados directamente para dentro do poço de placas de microtitulação, é importante utilizar apenas plásticos de cultura de tecidos não tratados, para minimizar o plaqueamento de células da teca para baixo sobre os plásticos se utensílios de plástico tratados de cultura de tecidos é usado, os folículos vai anexar ao base do poço e ruptura à medida que crescem. Para todo o trabalho de co-cultura, os tecidos devem ser colocados directamente em contacto uns com os outros. A forma detalhada acima para utilização na técnica de cultura de folículo inclui a adição de soro de ratinho. É possível substituir o soro do rato com soro bovino fetal, mas apenas lotes ocasionais de tais soros vai apoiar plenamente o desenvolvimento do folículo para a fase pré-ovulatória, com lotes de teste necessária para identificar fontes adequadas. Batch-teste de FSH também é aconselhável, como a Uni Internacionalts, através da qual a FSH é avaliada correlato apenas grosseiramente para o crescimento folicular in vitro. Se a ruptura do folículo ocorre rotineiramente durante o período de cultivo, considere a substituição de ácido ascórbico estoque por um novo lote. As técnicas não requerem equipamento especializado particularmente com excepção de dissecção incubadoras e microscópios de cultura de tecidos, embora o uso de uma câmara de fluxo laminar e uma boa técnica estéril permitir que os folículos do ovário a ser cultivadas na ausência de antibióticos, como nos métodos descritos aqui. Isto pode ser útil, para evitar qualquer potencial efeito prejudicial dos antibióticos sobre os oócitos, particularmente se eles são para ser fertilizado seguinte cultura. Nos casos em que não é possível trabalhar num ambiente estéril, é aconselhável adicionar antibióticos para a dissecção e meios de cultura.

O ovário mamífero é composta de suprimento vitalício de uma fêmea de oócitos, cada contido dentro de um folículo ovariano. Os folículos são formadas antes do nascimento no repouso, a fase primordial: uma vez que a piscina folículo é estabelecida, há um movimento contínuo e gradual dos folículos do primordial para o pool de folículos em crescimento. Como folículos começam a crescer, eles desenvolvem através dos estágios primários, secundários, pré-antrais e antrais, até chegar ao pré-ovulatório, ou de Graaf, estágio. Somente oócitos de folículos pré-ovulatórios tem competência para o desenvolvimento integral, capaz de suportar o desenvolvimento embrionário a prazo, se fertilizado. O ovário tem sido conhecido para o desenvolvimento de uma forma altamente fisiológica in vitro. Este é provavelmente devido a cada folículo ovariano contendo no seu interior as células necessárias para apoiar um ovócito desde a fase imatura (em que ponto ele é incapaz de completar sua divisão meiótica) até tele estágio developmentally competente (em que ponto ele pode apoiar plenamente a conclusão da meiose, a fertilização e no desenvolvimento do embrião resultante de prazo). A natureza fisiológica do desenvolvimento do ovário in vitro conduziu à ampla utilização de técnicas de cultura de ovário. Por conseguinte, em métodos in vitro têm sido utilizados para investigar a regulação do desenvolvimento dos ovários, do ovário patologia (por exemplo, que de síndrome do ovário policístico, SOP), o exame dos ovários como / ovócitos são afectadas pela exposição aos produtos químicos, e também com o objectivo de prático obtenção de oócitos de folículos ovarianos fertilizável primordiais. Até à data, este último foi conseguido apenas usando tecido ovariano 1 do mouse, embora as técnicas de cultura utilizando os folículos de grandes mamíferos, incluindo humanos, têm melhorado muito nos últimos anos 2,3. Descrevemos aqui vários métodos de cultura utilizando tecido ovariano mouse. O primeiro metod usa inteiros ovários neonatais do rato, e apoia a formação e desenvolvimento precoce de folículos primordiais 4. O segundo sistema suporta o crescimento de folículos ovarianos individuais, intactas do pré-antral tarde para a fase pré-ovulatória; usando esta técnica, os folículos podem ser cultivadas individualmente, ou em pares 5,6. Finalmente, descreve-se um sistema de co-cultura, combinando as duas primeiras técnicas em um método que permite a investigação das interacções entre crescimento e folículos primordiais 7. Cultura de folículos ovarianos intactas individuais permite o crescimento do folículo a ser determinado a partir de medições do folículo diários durante o período de cultivo, enquanto a análise meio permite investigação do folículo / produção de hormônios do ovário. Outras análises de tecidos pode ser conseguida por um conjunto de folículos do ovário ou tecido no final da cultura, para análises histológicas / imuno-histológicos ou para processamento posterior, por exemplo, para se obtermRNA ou proteínas.

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			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:265px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Leibowitz L15</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">11415049</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">&#945;MEM</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">22571020</td>
			<td style="width:265px;">Supplied as sodium bicarbonate buffered (2200 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A9418</td>
			<td style="width:265px;">For dissection medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A3311</td>
			<td style="width:265px;">For culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A2153</td>
			<td style="width:265px;">For coating glass pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Mouse serum</td>
			<td style="width:159px;">-</td>
			<td style="width:151px;">-</td>
			<td style="width:265px;">Collected from cardiac puncture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">FSH</td>
			<td style="width:159px;">Merck Serono</td>
			<td style="width:151px;">Gonal F</td>
			<td style="width:265px;">Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10&#181;l in &#945;MEM and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A4034</td>
			<td style="width:265px;">Make up stock of 5mg/ml in &#945;MEM and store at -20&#176;C.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Silicon oil</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:151px;">630064V</td>
			<td style="width:265px;">Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Syringe filters (25mm, 0.2&#181;m)</td>
			<td style="width:159px;">Greiner</td>
			<td style="width:151px;">16532K</td>
			<td style="width:265px;">Cellulose acetate filter: for filtering larger (&#62; 5mls) volumes of medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Syringe filters (13mm, 0.2&#181;m)</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">3032-013</td>
			<td style="width:265px;">Cellulose acetate filter: for filtering smaller (&#60; 5mls) volumes of medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Syringe filters (25mm, 0.45&#181;m)</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">2053-025</td>
			<td style="width:265px;">Cellulose acetate filter: for filtering oil.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Sterile tubes</td>
			<td style="width:159px;">Greiner</td>
			<td style="width:151px;">187261</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">24 well plate</td>
			<td style="width:159px;">Greiner</td>
			<td style="width:151px;">662160</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">96 well round bottom plate</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">3875-096</td>
			<td style="width:265px;">Use only non-tissue culture treated plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">96 well flat bottomed well</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">3860-096</td>
			<td style="width:265px;">Use only non-tissue culture treated plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Whatman nucleopore membranes</td>
			<td style="width:159px;">Camlab</td>
			<td style="width:151px;">WN/110414</td>
			<td style="width:265px;">Use shiny surface up, polycarbonate, 13mm diameter, 8.0&#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Insulin needles</td>
			<td style="width:159px;">BD medical supplies</td>
			<td style="width:151px;">037-7606</td>
			<td style="width:265px;">0.33mm (29G) +1ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Glass embryo dishes</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:151px;">720-0579</td>
			<td style="width:265px;">Sterilise then warm before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">10209381</td>
			<td style="width:265px;">BSA coated before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Gel tips</td>
			<td style="width:159px;">AlphaLabs</td>
			<td style="width:151px;">LW1103</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Acupuncture needles</td>
			<td style="width:159px;">Acumedic LTD</td>
			<td style="width:151px;">30mmx0.25 Type C</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bouin&#8217;s fixative&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">HT10132-1L</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ml</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">1.5 ml polypropylene tubes</td>
			<td style="width:159px;">Greiner BioOne</td>
			<td align="right">616201</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and co-culture of mouse ovaries and ovarian follicles

O ovário mamífero é composto dos folículos ováricos, cada folículo consistindo de um único oócito rodeado por células da granulosa somáticas, em conjunto fechado dentro de uma membrana basal. A piscina finito de folículos é estabelecido durante o desenvolvimento embrionário, quando oócitos em parada meiotic formar uma estreita associação com células da granulosa achatadas, formando folículos primordiais. Por ou logo após o nascimento, os ovários de mamíferos contêm oferta de seu tempo de vida de folículos primordiais, a partir do qual o ponto em diante, há uma liberação constante de folículos no crescente piscina folicular. O ovário é particularmente sensível para o desenvolvimento in vitro, com folículos em crescimento de uma forma altamente fisiológica em cultura. Este trabalho descreve a cultura de ovários neonatais inteiras contendo folículos primordiais, ea cultura de folículos ovarianos individuais, um método que pode apoiar o desenvolvimento de folículos de um imaturo até o preovufase de Regulamentação, após o que os oócitos são capazes de sofrer a fertilização in vitro. O trabalho descrito aqui utiliza sistemas de cultura para determinar a forma como o ovário é afectada pela exposição a compostos externos. Nós também descrevem um sistema de co-cultura, que permite a investigação das interações que ocorrem entre os folículos em crescimento e não-crescente grupo de folículos primordiais.

A Figura 1 mostra imagens de folículos dos ovários e no início de, e durante, os procedimentos de cultura. A Figura 2 mostra resultados representativos de ovários neonatais (aqui, ovários de filhotes recém-nascidos) expostas a substâncias tóxicas reprodutivas durante a cultura. Ovários neonatais foram cultivadas durante 6 dias, e expostos a um medicamento de quimioterapia, cisplatina ou doxorrubicina, no dia 2 de cultura. No final da cultura, os ovários foram fixadas e processadas para histologia e dos ovários, em seguida, examinado para determinar o número de folículos saudáveis ​​e doentes 4. Alternativamente, uma avaliação mais rápida dos folículos em crescimento iniciais podem ser obtidos a partir da cultura de fragmentos ovarianos, usando ovários de um ratinho que expressam um marcador fluorescente específica do oócito 10. Durante a cultura de folículos individuais, o crescimento folicular pode ser facilmente determinada por medições diárias durante o cultura período. A Figura 3 mostra resultados representativos do crescimento de folículos cultivados na presença ou na ausência de hormonas gonadotrofinas hormona folículo-estimulante (FSH) e hormona luteinizante (LH) 5. Folículo-folículo do ovário ou folículo-co-cultura pode ser usado para investigar interacções entre folículos. Dependendo do tecido e de processamento de imagens podem ser obtidas utilizando de campo brilhante, ou microscopia confocal de fluorescência. A Figura 4 mostra resultados representativos de imagens a partir de tais co-culturas, ao exame dos diferentes tipos de células envolvidas na comunicação folículo-folículo, incluindo células endoteliais e células neuronais 7. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" width="650" /> Figura 1: (A) Fotomicrograf ia de um ovário neonatal obtido a partir de um rato no dia do nascimento, colocado<html> sobre uma membrana de policarbonato. (B) Fotomicrografia de recém-dissecados folículo ovárico saudável, com a maior parte do tecido do estroma circundante dissecado. (C) Fotomicrografias de co-cultura de dois folículos ovarianos ao longo dos três primeiros dias de cultura, mostrando o contato mais próximo que se desenvolve entre os dois folículos como a cultura rendimentos (IC: primeiro dia da cultura; Cii: segundo dia da cultura; CIII : terceiro dia de cultura). Reproduzido de Spears et al. 11 (D) Fotomicrografia de co-cultivadas folículo pré-antral e ovário neonatal após dois dias de cultura. A imagem mostra o folículo fique encapsulada pelo ovário. Seta mostra folículo pré-antral. Imagem de Dr Federica Lopes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> gura 2 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52458 / 52458fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2: Efeito das drogas de quimioterapia cisplatina e doxorrubicina em ovários cultivadas neonatais cisplatina e doxorrubicina tanto levar a perda da saúde do folículo e uma redução no número de folículos.. (A) A cisplatina; (B) A doxorrubicina: (i) Percentagem de folículos insalubres (claros); e (ii) o número total de folículos (sombreado) em cada ovário. Bares denotar média + EPM; n = 5 para todos os grupos, estrelas denotam diferenças significativas em relação ao controlo (* p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001). Reproduzido de Morgan et al. 4 <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig3.jpg" width="400" /> Figura 3: Crescimento. Taxas de folículos expostas a diferentes ambientes de gonadotrofinas Os valores são média ± SEM (n ≥16 para cada grupo). A seta indica o início da antraformação l em todos os grupos de gonadotrofinas. Reproduzido de Murray et al. 5 <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" width="650" /> Figura 4: Imagens de folículo-foliculares e ovário folículo-co-culturas, mostrando interações folículo-foliculares (A) micrografia confocal de uma proteína verde fluorescente (GFP) folículo e uma do tipo selvagem (WT) folículo após co-cultura (. expressão GFP mostrado aqui em branco), com os processos a partir do folículo GFP mostrado que se estende sobre o folículo WT. (B) Corte transversal através de uma complexa / folículo WT GFP após a co-cultura, que mostra que os processos de GFP (verde) a partir do folículo lie adjacente ao lado da lâmina basal do folículo WT. (C) Neonatal WT ovário seguinte cultura com um folículo, mostrando que as células GFP e processos celulares (verde) expressando GFP pré-antral migraramatravés da interstitum ovário do ovário neonatal. (D) GFP / folículo WT complexo contendo células endoteliais, mostrado pela expressão de CD31 endotelial marcador de célula (vermelho). (E) GFP complexo folículo / WT contendo células neuronais, mostrado pela expressão do marcador neuronal beta tubulina III (veja aqui como vermelho, amarelo ou como se duplamente marcada com GFP, verde). Complexo folículo (F) YFP / WT, onde YFP refere-se à hormona folículo de um ratinho Thy1-YFP que tem expressão ocasional de proteína fluorescente amarela (YFP: amarelo) em um subconjunto de células neuronais 9, que mostra que os neurónios se estendem a partir do folículo YFP. Barras de 50 um (A, B, D), 100 um (C, E, F), 100 um (inserção em A), 10 um (inserção em C), 15 um (inserção em D). Reproduzido de Campbell et al. 7 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta fi</a>gura.

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Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Este protocolo descreve a cultura primária / co-cultura de tecido ovariano rato, usando ovários de camundongos recém-nascidos e folículos ovarianos individuais de ratos pré-púberes. As técnicas de cultura de suportar o desenvolvimento de uma forma altamente fisiológico, que permita a investigação do efeito de agentes extrínsecos no ovário, e das interacções entre os folículos do ovário.

Cultura e Co-Culture of Mouse ovários e folículos ovarianos

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

culture-and-co-culture-of-mouse-ovaries-and-ovarian-follicles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

22.4K visualizações.  University of Edinburgh.  Este protocolo descreve a cultura primária / co-cultura de tecido ovariano rato, usando ovários de camundongos recém-nascidos e folículos ovarianos individuais de ratos pré-púberes. As técnicas de cultura de suportar o desenvolvimento de uma forma altamente fisiológico, que permita a investigação do efeito de agentes extrínsecos no ovário, e das interacções entre os folículos do ovário. 

Vídeo: Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Biologia do Desenvolvimento

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

In Vitro Crescimento do folículo pré-antral do Mouse sob microgravidade simulado

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissecção e cultura do rim embrionário do rato

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

O ensaio de co-cultura anel aórtico: Uma ferramenta conveniente para avaliar o potencial angiogênico das células estromais mesenquimais em Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Dissecção e coloração dos ovários Pupal drosófila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Cultura do tecido ovariano Visualizar fenômenos no ovário de Mouse

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Sistema tridimensional do ensaio da angiogênese usando spheroids da co-cultura dados forma pela colônia endothelial que dá forma a pilhas e às pilhas de haste mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Methods Article

Cultura e Co-Culture of Mouse ovários e folículos ovarianos