Name: culture and co-culture of mouse ovaries and ovarian follicles
Uploaded: 2015-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles at JoVE.com

Work was funded by MRC grant G1002118.

<ol>
	<li>Brien, M. J., Pendola, F. L., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+protocol+for+in+vitro+development+of+mouse+oocytes+from+primordial+follicles+dramatically+improves+their+developmental+competence.">A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence.</a> Biol. Reprod. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li><li>Fortune, J. E., Yang, M. Y., Muruvi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+earliest+stages+of+follicle+development:+follicle+formation+and+activation.">The earliest stages of follicle development: follicle formation and activation.</a> Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 67, 203-216 (2010).</li><li>McLaughlin, M., Kinnell, H. L., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+phosphatase+and+tensin+homologue+(PTEN)+in+human+ovary+in+vitro+results+in+increased+activation+of+primordial+follicles+but+compromises+development+of+growing+follicles.">Inhibition of phosphatase and tensin homologue (PTEN) in human ovary in vitro results in increased activation of primordial follicles but compromises development of growing follicles.</a> Mol. Hum. Reprod. 20 (8), 736-744 (2014).</li><li>Morgan, S., Lopes, F., Gourley, C., Anderson, R. A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin+and+doxorubicin+induce+distinct+mechanisms+of+ovarian+follicle+loss;+imatinib+provides+selective+protection+only+against+cisplatin.">Cisplatin and doxorubicin induce distinct mechanisms of ovarian follicle loss; imatinib provides selective protection only against cisplatin.</a> PLoS One. 8 (7), e70117 (2013).</li><li>Murray, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth+and+oocyte+competence+in+the+in+vitro+cultured+mouse+follicle:+effects+of+gonadotrophins+and+steroids.">Follicular growth and oocyte competence in the in vitro cultured mouse follicle: effects of gonadotrophins and steroids.</a> Mol Hum Reprod. 14 (2), 75-83 (2008).</li><li>Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effect+of+follicle-follicle+interactions+and+declining+follicle-stimulating+hormone+on+murine+follicle+health+in+vitro.">Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro.</a> Biol. Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).</li><li>Campbell, L., Trendell, J., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cells+migrating+from+the+thecal+layer+of+ovarian+follicles.">Identification of cells migrating from the thecal layer of ovarian follicles.</a> Cell Tissue Res. 353 (1), 189-194 (2013).</li><li>Pratt, T., Sharp, L., Nichols, J., Price, D. J., Mason, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+and+transgenic+mice+ubiquitously+expressing+a+tau-tagged+green+fluorescent+protein.">Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein.</a> Dev. Biol. 228 (1), 19-28 (2000).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Maiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reply+to:+cisplatin-induced+primordial+follicle+oocyte+killing+and+loss+of+fertility+are+not+prevented+by+imatinib.">Reply to: cisplatin-induced primordial follicle oocyte killing and loss of fertility are not prevented by imatinib.</a> Nat. Med. 18 (8), 1172-1174 (2012).</li><li>Spears, N., Bruin, d. r., Gosden, J. P., G, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+follicular+dominance+in+co-cultured+mouse+ovarian+follicles.">The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles.</a> J. Reprod. Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).</li><li>Desmeules, P., Devine, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+ovotoxicity+of+cyclophosphamide+metabolites+on+cultured+mouse+ovaries.">Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries.</a> Toxicol. Sc. 90 (2), 500-509 (2006).</li><li>Tagler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+extracellular+matrix+remodelling+via+ascorbic+acid+enhances+the+survival+of+primary+ovarian+follicles+encapsulated+in+alginate+hydrogels.">Promoting extracellular matrix remodelling via ascorbic acid enhances the survival of primary ovarian follicles encapsulated in alginate hydrogels.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (7), 1417-1429 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

אנו מתארים כאן מערכות תרבות שונות שיכול להיות מנוצלת כדי לתמוך בפיתוח של זקיקים בשחלות עכבר במבחנה, באמצעות השחלות יילודים כל המכילות רק את השלבים הראשונים זקיק, זקיקים בשחלות preantral פרט וגם שיתוף תרבויות של שתי רקמות. תרבות של השחלות עכבר בילוד תומכת בפיתוח שחלות בשלב מוקדם, ייזום צמיחה במיוחד זקיק עד שלב הזקיק המשני. טווח גילים של עכברים בילוד יכול לשמש לתרבויות אלה, בהתאם לשלבי ההתפתחות של עניין. אם השחלות מתקבלות מעכברים שזה עתה נולד, היווצרות זקיק תהיה בעיצומו, אך עדיין לא שלם: התרבות לפחות באופן חלקי תתמוך היווצרות זקיק המשך אחרי צמיחת זקיק. לחלופין, שימוש בשחלות מעכברים סביב ימים ארבעה עד חמש של גיל (שבו היווצרות זקיק הזמן היא מלאים כבר) תוצאות בתרבות של מספר רב יותר של Folli הקדמוני וגדלcles 12. היבטים חיוביים של הטכניקה הספציפית המתוארת כאן כוללים שימוש בממברנות פוליקרבונט צפים, המאפשרות חמצון גדול יותר של הרקמה, ותרבות במדיום מאוד בסיסי ובו רק αMEM וBSA, הימנעות משימוש בתוספים לא מוגדרים כגון סרום. תרבות של כל השחלות לא נראית לתמוך בהתפתחות מעבר לשלב הזקיק המשני, עם התפתחות מאוחרת יותר הדורשת שינוי בטכניקה, כגון הנתיחה של מתחמי תא הזקיק-granulosa מהשחלה בילוד התרבותית 1. בשלבים מאוחר יותר של התפתחות זקיק ניתן לפתח במבחנה על ידי לנתח את פרט, זקיקים מראש Antral מאוחר שלמים, שניתן לגדל בשלב preovulatory בתרבות, תוך שמירה על המבנה התל-ממדי שלהם. השימוש בזקיקים שלמים לטכניקת תרבות זו שומר על מערכת היחסים בין המרכיבים השונים זקיקים כפי שמתרחש בגוף חי. תימערכת התרבות שלהם ניתן להשתמש כדי להשיג ביציות שיכולות לתמוך הפריה והתפתחות עובר שלאחר מכן. ניתן גם להשיג ביציות Fertilizable משחלות בילוד עכבר באמצעות פרוטוקול ראשוני תרבות הרבה כפי שתואר כאן, ואחריו שלב שני שבמהלכו מתחמי תא הביצית-granulosa גדלים במבחנה 1. מערכות אחרות המשמשות לעתים קרובות למדי היום כוללות תרבות של זקיקים או רקמה שחלה שכבר הגלום בחומר כגון הידרוג&#39;ל אלגינט, כדי לספק תמיכה (ראה, למשל, Tagler et al. 13). חלק גדול מהמוקד של פיתוח שיטה עכשיו הוא לשפר טכניקות תרבות לשחלות וזקיקים של יונקים גדולים, במטרה לטווח הארוך של קבלת ביציות fertilisable מזקיקים ראשוניים מתוך מגוון רחב של מינים, כולל בני אדם. בכל זמן נתון, השחלות יונקים מכילות זקיקים בטווח של שלבי התפתחות, עם interactions בין זקיקים המשפיעים על הוויסות שלהם. היבט זה של תפקוד השחלות הוא הבין היטב וקשה לבחון in vivo. השיטה הסופית המתוארת כאן משתמשת במערכות שיתוף תרבות לתמיכה בפיתוח של שלבים שונים של זקיקים במבחנה. במידת הצורך, ניתן מראש טופלו רקמות אחד או שניהם in vivo או במבחנה לתרבות המשותפת לפני. מערכות שיתוף התרבות כגון זו מספקות דרך אידיאלית שבי לבחון אינטראקציות זקיק זקיק, למשל איך גדל, זקיקי Antral להשפיע על בריכת הזקיק הקדמונית, היבטים של ביולוגיה השחלות שהוכיחו קשה לבחון עד עכשיו. טכניקות תרבות השחלה כולם פשוטות למדי, אם כי נדרשת נתיחה זהירה, כדי למנוע נזק לרקמות מקריות. Dissection של זקיקים בודדים הוא טכניקה מיוחדת, הדורשת תרגול חוזר ונשנה לפני יכולים להיות גזורים מזקיקים בשלב הנכון משחלת שלמות וללא ניזק. זה קריטילנתח את זקיקים בודדים בזהירות, או נזק שנגרם במהלך פרוטוקול הנתיחה יכול לגרום למות זקיק בתקופת התרבות שלאחר מכן. איפה זקיקים ממוקמים ישירות לתוך הבאר של צלחות microtiter, חשוב להשתמש פלסטיק התרבות הלא-רקמה שטופל רק, כדי למזער את ציפוי של תאי thecal על הפלסטיק: אם נעשה שימוש בplasticware טופל בתרבית רקמה, הזקיקים יצרפו ל בסיס של הבאר וקרע ככל שהם גדלים. לכל עבודת שיתוף התרבות, רקמות חייבות להיות ממוקמות ישירות בקשר אחד עם השני. הבינוני שפורט לעיל לשימוש בטכניקת תרבות הזקיק כולל תוספת של סרום עכבר. אפשר להחליף את סרום העכבר עם סרום שור עוברי, אבל רק מדי פעם קבוצות של סרה כזה יתמכו באופן מלא התפתחות זקיק לבמה preovulatory, עם סדרת בדיקות הנדרשות לזהות מקורות מתאימים. אצווה-בדיקה של FSH כן, מומלצת, כUni הבינלאומיts שבו FSH מוערך לתאם רק בגסות לצמיחת זקיק במבחנה. אם קרע הזקיק מתרחש באופן שגרתי במהלך תקופת התרבות, תשקול להחליף את חומצה אסקורבית מניות עם קבוצה חדשה. הטכניקות אינן דורשות ציוד מיוחד במיוחד אחר מאשר מיקרוסקופים לנתח וחממות תרבית רקמה, למרות ששימוש בזרימה למינרית וטכניקה סטרילית טובה לאפשר לזקיקים בשחלות ללהיות מתורבת בהיעדר האנטיביוטיקה, כמו בשיטות שתוארו כאן. זה יכול להיות מועיל, כדי למנוע כל השפעה מזיקה פוטנציאל של אנטיביוטיקה בביציות, במיוחד אם הם להפריה הבאה תרבות. שבו לא ניתן לעבוד בסביבת סטרילית, רצוי להוסיף אנטיביוטיקה לתקשורת לנתיחה והתרבות.

השחלה היונקים מורכבת מהאספקה ​​של נקבת חיים של ביציות, כל כלול בתוך זקיק בשחלה. הזקיקים נוצרים לפני הלידה במנוחה, שלב ראשוני: פעם אחת בריכת הזקיק הוקמה, יש תנועה מתמדת והדרגתית של זקיקים מהקדמוניים לתוך בריכת הזקיק גדלה. כאשר זקיקים מתחילים לגדול, הם מפתחים בשלבים הראשוניים, שניוניים, preantral ולאחר מכן Antral, עד שהם מגיעים preovulatory, או Graafian, שלב. יש רק ביציות מזקיקי preovulatory יכולת התפתחותית מלאה, מסוגל לתמוך בהתפתחות עוברית לטווח, אם מופרה. השחלה כבר זמן רב ידוע לפתח באופן פיסיולוגי מאוד במבחנה. זה עשוי להיות בגלל כל זקיק בשחלה המכיל בתוכו את התאים דרושים כדי לתמוך בביצית מהבמה בשלה (ובשלב זה הוא לא הצליח להשלים את חלוקת meiotic) ועד לtהוא שלב בחינה התפתחותית מוסמך (ובשלב זה יכול לתמוך בהשלמת מיוזה, הפריה וההתפתחות של עובר וכתוצאה מכך לטווח מלא). הטבע הפיזיולוגי של התפתחות השחלה במבחנה הוביל לשימוש הנרחב בטכניקות תרבות השחלה. כתוצאה מכך, במבחנה השיטות נעשו שימוש כדי לחקור הרגולציה של פיתוח השחלה, פתולוגיה השחלות (למשל זה של תסמונת שחלות פוליציסטיות, PCOS), בדיקה של כמה השחלות / ביציות מושפעות מחשיפה לכימיקלים, וגם במטרה המעשית של קבלת ביציות fertilizable מזקיקים בשחלות בראשיתי. עד כה, האחרון הושג רק באמצעות רקמת השחלה עכבר 1, למרות שטכניקות תרבות באמצעות זקיקים מיונקים גדולים, כולל בני אדם, השתפרו מאוד בשנים האחרונות 2,3. אנו מתארים כאן כמה שיטות תרבות באמצעות רקמת השחלה עכבר. Metho הראשוןד משתמש השחלות עכבר בילוד כל, ותומך בהיווצרות וההתפתחות המוקדמת של זקיקים בראשיתי 4. מערכת השנייה תומכת בצמיחה של זקיקים בודדים, ללא פגע משחלות preantral מאוחר לבמה preovulatory; שימוש בטכניקה זו, יכול להיות מתורבת זקיקים בנפרד, או בזוגות 5,6. לבסוף, אנו מתארים מערכת שיתוף תרבות, המשלבים את שתי הטכניקות הראשונות בשיטה המאפשרת חקירה של האינטראקציות בין גובר וזקיקים בשחלות קדמוניים 7. תרבות של זקיקים בשחלות בשלמות פרט מאפשרת צמיחת זקיק שתיקבע ממדידות זקיק יומיות בתקופת התרבות, תוך ניתוח בינוני מאפשר חקירה של זקיק / ייצור הורמון השחלה. ניתן להשיג ניתוחי רקמות נוספים על ידי אוסף של זקיקים או רקמת השחלה בסוף התרבות, לניתוחי immunohistological / היסטולוגית או לעיבוד שלאחר מכן למשל להשיגmRNA או חלבונים.

<table><tbody><tr><td>Leibowitz L15</td><td>Invitrogen</td><td>11415049</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM</td><td>Invitrogen</td><td>22571020</td><td>Supplied as sodium bicarbonate buffered (2,200 mg/L)</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>For dissection medium</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3311</td><td>For culture medium</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>For coating glass pipettes</td></tr><tr><td>Mouse serum</td><td>-</td><td>-</td><td>Collected from cardiac puncture</td></tr><tr><td>FSH</td><td>Merck Serono</td><td>Gonal F</td><td>Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10&amp;micro;l in &amp;alpha;MEM and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td>Make up stock of 5mg/ml in &amp;alpha;MEM and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Silicon oil</td><td>VWR</td><td>630064V</td><td>Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS</td></tr><tr><td>Syringe filters (25 mm, 0.2 &amp;micro;m)</td><td>Greiner</td><td>16532K</td><td>Cellulose acetate filter for filtering larger (&amp;gt;5 ml) volumes of medium.</td></tr><tr><td>Syringe filters (13 mm, 0.2 &amp;micro;m)</td><td>Iwaki</td><td>3032-013</td><td>Cellulose acetate filter for filtering smaller (&amp;lt;5 ml) volumes of medium</td></tr><tr><td>Syringe filters (25 mm, 0.45 &amp;micro;m)</td><td>Iwaki</td><td>2053-025</td><td>Cellulose acetate filter for filtering oil.</td></tr><tr><td>Sterile tubes</td><td>Greiner</td><td>187261</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>96-well round bottom plate</td><td>Iwaki</td><td>3875-096</td><td>Use only non-tissue culture treated plates</td></tr><tr><td>96-well flat bottomed well</td><td>Iwaki</td><td>3860-096</td><td>Use only non-tissue culture treated plates</td></tr><tr><td>Whatman nucleopore membranes</td><td>Camlab</td><td>WN/110414</td><td>Use shiny surface up, polycarbonate, 13 mm diameter, 8.0 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>Insulin needles</td><td>BD medical supplies</td><td>037-7606</td><td>0.33 mm (29 G) + 1 ml</td></tr><tr><td>Glass embryo dishes</td><td>VWR</td><td>720-0579</td><td>Sterilize, then warm before use.</td></tr><tr><td>Glass pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>10209381</td><td>BSA coated before use.</td></tr><tr><td>Gel tips</td><td>AlphaLabs</td><td>LW1103</td><td></td></tr><tr><td>Acupuncture needles</td><td>Acumedic LTD</td><td>30 mm x 0.25 Type C</td><td></td></tr><tr><td>Bouin&amp;rsquo;s fixative</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT5014-120ml</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml polypropylene tubes</td><td>Greiner BioOne</td><td>616201</td><td></td></tr></tbody></table>

culture and co-culture of mouse ovaries and ovarian follicles

השחלה היונקים מורכבת של זקיקים בשחלות, כל זקיק המורכב מביצית אחת מוקפת בתאים סומטיים granulosa, מצורף יחד בתוך קרום במרתף. בריכה סופית של זקיקים הוא הניחה במהלך התפתחות עוברית, כאשר ביציות במעצר meiotic ליצור קשר קרוב עם תאי granulosa שטוחים, ויצרו זקיקים בראשיתי. על ידי או זמן קצר לאחר לידה, השחלות יונקים מכילות אספקה ​​של חייהם של זקיקים בראשיתי, שממנו נקודה זו ואילך יש שחרור קבוע של זקיקים לתוך בריכת הזקיקים גדלה. השחלה היא נוחה במיוחד להתפתחות במבחנה, עם זקיקים גדלו באופן פיסיולוגי מאוד בתרבות. עבודה זו מתארת ​​את התרבות של השחלות בילוד כל המכילות זקיקים בראשיתי, והתרבות של זקיקים בשחלות בודדים, שיטה שיכול לתמוך בפיתוח של זקיקים מבוגרים ועד לpreovuשלב latory, לאחר שהביציות שלהם מסוגל לעבור הפריה חוץ גופית. העבודה המתוארת כאן משתמשת במערכות תרבות כדי לקבוע כיצד השחלה מושפעת מחשיפה לתרכובות חיצוניות. גם אנו מתארים מערכת שיתוף תרבות, המאפשרת חקירה של האינטראקציות המתרחשות בין זקיקים גדלו והבריכה שאינו הצומחת של זקיקים בראשיתי.

איור 1 מציג תמונות של השחלות וזקיקים בתחילת, ובמהלך, נהלי התרבות. איור 2 מציג תוצאות נציג של השחלות בילוד (כאן, השחלות מגורים שנולדו) נחשפו לרעלי רבייה במהלך התרבות. השחלות בילוד היו בתרבית במשך 6 ימים, ונחשפו לתרופה כימותרפית, או ציספלטין או דוקסורוביצין, ביום 2 של התרבות. בסופו של התרבות, השחלות היו קבועות, מעובד להיסטולוגיה, ושחלות אז בדקו כדי לקבוע את מספר זקיקים בשחלות בריאים ולא בריאים 4. לחלופין, ניתן לקבל הערכה מהירה יותר של זקיקים גדלו מוקדם מהתרבות של שברי השחלות, באמצעות השחלות מעכבר להביע סמן פלואורסצנטי ביצית ספציפית 10. במהלך התרבות של זקיקים בודדים, צמיחת זקיק ניתן ללמוד בקלות על ידי מדידות יומיות ברחוב ללא מוצאture תקופה. איור 3 מציג תוצאות נציג של הצמיחה של זקיקים בתרבית בנוכחות או עדר של הורמוני gonadotrophin הורמון מגרים זקיק (FSH) והורמון luteinizing (LH) 5. זקיק זקיק או זקיק בשחלה-שיתוף תרבות יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות בין זקיקים. בהתאם לרקמות והעיבוד, ניתן לקבל תמונות באמצעות בהיר שדה, הקרינה או מיקרוסקופים confocal. איור 4 מציג תוצאות נציג של תמונות משיתוף תרבויות כגון, בוחנים סוגים שונים של תאים מעורבים בתקשורת זקיק זקיק, כוללים אנדותל ותאים עצביים 7. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" width="650" /> איור 1: (א) Photomicrograph של השחלה יילודים המתקבלת מעכבר ביום הלידה, הניח<html> על קרום פוליקרבונט. (ב) Photomicrograph של טרי גזור זקיק בשחלה בריא, עם רוב של הרקמות המקיפות את סטרומה גזור משם. (C) Photomicrographs של התרבות המשותפת של שני זקיקים בשחלות בשלושה הימים הראשונים של תרבות, המראה את הקשר ההדוק שנוצר בין שני הזקיקים כתמורת התרבות (Ci: היום הראשון של תרבות; כת&quot;ש: יום שני של תרבות; Ciii : יום שלישי של תרבות). לשכפל מאל ספירס et. 11 (ד) Photomicrograph של זקיק preantral שיתוף תרבותי ושחלה בילוד לאחר יומיים של התרבות. תמונה מראה את הזקיק הופך כמוס על ידי השחלה. חץ מראה זקיק preantral. תמונה מתוך ד&quot;ר פדריקה לופס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> &quot;Src =&quot; תרשים 2 &quot;/&gt; / קבצים / ftp_upload / 52,458 / 52458fig2.jpg איור 2: השפעה של התרופות כימותרפיות ציספלטין ודוקסורוביצין על השחלות בתרבית בילוד ציספלטין ודוקסורוביצין שני להוביל לאובדן של בריאות זקיק וירידה במספרי זקיק.. ציספלטין (); (ב) דוקסורוביצין: (i) אחוז מהזקיקים בריאים (ברור); וכן (ii) מספר כולל של זקיקים (מוצל) בכל השחלה. ברים לציין מתכוונים + SEM; n = 5 עבור כל הקבוצות, כוכבים לציין הבדלים משמעותיים ביחס לשליטה (* p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001). לשכפל מאל מורגן et. 4 <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig3.jpg" width="400" /> איור 3:. צמיחת שיעורים של זקיקים נחשפו לסביבות שונות gonadotrophin ערכים הם ממוצעים ± SEM (n ≥16 לכל קבוצה). חץ מציין את תחילתו של antraהיווצרות l בכל קבוצות gonadotrophin. לשכפל מאל Murray et. 5 <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" width="650" /> איור 4: תמונות משיתוף תרבויות זקיק זקיק ושחלת זקיק, המציגות אינטראקציות זקיק זקיק מיקרוסקופ Confocal של חלבון פלואורסצנטי ירוק זקיק (GFP) וwild-type (WT) זקיק לאחר שיתוף התרבות ((). ביטוי של GFP מוצג כאן בלבן), עם תהליכים מזקיק GFP מוצג משתרע על פני זקיק WT. חתך דרך GFP / מורכב זקיק WT הבא שיתוף תרבות (B), שהראה כי תהליכי GFP (ירוק) משקר הזקיק הסמוך הסמוך לlamina הבסיס של זקיק WT. השחלה (C) הילודים WT הבא תרבות עם מראש Antral זקיק, שהראה כי תאי GFP ותהליכים תאיים (ירוק) להביע GFP היגרודרך interstitum השחלות של השחלה בילוד. GFP / מורכב זקיק (D) WT המכיל תאי אנדותל, שמוצגים על ידי ביטוי של CD31 אנדותל סמן תא (אדום). GFP (E) / מורכב זקיק WT המכיל תאים עצביים, שמוצגים על ידי ביטוי של טובולין בטא סמן העצבי III (ראה כאן כאדום, או צהוב אם עם GFP-פעמיים שכותרתו, ירוקות). מורכב (F) YFP / WT זקיק, שבו YFP מתייחס לזקיק מעכבר Thy1-YFP שיש ביטוי מזדמן של חלבון פלואורסצנטי הצהוב (YFP: צהוב) בתת-קבוצה של תאים עצביים 9, שהראה כי תאי עצב להאריך מזקיק YFP. ברים 50 מיקרומטר (A, B, D), 100 מיקרומטר (C, E, F), 100 מיקרומטר (הבלעה ב), 10 מיקרומטר (הבלעה בC), 15 מיקרומטר (הבלעה בD). לשכפל מאל Campbell et. 7 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של fi זה</a>תרשים.

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles at JoVE.com

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

פרוטוקול זה מתאר את התרבות העיקרית / שיתוף התרבות של רקמת השחלה עכבר, באמצעות השחלות מעכברים בילוד וזקיקים בשחלות בודדות מעכברים לפני גיל בגרות מיניים. טכניקות התרבות לתמוך בפיתוח באופן פיסיולוגי מאוד, המאפשר חקירה של ההשפעה של סוכנים חיצוניים בשחלה, ושל יחסי גומלין בין זקיקים בשחלות.

תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

culture-and-co-culture-of-mouse-ovaries-and-ovarian-follicles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

22.6K Views.  University of Edinburgh.  פרוטוקול זה מתאר את התרבות העיקרית / שיתוף התרבות של רקמת השחלה עכבר, באמצעות השחלות מעכברים בילוד וזקיקים בשחלות בודדות מעכברים לפני גיל בגרות מיניים. טכניקות התרבות לתמוך בפיתוח באופן פיסיולוגי מאוד, המאפשר חקירה של ההשפעה של סוכנים חיצ?...

Video: Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

שיטה Encapsulation השחלות זקיק ותרבות מערכת 3 מתכלה Proteolytically מימדי

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Bioengineering

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

איחזור של ביציות עכבר

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Biology

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

בידוד ואפיון של עכבר Antral ביציות בהתבסס על ארגון הכרומטין nucleolar

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

במבחנה צמיחה של העכבר זקיקים Preantral תחת Microgravity מדומה

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

תרביות רקמה השחלות כדי לחזות תופעות העכבר השחלה

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.

ספירה מדויקת של זקיקים בשחלות עכברים למבוגרים

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

תרבית רקמת קליפת המוח השחלות

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Application of a Novel Hyaluronan Hydrogel for Three-Dimensional Follicle Culture and Methodology for Mouse Ovarian Follicle Cryopreservation

The 3-D architecture of the ovarian follicle and the complex interactions between somatic cell components and the oocyte that are necessary for cytoplasmic and nuclear maturation are difficult to maintain in conventional two-dimensional (2-D) culture systems. We describe a novel 3-D culture model using a tyramine-linked hyaluronan hydrogel for encapsulation and culture of mouse ovarian follicles. The hyaluronan encapsulation technique allows 3-D growth of follicles and retention of trophic factors in close proximity to the developing follicles. This hydrogel is highly versatile and can be applied to isolated follicles as well as ovarian tissue fragments. The viscoelastic properties of the HA gel enable adjustment of rigidity as well as moldability based on gel concentration. Preantral follicles developing in this culture model are able to complete meiotic maturation within 10-12 days of culture and ovulate a metaphase II oocyte upon triggering with hCG. This paper also details two approaches to ovarian follicle cryopreservation by vitrification.

This protocol describes a novel three-dimensional (3-D) culture model using a tyramine-linked hyaluronan hydrogel to encapsulate and culture preantral follicles from the mouse ovary. We also detail two approaches to ovarian follicle cryopreservation by vitrification.