Work was funded by MRC grant G1002118.

Tutto il lavoro degli animali è stato effettuato in conformità con le linee guida istituzionali su licenza dalla UK Home Office (numero di licenza del progetto PPL 60/1726 e 60/4026). Nota: animali Casa in conformità con i requisiti legali del Regno Unito in una luce 14 ore e 10 ore fotoperiodo scuro. Condurre esperimenti su animali con topi C57Bl6J wild type, topi Tau-GFP che hanno espressione ubiquitaria di proteina verde fluorescente (GFP) 8, e Thy1-YFP topi con espressione occasionale di proteina fluorescente gialla (YFP) in un sottogruppo di cellule neuronali 9: sia linee transgeniche sono stati allevati su uno sfondo C57Bl6J. 1. Condizioni di lavoro e di preparazione degli strumenti <ol><li> Eseguire tutta la preparazione media, dissezioni tessuto, e il lavoro cultura in una cappa a flusso laminare per garantire la sterilità: questo evita il requisito dell&#39;aggiunta di antibiotici ai media. </li><li> Consenti sempre media / piastre di coltura / stoviglie embrione equilibrareper almeno 1 ora, in un forno a 37 ° C (medio dissezione / piatti embrione) o 37 ° C, 5% CO 2 incubatore (terreno di coltura e piastre), prima dell&#39;uso. </li><li> Immergere pipette di vetro in soluzione allo 0,1% di albumina di siero bovino (BSA) per circa un&#39;ora, e poi lasciare asciugare. Tirate pipette nella fiamma di un becco Bunsen, piegando il vetro mentre lo fate, per la produzione di pipette di vetro curvato finemente disegnate. Dopo la pipetta è tirato, effettuare un taglio netto con un cutter vetro. Forno sterilizzazione a 160 ° C per circa 45 min. NOTA: Un negozio di queste pipette di vetro sarà necessario trasferire ovaie e follicoli. </li></ol> 2. Preparazione di dissezione e di cultura media <ol><li> Preparare Dissection media. <ol><li> Sciogliere 3 mg / ml BSA in Leibowitz L15 medio e filtro sterilizzare attraverso un 0,2 micron pori 25 mm Filtro diametro. </li></ol></li><li> Neonatale Ovaio Cultura. <ol><li> Per preparare mezzo per la cultura ovaio neonatale, fare 1 ml di terreno per each dell&#39;ovaio che saranno coltivate. Sciogliere 3 mg / ml BSA in α-Minimal Essential supporti (αMEM) e filtro sterilizzare attraverso un 0,2 micron pori da 13 mm filtro di diametro in una provetta sterile. </li><li> Per preparare piatti per la cultura ovaio neonatale, aggiungere 1 ml di terreno di coltura neonatale ovaio in ogni pozzetto (un ovaio per pozzetto) di un 24-pozzetti. Utilizzando pinze sterili orologeria, posizionare una membrana di policarbonato sulla parte superiore del mezzo in ciascuna superficie ben, lucido. UV sterilizzare le membrane prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Cultura follicolo. <ol><li> Per preparare mezzo per la cultura follicolo, supplemento α-Minimal media Essential con 1 UI / ml ricombinante follicolo ormone stimolante, 5 mg / ml di acido ascorbico e il 5% v / v di siero ottenuti da topi femmina adulti. Filtro sterilizzare attraverso un 0,2 micron pori da 13 mm filtro di diametro in una provetta sterile. </li><li> Filtro sterilizzare olio siliconico attraverso un filtro di diametro 0,45 micron pori, 25 mm, in una provetta sterile. </li><li> Per preparare plaTES, mettere 30 gocce microlitri di follicolo terreno di coltura in ciascun pozzetto di una cultura non-tessuto trattato 96 pozzetti Micropiastra tutto bene, utilizzando solo la prima riga di ogni disco (per permettere follicoli di essere spostati in nuovi file ogni giorno oltre il periodo di coltura). Sovrapporre accuratamente media con 70 ml di olio di silicone sterilizzato, per prevenire evaporazione media. </li></ol></li><li> Follicolo-ovaio Co-cultura. <ol><li> Preparare mezzo per follicolo-ovaio co-cultura per la cultura follicolo al precedente punto 2.3.1, che costituiscono 1 ml di media per ogni co-coltura follicolo-ovaio in fase di realizzazione. </li><li> Per preparare piastre, aggiungere 1 ml di terreno in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Utilizzando pinze sterili orologeria, posizionare una membrana Nucleopore sulla parte superiore del mezzo in ciascuna superficie ben, lucido. UV sterilizzare le membrane prima dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 3. neonatale Ovaia Dissection e Cultura <ol><li> Mettere 1 ml di terreno dissezione in ogni piatto embrione di vetro sterile. </li> &lt;li&gt; Cull cuccioli neonati topo di età compresa tra 0 e postnatale giorno 5, abbattimento per decapitazione in base alle normative IT Home Office. </li><li> Afferrare la pelle che ricopre la parete addominale con un paio di belle pinze dissezione e fare una grande incisione nella parete pelle e del corpo. Aprire il dell&#39;incisione così l&#39;intero addome è esposto. La vescica è solitamente gonfio in questa fase e può essere forato per rendere più facile la dissezione. </li><li> Spostare le budella fuori del modo con pinze orologiai. Seguire le corna uterine dalla vescica fino al rene su ogni lato. L&#39;ovario si trova appena al di sotto del rene nella parte superiore dell&#39;utero e apparirà come una struttura cloud come sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Afferrare l&#39;ovario delicatamente con una pinza orologiaio, e usare le forbici per recidere il suo attaccamento verso l&#39;utero. Trasferire la coppia di ovaie in piatti di embrioni contenenti medio dissezione pre-riscaldato. </li><li> Effettuare dissezione multa di ovaie al microscopio dissezione su una sta riscaldatage (37 ° C). Utilizzare aghi da insulina per tagliare via il sacco della borsa e il materiale in eccesso compreso le tube di Falloppio, fino a che solo l&#39;ovaio rimane. </li><li> Trasferire ciascun ovaio nel pozzetto di una piastra di coltura preparato al passo 2.2.2, usando una pipetta di vetro curvo finemente disegnato, un ovaio sopra l&#39;membrana (Figura 1A). Cultura a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Cambiare la media ogni due giorni. Utilizzare una pipetta di scambiare 50% del mezzo in ogni pozzetto per pre-gasati fresco medio: luogo la punta della pipetta sul bordo del pozzo di mezzo per non disturbare la membrana. </li><li> Mantenere le culture fino a 6 giorni. </li><li> Al termine della coltura, congelamento medie e fissare o congelare ovaie dopo un breve lavaggio in PBS, come richiesto. <ol><li> Fissare ovaie nelle fissante di Bouin per 90 minuti per l&#39;analisi istologica, o in 10% formalina tamponata neutra per 90 minuti per l&#39;analisi immunoistochimica. Snap congelare ovaie mettendo in tessutoun tubo di polipropilene, ponendo la provetta in ghiaccio secco per 5-10 minuti prima del congelamento a -70 ° C per la successiva estrazione di proteine ​​o di mRNA. </li></ol></li></ol> 4. follicolo Dissection e Cultura <ol><li> Cull 19-23 giorni vecchi topi di sesso femminile e isolare le ovaie. Bagnare il pelo con il 70% di etanolo prima di effettuare qualsiasi incisioni. Pizzica la pelle con pinze ad attacco smussato e fare una grande incisione nell&#39;addome con le forbici dissezione, penetrando attraverso sia la pelle e la parete del corpo. </li><li> Spostare l&#39;intestino fuori strada utilizzando una serie di strumenti di dissezione più fine e individuare l&#39;utero. Seguire l&#39;utero fino alla ovaio che si trova sotto il rene su ogni lato. </li><li> Afferrare delicatamente il ovaio utilizzando un paio di pinze orologiaio, recidere l&#39;attaccamento ovaie all&#39;utero con belle forbici dissezione. Evitare di raccogliere troppo del cuscinetto adiposo ovarico. Raccogliere le ovaie e trasferire in un embrione piatti contenenti medio dissezione pre-riscaldato. </li><li> Respostare la borsa ovarica con aghi di insulina per tagliare via il sacco della borsa e il materiale in eccesso compreso le tube di Falloppio, fino a che solo l&#39;ovaio rimane. Circa dimezzare ogni ovaio utilizzando aghi da insulina. </li><li> Trasferire accuratamente ciascun ovaio mezzo in un vetrino di orologio individuale contenente 1 ml di mezzo dissezione. Coprire ogni vetro d&#39;orologio con un vetrino per evitare l&#39;evaporazione del mezzo e per garantire la sterilità. </li><li> Vetri da orologio Conservare contenenti metà ovariche in un forno a 37 ° C fino al momento dell&#39;uso, ma eseguire la dissezione successivo passo appena possibile. Gettare il tessuto conservato in questo modo per più di un&#39;ora. </li><li> Vetro d&#39;orologio Transfer contenente un mezzo ovaio a una fase microscopio riscaldata 37 ° C in una cappa a flusso laminare. Circa sezionare ovaio in grossi pezzi con due aghi di insulina, al fine di individuare follicoli pre-antrali fine come segue: esse conterranno 2-3 strati di cellule della granulosa e hanno un diametro di circa 180-200 micron. </li><li> Sezionare manualmente qualsiasi ifollicoli dentified utilizzando un ago da insulina e un 30 x 0,25 millimetri ago di agopuntura che è stato fissato in un supporto dell&#39;ago. Fare attenzione a rimuovere la maggior parte dello stroma circostante, ma non danneggiare la lamina basale di follicoli (vedere Figura 1B). </li><li> Utilizzare una pipetta di vetro curvo finemente disegnati per trasferire accuratamente follicoli sezionati in un vetro da orologio raccolta contenente medio dissezione pre-riscaldato. Fare attenzione a tenere i follicoli all&#39;interno della sezione di calibro sottile di pipetta per evitare di perdere i follicoli. </li><li> Follicoli misurare con precisione utilizzando un reticolo oculare calibrato inserito in un microscopio da dissezione. </li><li> Selezionare follicoli per la cultura solo se misurano 190 ± 10 micron di diametro. Ulteriori selezionare solo, follicoli sferici sani per la cultura; questi saranno trasparente, senza zone atresici scure, e hanno una lamina basale intatta, insieme ad alcuni tessuti durale allegato: scartare le follicoli che non si adattano a questa descrizione. Un rendimento compreso tra 10-15 follicoli per dell&#39;ovaio è buono. </li><li> Utilizzare una pipetta di vetro curvo finemente disegnato per trasferire un singolo follicolo nel pozzo di una piastra come al precedente punto 2.3.3. Posizionare accuratamente il follicolo nel fondo del pozzo (e non nello strato superiore dell&#39;olio). Cultura a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Follicoli cultura per 6 giorni spostano follicoli in un mezzo fresco e contenente tutti i giorni. <ol><li> Preparare la riga successiva nella piastra a 96 così come in piastra preparazione al passo 2.3.3. Piastra di ritorno per l&#39;incubatore per almeno un&#39;ora, per raggiungere l&#39;equilibrio. Trasferire follicoli nei pozzetti freschi di media, utilizzando una pipetta di vetro finemente disegnato. </li><li> Se in qualsiasi punto della coltura follicoli devono essere lasciati per due giorni prima di passare in mezzo fresco, posizionare ogni follicolo in un minimo di 60 microlitri (anziché 30 ml) di mezzo di coltura goccioline follicolo. </li></ol></li><li> Per raccogliere i dati sulla crescita del follicolo, misurare i follicoli quotidiano, utilizzando un eyepiece reticolo montato in un microscopio da dissezione. Lo strato olio alterare le misurazioni del diametro del follicolo, quindi calcolare il coefficiente di calibrazione per il set-up. </li><li> Al termine della coltura, congelamento medie e fissare o congelare tessuto per successive analisi, come nel precedente punto 3.10. </li><li> Follicolo-follicolo Co-cultura. <ol><li> Cultura due follicoli insieme, per indagare le interazioni tra i follicoli. La cultura come sopra, ma posizionare due follicoli side-by-side, in contatto, in un pozzo. </li><li> Mettere 100 gocce microlitri di follicolo terreno di coltura in ciascun pozzetto di una cultura non-tessuto trattato 96 pozzetti Micropiastra piatto ben, sovrapponendo media con 100 ml di olio di silicone sterilizzato. Non trasferire follicoli in pozzi freschi come al punto 4.13, ma invece di utilizzare una punta di gel bene a cambiare il 50% del terreno di ogni altro giorno. </li><li> Per identificare origini tessuto all&#39;interno della co-coltura, co-coltura follicoli ciascuna da una fonte genetico diverso, ad esempio one dall&#39;ovaio di un tipo di mouse selvaggio, e l&#39;altro dalle ovaie di un mouse con espressione ubiquitaria di GFP. Se si utilizza GFP o YFP tessuto, minimizzare l&#39;esposizione del tessuto alla luce il più possibile, durante la coltura, e attraverso i passi fissaggio / elaborazione successivi. NOTA: E &#39;normale per i due follicoli di crescere insieme in un unico, unità&#39; a due follicolo &#39;(vedi Figura 1C). </li></ol></li></ol> 5. follicolo-ovaio co-culture <ol><li> Sezionare ovaie e follicoli fuori come nelle sezioni 3 e 4 di cui sopra. </li><li> Inserire un ovaio neonatale in cima ad una membrana, in una piastra preparata come al precedente punto 2.4.2. Posizionare accuratamente un singolo follicolo in contatto con un polo dell&#39;ovaio neonatale, utilizzando una pipetta di vetro curvo finemente disegnato. Cultura a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 5 giorni. </li><li> Per distinguere tra l&#39;origine tessuto all&#39;interno della co-coltura, utilizzare ovaie e follicoli di due diversi cosìurces, ad esempio uno da un tipo di topo selvatico, e uno da un mouse con espressione ubiquitaria di GFP. </li><li> Sostituire 500 ml di media al giorno, come al precedente punto 3.8, ma con terreno di coltura follicolo. Durante co-coltura, il follicolo spesso viene incapsulato dall&#39;ovaio (Figura 1D). </li><li> Al termine della coltura, congelamento medie e fissare o congelare tessuto per successive analisi, come nel precedente punto 3.10. </li></ol> 6. Fissazione, Immunocytochemistry e Imaging di Tissue Colta <ol><li> Alla fine della coltura, lavare tessuti in PBS e trasferimento 100 microlitri (follicolo) o 1 ml (ovaio) e 10% formalina tamponata neutra, e fissare per 1 ora su ghiaccio. Spostarsi attraverso 3 lavaggi di 1x PBS a 4 ° C. </li><li> Per immunocitochimica su follicoli, trasferimento tra pozzetti di una 96 pozzetti Micropiastra andata bene con una pipetta di vetro curvo finemente disegnati, con ogni ben contenenti lavaggi o trattamenti diversi. </li><li> Per immunocitochimica su Ovaries (o dell&#39;ovaio follicolo-co-culture), incorporare nel 4% agarosio gel e la sezione a 50 micron con un vibrotome. Sezioni Float nei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti di applicare lavaggi o trattamenti, rimuovendo con una pipetta. </li><li> Per l&#39;imaging: trasferire le sezioni agarosio alle diapositive di vetro piano e montare con mezzo di montaggio; o follicoli di trasferimento (o complessi follicolo-follicolo) a vetrini cavità e montare con non indurente mezzo di montaggio. Esemplari immagine utilizzando un microscopio confocale. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Descriviamo qui i vari sistemi di coltura che possono essere utilizzati per sostenere lo sviluppo dei follicoli ovarici topo in vitro, usando intere ovaie neonatali che contengono solo le prime fasi del follicolo, singoli follicoli ovarici preantrali e anche co-culture dei due tessuti. Cultura della neonatale topo ovaie supporta primo sviluppo ovarico, iniziazione crescita particolarmente follicolo fino alla fase del follicolo secondario. Una gamma di età dei topi neonati può essere utilizzato per queste culture, a seconda delle fasi di sviluppo di interesse. Se le ovaie sono ottenuti da topi appena nati, la formazione del follicolo sarà in corso, ma non è ancora completa: la cultura sarà almeno in parte sostenere la formazione del follicolo continua seguita da una crescita del follicolo. In alternativa, l&#39;uso di ovaie di topi circa quattro-cinque giorni di età (da cui la formazione tempo follicolo è già complete) comporta cultura di un maggior numero di folli primordiale e crescenteCles 12. Aspetti benefici della tecnica specifica qui descritto comprendono l&#39;uso di membrane di policarbonato galleggianti, che permettono una maggiore ossigenazione dei tessuti, e coltura in un mezzo di base formato unicamente αMEM e BSA, evitando l&#39;uso di additivi non definiti come siero. Culture dell&#39;intero ovaie non sembra sostenere lo sviluppo oltre la fase follicolo secondario, con conseguente sviluppo richiede una modifica nella tecnica, come la dissezione di complessi cellule follicolo-granulosa dalla coltura ovaio neonatale 1. Fasi successive di sviluppo del follicolo possono essere sviluppate in vitro da dissezione out individuale, intatti follicoli pre-antrali fine, che può essere coltivata alla fase preovulatoria nella cultura, pur mantenendo la loro struttura tridimensionale. L&#39;uso di follicoli intatti per questa tecnica di coltura mantiene il rapporto tra le diverse componenti follicolari come avviene in vivo. This sistema di coltura può essere utilizzato per ottenere ovociti che possono sostenere la fecondazione e il successivo sviluppo embrionale. Ovociti fertilizable possono anche essere ottenuti da topi ovaie neonatali utilizzano un protocollo di coltura iniziale quanto qui descritto, seguita da una seconda fase in cui i complessi ovocita-cellule della granulosa sono coltivate in vitro 1. Altri sistemi utilizzati abbastanza frequentemente oggi includono cultura follicoli o tessuto ovarico che è stato incapsulato in un materiale come idrogel alginato, per fornire supporto (vedere, per esempio, Tagler et al. 13). Gran parte del centro di sviluppo del metodo ora è quello di migliorare le tecniche di coltura per le ovaie e follicoli di mammiferi più grandi, con l&#39;obiettivo a lungo termine di ottenere ovociti concimabile di follicoli primordiali da una gamma di specie, compresi gli esseri umani. In qualsiasi momento, ovaie dei mammiferi contengono follicoli in una serie di fasi di sviluppo, con interactions tra follicoli che interessano la loro regolamentazione. Questo aspetto della funzione ovarica è poco conosciuta e difficile da esaminare in vivo. L&#39;ultimo metodo descritto qui utilizza sistemi di co-coltura per sostenere lo sviluppo delle diverse fasi di follicoli in vitro. Se necessario, uno o entrambi i tessuti possono essere pre-trattati in vivo o in vitro prima della co-coltura. Sistemi di co-coltura di questo tipo forniscono un modo ideale per esaminare le interazioni follicolo-follicolo, per esempio come in crescita, follicoli antrali influenzano la piscina follicolo primordiale, aspetti della biologia ovarico che hanno dimostrato difficile da esaminare fino ad ora. Intere tecniche di coltura ovariche sono piuttosto semplici, anche se attenta dissezione è necessario per evitare danni ai tessuti accidentali. Dissezione dei singoli follicoli è una tecnica specializzata, che richiede pratica ripetuta prima di follicoli in fase di destra possono essere sezionati fuori dall&#39;ovaio integro e non danneggiato. E &#39;fondamentaleper sezionare i singoli follicoli con attenzione, o danni subiti durante il protocollo di dissezione può provocare la morte del follicolo durante il successivo periodo di coltura. Dove follicoli sono posti direttamente nel pozzetto di piastre di microtitolazione, è importante utilizzare solo plastiche coltura non-tessuti trattati, per minimizzare placcatura giù di cellule tecali sulle materie plastiche: se viene utilizzato coltura tissutale plasticware trattati, i follicoli si unisce al base del pozzo e della rottura durante la crescita. Per tutti i lavori di co-coltura, tessuti devono essere posti direttamente in contatto tra loro. Il mezzo sopra descritto per l&#39;uso nella tecnica di coltura follicolo comprende l&#39;aggiunta di siero di topo. È possibile sostituire il siero di topo con siero bovino fetale, ma soltanto lotti occasionali di tali sieri sosterrà pienamente lo sviluppo del follicolo alla fase preovulatoria, con batch test deve identificare fonti adatte. Batch-test di FSH è anche consigliabile, come Uni Internazionalets con cui FSH viene valutata correlato solo rozzamente per la crescita del follicolo in vitro. Se la rottura del follicolo si verifica regolarmente durante il periodo di cultura, di sostituire l&#39;acido ascorbico magazzino con un nuovo lotto. Le tecniche non richiedono attrezzature particolarmente specializzata diverso microscopi dissezione e incubatori coltura tissutale, anche se l&#39;uso di una cappa a flusso laminare sterile e buona tecnica permette follicoli ovarici per coltivate in assenza di antibiotici, come nei metodi qui descritti. Ciò può essere utile, per evitare qualsiasi potenziale effetto dannoso degli antibiotici sugli oociti, specialmente se devono essere fecondato seguente cultura. Qualora non sia possibile lavorare in un ambiente sterile, è consigliabile aggiungere antibiotici per la dissezione e la coltura.

L&#39;ovaio mammiferi si compone di fornitura a vita di una femmina di ovociti, ciascuno inserito in un follicolo ovarico. I follicoli sono formati prima della nascita al riposo, fase primordiale: una volta la piscina follicolo è stabilito, c&#39;è un movimento continuo e graduale follicoli dalla primordiale nella piscina follicoli in crescita. Come follicoli iniziano a crescere, si sviluppano attraverso le fasi primarie, secondarie, preantrali e poi antrali, fino a raggiungere il preovulatorio, o di Graaf, stage. Solo ovociti da follicoli preovulatory hanno piena capacità di sviluppo, in grado di supportare lo sviluppo embrionale a termine, se fecondato. L&#39;ovaio è nota da tempo per sviluppare in modo altamente fisiologica in vitro. Ciò è probabilmente dovuto ad ogni follicolo ovarico contiene al suo interno le cellule necessarie a sostenere un ovocita dalla fase immaturo (a questo punto non è in grado di completare la sua divisione meiotica) fino alla tegli fase evolutivamente competente (a questo punto può supportare pienamente il completamento della meiosi, fecondazione e sviluppo dell&#39;embrione risultante al termine). La natura fisiologica dello sviluppo dell&#39;ovaio in vitro ha portato l&#39;ampio uso di tecniche di coltura ovariche. Di conseguenza, i metodi in vitro sono stati utilizzati per studiare la regolazione dello sviluppo dell&#39;ovaio, patologia ovarica (ad esempio quello della sindrome dell&#39;ovaio policistico, PCOS), esame di come ovaie / ovociti sono influenzati dall&#39;esposizione a sostanze chimiche, e anche con l&#39;obiettivo concreto di ottenere ovociti fertilizable di follicoli ovarici primordiali. Ad oggi, il secondo è stato raggiunto solo con il mouse tessuto ovarico 1, anche se le tecniche di coltura utilizzando follicoli di grandi mammiferi, compreso l&#39;uomo, hanno notevolmente migliorato negli ultimi anni 2,3. Descriviamo qui diverse metodi di coltura utilizzando il mouse tessuto ovarico. Il primo method utilizza intere ovaie neonatali di topo, e sostiene la formazione e lo sviluppo precoce di follicoli primordiali 4. Il secondo sistema supporta la crescita dei singoli, intatte follicoli ovarici dal tardo preantrali alla fase preovulatoria; Usando questa tecnica, follicoli possono essere coltivati ​​singolarmente, o in coppia 5,6. Infine, si descrive un sistema di co-coltura, combinando le prime due tecniche in un metodo che permette di indagine delle interazioni tra crescita e follicoli ovarici primordiali 7. Cultura dei singoli follicoli ovarici intatti permette la crescita del follicolo da determinare da misure follicolo al giorno nel periodo di coltura, mentre l&#39;analisi di medio consente indagine follicolo / produzione di ormoni dell&#39;ovaio. Ulteriori analisi tissutali possono essere raggiunti da un insieme di follicoli o tessuto ovarico a fine coltura, per analisi istologiche / immunoistologici o per successive lavorazioni per esempio per otteneremRNA o proteine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:265px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Leibowitz L15</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">11415049</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">&#945;MEM</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">22571020</td>
			<td style="width:265px;">Supplied as sodium bicarbonate buffered (2200 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A9418</td>
			<td style="width:265px;">For dissection medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A3311</td>
			<td style="width:265px;">For culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A2153</td>
			<td style="width:265px;">For coating glass pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Mouse serum</td>
			<td style="width:159px;">-</td>
			<td style="width:151px;">-</td>
			<td style="width:265px;">Collected from cardiac puncture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">FSH</td>
			<td style="width:159px;">Merck Serono</td>
			<td style="width:151px;">Gonal F</td>
			<td style="width:265px;">Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10&#181;l in &#945;MEM and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A4034</td>
			<td style="width:265px;">Make up stock of 5mg/ml in &#945;MEM and store at -20&#176;C.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Silicon oil</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:151px;">630064V</td>
			<td style="width:265px;">Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Syringe filters (25mm, 0.2&#181;m)</td>
			<td style="width:159px;">Greiner</td>
			<td style="width:151px;">16532K</td>
			<td style="width:265px;">Cellulose acetate filter: for filtering larger (&#62; 5mls) volumes of medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Syringe filters (13mm, 0.2&#181;m)</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">3032-013</td>
			<td style="width:265px;">Cellulose acetate filter: for filtering smaller (&#60; 5mls) volumes of medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Syringe filters (25mm, 0.45&#181;m)</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">2053-025</td>
			<td style="width:265px;">Cellulose acetate filter: for filtering oil.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Sterile tubes</td>
			<td style="width:159px;">Greiner</td>
			<td style="width:151px;">187261</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">24 well plate</td>
			<td style="width:159px;">Greiner</td>
			<td style="width:151px;">662160</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">96 well round bottom plate</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">3875-096</td>
			<td style="width:265px;">Use only non-tissue culture treated plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">96 well flat bottomed well</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">3860-096</td>
			<td style="width:265px;">Use only non-tissue culture treated plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Whatman nucleopore membranes</td>
			<td style="width:159px;">Camlab</td>
			<td style="width:151px;">WN/110414</td>
			<td style="width:265px;">Use shiny surface up, polycarbonate, 13mm diameter, 8.0&#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Insulin needles</td>
			<td style="width:159px;">BD medical supplies</td>
			<td style="width:151px;">037-7606</td>
			<td style="width:265px;">0.33mm (29G) +1ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Glass embryo dishes</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:151px;">720-0579</td>
			<td style="width:265px;">Sterilise then warm before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">10209381</td>
			<td style="width:265px;">BSA coated before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Gel tips</td>
			<td style="width:159px;">AlphaLabs</td>
			<td style="width:151px;">LW1103</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Acupuncture needles</td>
			<td style="width:159px;">Acumedic LTD</td>
			<td style="width:151px;">30mmx0.25 Type C</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bouin&#8217;s fixative&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">HT10132-1L</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ml</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">1.5 ml polypropylene tubes</td>
			<td style="width:159px;">Greiner BioOne</td>
			<td align="right">616201</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and co-culture of mouse ovaries and ovarian follicles

L&#39;ovaio mammiferi è composto di follicoli ovarici, ogni follicolo costituito da un unico ovocita circondato da cellule della granulosa somatiche, racchiusa all&#39;interno di un insieme membrana basale. Un pool finito di follicoli è stabilito durante lo sviluppo embrionale, quando gli ovociti in arresto meiotico formano una stretta associazione con le cellule della granulosa appiattite, formando follicoli primordiali. Con o subito dopo la nascita, le ovaie dei mammiferi contengono fornitura del loro ciclo di vita dei follicoli primordiali, da quale punto in poi vi è un rilascio costante di follicoli in piscina follicolare in crescita. L&#39;ovario è particolarmente suscettibile di sviluppo in vitro, con follicoli in crescita in un modo altamente fisiologica in coltura. Questo lavoro descrive la cultura di intere ovaie neonatali contenenti follicoli primordiali, e la cultura dei singoli follicoli ovarici, un metodo in grado di sostenere lo sviluppo di follicoli da un immaturo fino alla preovufase normativo, dopo di che i loro ovociti sono in grado di sottoporsi a fecondazione in vitro. Il lavoro qui delineato utilizza sistemi di coltura per determinare come l&#39;ovaio è influenzato da esposizione a composti esterni. Noi descriviamo anche un sistema di co-coltura, che permette di indagine delle interazioni che avvengono tra follicoli in crescita e la non crescente di follicoli primordiali.

La figura 1 mostra le immagini di ovaie e follicoli all&#39;inizio e durante le procedure di coltura. La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi di ovaie neonatali (qui, ovaie di cuccioli appena nati) esposti a sostanze tossiche riproduttive durante la coltura. Ovaie neonatali sono stati coltivati ​​per 6 giorni, ed esposti ad un farmaco chemioterapico, cisplatino o doxorubicina, il giorno 2 di cultura. Al termine della coltura, ovaie sono stati fissati, trattati per l&#39;istologia e ovaie poi esaminati per determinare il numero di follicoli ovarici sani e non sani 4. In alternativa, una più rapida valutazione primi follicoli in crescita può essere ottenuta dalla coltura di frammenti ovarici, utilizzando ovaie da un topo che esprimono un marcatore fluorescente specifico ovocita 10. Durante la cultura dei singoli follicoli, la crescita del follicolo può essere facilmente accertata mediante misurazioni al giorno nel culture periodo. La Figura 3 illustra risultati rappresentativi della crescita dei follicoli in coltura in presenza o assenza di ormoni gonadotropina ormone follicolo stimolante (FSH) e l&#39;ormone luteinizzante (LH) 5. Follicle follicolo o follicolo-ovaio co-coltura possono essere usati per studiare le interazioni tra follicoli. A seconda della lavorazione di tessuti e, le immagini possono essere ottenuti utilizzando in campo chiaro, fluorescenza o confocale. Figura 4 mostra i risultati rappresentativi di immagini da tali co-culture, esaminando vari tipi di cellule coinvolte nella comunicazione follicolo-follicolo, tra cui cellule endoteliali e neuronali 7. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" width="650" /> Figura 1: (A) Micrografia di un ovaio neonatale ottenuto da un topo il giorno della nascita, collocato<html> su una membrana di policarbonato. (B) Micrografia di appena sezionato sano follicolo ovarico, con la maggior parte del tessuto stromale circostante sezionati distanza. (C) Microfotografie di co-coltura di due follicoli ovarici nel corso dei primi tre giorni di cultura, che mostrano lo stretto contatto che si instaura tra i due follicoli come i proventi della cultura (CI: primo giorno della cultura; Cii: seconda giornata della cultura; Ciii : terza giornata della cultura). Tratto da Spears et al. 11 (D) Photomicrograph di co-coltura follicolo preantrali e dell&#39;ovaio neonatale dopo due giorni di cultura. L&#39;immagine mostra il follicolo diventando incapsulato dall&#39;ovaio. Freccia mostra follicolo preantrali. Immagine da Dr Federica Lopes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> figura 2 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52458 / 52458fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2: Effetto dei farmaci chemioterapici cisplatino e doxorubicina su ovaie coltivate neonatali cisplatino e doxorubicina sia portano alla perdita della salute follicolo e una riduzione del numero dei follicoli.. (A) Cisplatino; (B) Doxorubicina: (i) Percentuale di follicoli malsani (chiari); e (ii) il numero totale di follicoli (ombreggiata) in ciascun ovaio. Bar denotano significare + sem; n = 5 per tutti i gruppi, stelle denotano significative differenze rispetto ai controlli (* p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001). Tratto da Morgan et al. 4 <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig3.jpg" width="400" /> Figura 3:. Crescita tassi di follicoli esposti a diversi ambienti di gonadotropine valori sono media ± SEM (n ≥16 per ogni gruppo). La freccia indica l&#39;inizio di antraformazione l in tutti i gruppi di gonadotropina. Tratto da Murray et al. 5 <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" width="650" /> Figura 4: Immagini dal follicolo-follicolo e ovaio follicolo-co-culture, mostrando interazioni follicolo-follicolo (A) al microscopio confocale di una proteina verde fluorescente (GFP) follicolo e una wild-type (WT) follicolo dopo la co-coltura (. espressione GFP qui in bianco), con i processi del follicolo GFP mostrato estende su follicolo WT. (B) Sezione attraverso un / complesso follicolo WT GFP dopo co-coltura, mostrando che i processi di GFP (green) dal adiacente follicolo menzogna adiacente alla lamina basale del follicolo WT. (C) neonatale WT ovaio in seguito la cultura con un pre-antrale sono migrati GFP che esprimono follicolo, mostrando che le cellule GFP e dei processi cellulari (verde)attraverso la interstitum ovarica dell&#39;ovaio neonatale. (D) GFP / complesso follicolo WT contenente cellule endoteliali, evidenziati dalla espressione di CD31 endoteliali indicatore di cella (rosso). (E) GFP complesso follicolo / WT contenenti cellule neuronali, mostrati da espressione di marcatore neuronale beta tubulina III (vedi qui come rosso, giallo o come se un doppio marcato con GFP, verde). Complesso follicolo (F) YFP / WT, dove YFP si riferisce ad follicolo da un mouse Thy1-YFP che ha espressione occasionale di proteina fluorescente gialla (YFP: giallo) in un sottogruppo di cellule neuronali 9, mostrando che i neuroni si estendono dal follicolo YFP. Bar 50 micron (A, B, D), 100 micron (C, E, F), 100 micron (riquadro in A), 10 micron (riquadro in C), 15 micron (riquadro in D). Tratto da Campbell et al. 7 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questo fi</a>figura.

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Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Questo protocollo descrive la coltura primaria / co-coltura di topo tessuto ovarico, con ovaie di topi neonati e singoli follicoli ovarici di topi prepuberi. Le tecniche di coltura supportano sviluppo in modo altamente fisiologico, consentendo studio dell&#39;effetto di agenti estrinseci sulla ovaio, e di interazioni tra follicoli ovarici.

Cultura e co-coltura di mouse ovaie e follicoli ovarici

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

22.4K Views.  University of Edinburgh.  Questo protocollo descrive la coltura primaria / co-coltura di topo tessuto ovarico, con ovaie di topi neonati e singoli follicoli ovarici di topi prepuberi. Le tecniche di coltura supportano sviluppo in modo altamente fisiologico, consentendo studio dell'effetto di agenti estrinseci sulla ovaio, e di interazioni tra follicoli ovarici. 

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An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Un approccio per la valutazione optogenetic Formazione di connessioni neuronali in un sistema di co-coltura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D organotipica Co-cultura Modello Sostenere midollare timica epiteliale proliferazione, differenziazione e promiscua genica

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

In Vitro Crescita dei follicoli preantrali Mouse sotto condizioni di microgravità simulata

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissezione e cultura del rene embrionale del mouse

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

L'analisi di co-coltura di anello aortico: Un comodo strumento per valutare il potenziale angiogenico delle cellule stromali mesenchimali In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Analisi clonale di cellule embrionali staminali ematopoietiche precursori utilizzando indice della singola cella ordinamento combinato con cellule endoteliali nicchia co-cultura

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Tutta Monte immunofluorescenza e quantificazione del follicolo delle ovaie coltivati del topo

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Coltura del tessuto ovarico per visualizzare fenomeni nell'ovaia di Mouse

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Sistema di analisi dell'angiogenesi tridimensionale utilizzando Gli spheroidi co-culturali formati da cellule formanti colonia endoteliale e cellule staminali mesenchiche

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

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Cultura e co-coltura di mouse ovaie e follicoli ovarici