La asistencia técnica proporcionada por Jaipreet Bharj. Este trabajo fue apoyado por becas de la UE-FP7 (SYSCILIA -241.955) y El Riñón Fundación holandesa (CP11.18).

Declaración de Ética: Animal de mantenimiento, la cría y los procedimientos están definidos y controlados por la Ley de 1986. Todos los experimentos con animales se ha llevado a cabo bajo licencias otorgadas por el Ministro del Interior (PIL Nº 70/7892) en cumplimiento con Biológica Animales (Procedimientos Científicos) Grupo de Servicios de Gestión y el Comité de Ética de Servicios Biológica, SGUL, Londres, Reino Unido. Se hicieron todos los esfuerzos para reducir el número de animales utilizados y para perfeccionar los procedimientos y la cría con el fin de minimizar el sufrimiento y mejorar el bienestar. 1. Elaboración de Instrumentos, Anestésico, y colorante fluorescente <ol><li> El uso de un extractor de micropipeta y los capilares de borosilicato de pared estándar (sin filamentos) Tire agujas de longitud adecuada para la microinyección (Figura 1A). </li><li> Hacer un molde de agarosa para la orientación de los embriones para inyección fácil en el pericardio (Figura 1B). Pegamento aproximadamente diez vidrio microscopio slides juntos para formar una &#39;escalera&#39; de diapositivas offset. Para obtener los mejores resultados, utilice una gota de pegamento rápido resina epoxi conjunto en el centro de cada diapositiva. </li><li> Corte un tramo de aproximadamente 78 mm de longitud a medio camino a través de dos pipetas de plástico de 10 ml utilizando un bisturí Mechero Bunsen climatizada, retire la pipeta termina en su caso. Adjuntar y secciones pegamento (resina epoxi) de pipeta a las diapositivas de cristal apilados para proporcionar estabilidad para permitir que el molde para que moje en una placa de Petri de 90 mm. Haga todo lo posible para asegurar las esquinas de diapositivas alinean perpendicular al suelo placa de Petri. Dé tiempo pegamento se seque. </li><li> Reparto de molde en una solución de agarosa al 2% en agua hecha de pescado (obtenido de la acuario). Verter de agarosa en una placa de Petri de 90 mm y colocar el molde en la parte superior de la placa de Petri abierta, permitiendo la diapositiva apilados bordes para sumergirse en un ángulo bajo la superficie de agarosa. Deja para establecer en el banco de laboratorio durante 30 minutos. </li><li> Retire el molde deslizante y cubra la agarosa deslizable impresa con peces de agua dulceque contiene tricaína anestésico (ver paso 1,9) a una proporción de 1:25. </li><li> Haga soluciones de dextrano rodamina (RD) tinte. Resuspender rodamina B 10.000 MW dextrano marcado en agua ultrapura esterilizada en autoclave para hacer una concentración de solución madre de 50 mg / ml. Para la microinyección, diluir aún más la acción a una concentración final de 5 mg / ml en agua ultrapura tratada en autoclave. NOTA: pigmentada células comienzan a diferenciarse en el pez cebra de 24 h después de la fecundación (HPF); estos pueden oscurecer marcadores fluorescentes durante la adquisición de imagen. </li><li> Inhibir la formación de melanocitos mediante el uso de N -Phenylthiourea (PTU), que bloquea la melanogénesis través de la inhibición de la tirosinasa. Hacer una solución madre de 0,003% de PTU disolviendo polvo de PTU en el agua del acuario, la solución se calienta a 60 ° C para solubilizar completamente. </li><li> Incubar embriones de pez cebra en solución de azul de metileno, un fungicida suave, para evitar las floraciones de hongos y aumentar la supervivencia. Añadir 2 ml de solución de azul de metileno, que contiene 0,1% de azul de metileno en uagua ltrapure, a 1 l de agua del acuario y su uso como medio de embrión estándar. </li><li> Invente una concentración stock de 15 mM de sal metanosulfonato / acetato de 3-aminobenzoato tricaína como se indica en &#39;El libro de pez cebra&#39; 23. Anestesiar a los embriones y por consiguiente ellos inmovilizada para realizar el procedimiento de microinyección. </li><li> Después de anestesiar a los embriones, orientarlo, para obtener imágenes mediante el uso de las propiedades no tóxicas y viscosas de metilcelulosa. Para hacer una preparación de 200 ml de 3% de metilcelulosa, chill 130 ml de agua a -20 ° C durante 30 min y el lugar en hielo. Calentar 70 ml de agua a 80 ° C en un vaso de precipitados de vidrio, añadir 6 g de metilcelulosa, y agitar con una varilla de vidrio hasta que todas las partículas se humedecen y uniformemente dispersos. Agregue el agua helada, mezcle y deje que la preparación se enfríe a 4 ° C durante 30 minutos antes de alícuotas en tubos de 50 ml. NOTA: La reducción de la temperatura permite la metilcelulosa se vuelva soluble. La solución se vuelva más gruesocomo los hidratos de polvo. 3% de metilcelulosa se puede almacenar sin crecimiento bacteriano durante cortos períodos de una semana a 4 ° C o más a -20 ° C. Asegúrese de que la metilcelulosa ha llegado a RT antes de su uso. </li><li> Para llevar a cabo inyecciones de tinte fluorescente en el pez cebra utilizar una microinyección configuración estándar (Figura 1C). Este consta de un compresor de aire conectado a un sistema regulador de presión que se alimenta en un soporte de pipetas recta para su uso con 1,0 capilares de diámetro exterior. El titular de la pipeta debe ser alojado dentro de un compacto micromanipulador de control 3-MM33 eje fijado a una placa base de acero por un soporte magnético. Los embriones pueden ser visualizados, manipulado y se inyectaron usando un microscopio de disección estéreo. </li></ol> 2. El pez cebra Cría y Tratamiento Pre-inyección <ol><li> Mantener el pez cebra como se describió anteriormente 23. Utilice un acuario configuración que proporciona agua de recirculación suministrado a una temperatura constante de 28,5 ° C, Condicionado a pH 6.8 a 7.2 y la conductividad de 450 a 550 mS con bicarbonato de sodio y la sal del mar Océano instantánea, respectivamente. Utilice tipo salvaje o líneas de pez cebra transgénico según sea apropiado para el experimento, el mantenimiento de una densidad de población de 15 machos y 15 hembras por 8 tanque L. Ajuste el fotociclo instalación pescado a 14 horas de luz del día entre las 09 a.m.-11 p.m.. </li><li> Desove pez cebra comienza a principios de la fotociclo, cuando las luces se encienden en la mañana. Para asegurar huevos máximas pueden recogerse sin molestar a los peces, sumerja los tanques de cría (que contienen inserciones de malla, disponible de especialistas de pez cebra) en los tanques de almacenamiento de tipo salvaje de la noche antes de la recolección. </li><li> En el día de la recolección, permite 30 - 40 min para los peces para desovar, después de lo cual recoger y enjuagar los huevos usando un colador de té y agua del acuario fresco. Deposita los huevos limpios en un medio que contiene el embrión de 90 mm placa de Petri y se incuba a 28,5 ° C. </li><li> Tratar a los embriones con PTU para inhibir melanogénesis. A las 8 de HPF, transferir embriones viables en el líquido mínimo en placas de Petri que contienen frescos 1: 100 PTU a medio embrión y se incuba adicionalmente a 28,5 ° C hasta 72 HPF. NOTA: PTU puede causar defectos de desarrollo si se usa en las primeras etapas de modo debe limitarse a publicar 8 etapas HPF, pero puede ser tratada tan tarde como 24 HPF. Además tardía de PTU no bloquea completamente la pigmentación del ojo, pero generalmente es exitoso y la inhibición de la formación de los melanocitos tronco. </li></ol> 3. La microinyección NOTA: El pericardio encierra al corazón, pero se separa para la protección y facilidad de movimiento cardiaco por el fluido dentro de la cavidad pericárdica. El objetivo de este procedimiento es inyectar RD en la cavidad pericárdica, esto permite la rápida captación del colorante al sistema de vasculatura. <ol><li> Agujas de carga con 6 l - diluyen RD, utilizando puntas Microloader y segura en el soporte de la aguja del micromanipulador. Romper el extremo de la aguja usando bien tippfórceps ed (Figura 1A). Mover la solución RD a la punta de la aguja mediante la maximización de la duración del pulso a la configuración minutos, volver a mseg una vez completa. </li><li> Utilice un micrómetro de platina, el regulador de presión, y refinamientos a la longitud de punta de la aguja (utilizando pinzas) para ajustar el tamaño de la gotita expulsada a 100 micras de diámetro, esto equivale a un volumen de 0,5 nl (Figura 2A). NOTA: Al romper la aguja, tenga cuidado de no romper demasiado fuera de lo contrario hará que calibrar el volumen de inyección difícil. Si es necesario, romper aún más la punta de la aguja para aumentar el tamaño de la gota sin embargo, mantener un espesor de la aguja que permite la entrada en el pericardio sin flexión excesiva o daños en el tejido. </li><li> Antes de la inyección, anestesiar a los embriones en medio de embrión que contienen tricaína. Configure 2 x 35 mm placas de Petri que contenían 5 ml de medio de embriones, una etiqueta &#39;tricaína&#39; y la otra &#39;recuperación&#39;. </li><li> Añadir 200l de stock tricaína al plato debidamente etiquetado. Una vez listo para inyectar, seleccionar un embrión individual en 72 HPF y transferir en líquido mínimo para el plato tricaína. Supervisar la actividad del embrión, pruebe el embrión se anestesia y se inmoviliza mediante agitación suave con una punta de microloader truncado. </li><li> Transferir el embrión anestesiado para el molde de inyección y orientar el embrión dentro de una cubeta de agarosa de manera que el lado izquierdo está mirando hacia arriba, el posicionamiento del corazón a la izquierda del campo de vista. </li><li> Para inyectar la RD en el corazón, el pericardio perforar con la aguja e inyectar 1 nl de RD en la cavidad pericárdica del embrión anestesiado (Figura 2B, panel derecho). Retire la aguja después de la inyección. Transferir el embrión inyectado en el líquido mínimo para el &#39;plato recuperación&#39; y vigilar durante 1 min. Transferir el embrión individual a una placa de 24 pocillos que contenía 1 ml de medio de embriones frescos (que contiene PTU) y la etiqueta de manera apropiada. NOTA: El pericardio es difícil, sin embargo hay un punto débil notable en la intersección donde el pericardio cumple con los arcos faríngeos ventro-caudal y saco vitelino dorso-rostral (Figura 2B punta de flecha). La aguja debe dirigirse a esta ranura. Cuando la aguja está en su lugar, un grifo firma de un dedo en la parte superior de la micromanipulador facilitará la entrada en la cavidad pericárdica. </li><li> Repita los pasos 3.2 a 3.6 por lo menos 10 embriones por grupo experimental, coloque cada pez en un pozo independiente y única labelto permiso individuales experimentales de seguimiento. Se incuba a 28,5 ° C durante 3 horas. </li></ol> 4. Imaging Acquisition <ol><li> A las 3 h después de la inyección (hpi) anestesiar a los embriones como se describió anteriormente y transferir a un plato de Petri de 35 mm que contiene 3% de metilcelulosa. Presione suavemente los embriones en la metilcelulosa y orientar para que el lado lateral se pueden obtener imágenes. </li><li> Adquirir una imagen del embrión bajo UV, utilizando un filtro para la visualización of emite luz a 570 nm (Figura 2C). Después de la adquisición de imágenes, permite que el embrión se recupere antes de reemplazar en el bien designado. Adquirir imágenes de todos los embriones inyectados e incubar mayor a 28,5 ° C. NOTA: En este protocolo se utilizó un microscopio estereoscópico fluorescente con un conjunto de filtros TXR, una cámara DFC300FX y software de aplicación respectiva. Tome nota de los ajustes de adquisición exactos para la adquisición de la imagen posterior. </li><li> A las 24 hpi, adquirir una segunda ronda de imágenes como se describe anteriormente. Una vez que todas las imágenes han sido adquiridas, tanto a los 3 hpi y 24 hpi, humanamente disponer de los embriones o el uso para otros medios experimentales, por ejemplo, la inmunohistoquímica. </li></ol> Procesamiento 5. Imagen <ol><li> Cuantificar la intensidad de fluorescencia de cada embrión inyectado, a las 3 hpi y 24 hpi, mediante el análisis de imágenes utilizando el software ImageJ de NIH. Para medir la intensidad de fluorescencia, abrir una imagen en ImageJ y especificar una región de interés (ROI) a 100 px 2 (Editar → Selección → especificar). </li><li> Coloque el corazón en el centro de la roi (Figura 2C), establezca medidas para incluir la escala de gris medio y el área (Analizar → medidas de ajuste), lleve a cabo la medición (Analizar → medida). Completar para cada conjunto de imágenes, a las 3 hpi y 24 hpi, por embrión y transferir valores promedio en escala de grises a una hoja de cálculo para su posterior procesamiento. NOTA: Seleccionamos un tamaño roi fijo de 100 px 2 ya que esto abarca corazones individuales entre embriones. El corazón fue seleccionado para realizar mediciones debido a su gran tamaño que permite una ubicación conveniente para medir el contenido fluorescente de la sangre antes de entrar en el riñón. </li><li> Realizar análisis estadístico utilizando el software estadístico apropiado. Comparar grupos de significación estadística utilizando la prueba t de estudiante. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

El pez cebra ofrece una valiosa herramienta para modelar la enfermedad genética humana, su utilización como instrumento científico para la investigación in vivo han permitido estudios detallados de la descomposición genética de muchos sistemas biológicos, incluido el riñón. Mucho ahora se entiende acerca de cómo se desarrolla y funciona el riñón pez cebra. Las similitudes con nefrogénesis humana y la homología con los genes causantes de enfermedades 21 ha ilustrado cómo el pez...

El riñón humano juega un papel crucial en el filtrado de los desechos metabólicos de la sangre y la recuperación de solutos necesarios para mantener la homeostasis celular. Hay un número de enfermedades genéticas humanas que causan disfunción renal. La enfermedad renal hereditaria más común es la enfermedad renal poliquística autosómica dominante (PQRAD) caracterizada por el desarrollo de los sacos llenos de líquido dentro de túbulos nefríticos; el daño causado por la quistogénesis es perjudicial para la función renal 10. PQRAD tiene una ocurrencia de 1: 800 - 1: 1000 y representa el 8 - 10% de los pacientes en insuficiencia renal terminal (IRT) 11. Varios genes han sido implicados para causar PQRAD incluyendo policistina-1 (PKD1) y -2 (PKD2), que representa aproximadamente el 85% y el 15% de los casos, respectivamente 12,13. Además, los productos génicos para PKD1 y -2 se localizan en el cilio y son fundamentales para ciliogenesis 14,15. Existe ahora una familia reconocida de trastornos genéticos humanos, conocidos comolos ciliopatías, que afectan a la función de los cilios y dan lugar a ERC 16. El creciente número de enfermedades genéticas humanas que afectan el desarrollo y la función ciliar está atrayendo el interés mundial en este orgánulo vestigial una vez considerado. El cilio, un saliente celular-cabello como, está enriquecida con los receptores y canales iónicos necesarios para la transducción de eventos de señalización celular clave. El cilio consiste en un axonema a base de microtúbulos, típicamente estructurado en nueve dobletes de microtúbulos dispuestos radialmente con o sin un par central de microtúbulos singlete. La estructura axonemal define el tipo y modo de acción ciliar. La disposición de los microtúbulos 9 + 2 confiere a la motilidad del cilio donde se utiliza en el movimiento de los fluidos a través de las superficies epiteliales. La configuración 9 + 0 es no móviles, pero se cree que es principalmente función en eventos de señalización celular 17. Aparte de ERC, las consecuencias de la disfunción ciliar son un conjunto de característicascaracterísticas ciliopatía que incluyen, la obesidad, la degeneración de la retina, polidactilia, y el deterioro cognitivo 16. Sin embargo, la ERC es una de las más perjudiciales para la calidad de vida del paciente y, por tanto, una importante fuerza impulsora detrás del desarrollo de su caso en modelos in vivo para ciliar relacionada con la ERC. El pez cebra es un excelente modelo para comprender la etiología de la enfermedad genética humana. Su desarrollo rápido, la producción de un gran número de huevos, tejido transparente, y el crecimiento ex utero permite procesos de desarrollo de pez cebra a ser visualizados y eventos biológicos manipulados con facilidad considerable. Los genes pueden ser alterados genéticamente utilizando el reciente éxito de herramientas de edición genoma (CRISPR 18 y TALENS 19), derribados usando tecnología antisentido de morfolino 20, o farmacológicamente regulados por la adición de compuestos a su medio ambiente acuático. De hecho, el pez cebra ofrece una plataforma para llevar a cabo experimentos que no son permisivos en otros modelos animales. Mientras que el pez cebra son vertebrados relativamente simples (en comparación con los seres humanos) que comparten muchos órganos funcionalmente conservados, los genes y los procesos de señalización en común con los seres humanos. Por ejemplo, el riñón pez cebra es notablemente similar en estructura y función en comparación con los seres humanos 21,22. Sin embargo, a diferencia del riñón de mamífero que se desarrolla a través de una sucesión de fases, cada una marcada por un riñón más desarrollada (pronefros, mesonefros y metanefros), el pez cebra embrionarias sólo se desarrolla una pronefros, la forma más inmadura de un riñón. Mientras millones de nefronas se encuentran formando los bloques de construcción del riñón de los mamíferos, el embrión de pez cebra sólo poseen dos. Los glomérulos, que permiten el filtrado de sangre inicial, se fusionan en la línea media ventral sólo a la aorta. Filtros de sangre a través de los glomérulos en los túbulos pronéfricos que se ejecutan en sentido caudal a lo largo del eje, la fusión antes de salir a través de la cloaca. El pronephric tubules están fuertemente ciliadas con cilios móviles que son permisivas para el flujo de filtrado hacia la salida caudal 3,4. Esta estructura pronephric sencillo mantiene la homeostasis pez cebra a través de varias semanas de crecimiento de las larvas en el que el tiempo se convierten en una estructura más compleja mesonefros 21. Sin embargo, el pez cebra nunca desarrolla un metanefros 21. A pesar de las idiosincrasias de pez cebra, la nefrona pez cebra se segmenta con perfiles de expresión génica igual a la observada en los mamíferos y por lo tanto ofrece una incomparable modelo in vivo para la nefrogénesis 3,22. Rutinariamente a los pacientes se prueban para la función renal a través de una serie de pruebas de sangre y orina. Típicamente, la sangre se analiza para disuelto sales, urea y creatinina. Los altos niveles de urea, creatinina y concentraciones anormales de sal son indicativos de problemas con la función renal. Análisis de orina utilizando una tira reactiva colorimétrica detecta niveles anormales de proteína, blood, pus, bacterias y azúcar presente en muestras de orina. Estas pruebas normalmente requieren aproximadamente 30 ml de orina o de 5-10 ml de sangre. Ha sido difícil traducir estos tipos de ensayos a pequeña en organismos modelo in vivo, tales como el pez cebra, debido principalmente a la naturaleza imposible de recogida de sangre u orina suficiente para realizar el ensayo. Aquí, nos dirigimos a la falta de pruebas de función renal pez cebra apropiadas y describimos una técnica innovadora para su estudio. Mediante la inyección de un tinte fluorescente en la corriente sanguínea que son capaces de controlar y cuantificar de forma individual en el tiempo de la filtración y la excreción de la actividad fluorescente de la sangre a través del riñón. Este método puede ser utilizado para estudiar el daño renal causada por la enfermedad, que proporcionan un ejemplo de.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="708">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller</td>
			<td style="width:136px;">Intracel</td>
			<td style="width:136px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">borosilicate standard wall capillaries</td>
			<td style="width:136px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:136px;">VWR International</td>
			<td>631-0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Epoxy Resin Glue</td>
			<td style="width:136px;">Evo-Stik</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>D-1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">air compressor&#160;</td>
			<td>Jun-Air</td>
			<td>OF302-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Picospritzer III&#160;</td>
			<td>Parker Instruments&#160;</td>
			<td>051-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">compact 3-axis control micromanipulator&#160;</td>
			<td>Marzhauser</td>
			<td>MM33&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dissecting stereo microscope</td>
			<td style="width:136px;">Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stage micrometer&#160;</td>
			<td>Pyser- SGI</td>
			<td>02A00404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay

El embrión de pez cebra ofrece un modelo manejable para estudiar la organogénesis y modelar enfermedades genéticas humanas. A pesar de su relativa simplicidad, el riñón pez cebra se desarrolla y funciona casi de la misma forma que los humanos. Una diferencia importante en la construcción del riñón humano es la presencia de millones de nefronas en comparación con el pez cebra que tiene sólo dos. Sin embargo, la simplificación de un sistema tan complejo en unidades funcionales básicos ha ayudado a nuestra comprensión de cómo se desarrolla el riñón y opera. En el pez cebra, la línea media situada glomérulo es el responsable de la filtración de la sangre inicial en dos túbulos pronéfricos que divergen para funcionar bilateralmente por el eje embrionario antes de fundirse entre sí en la cloaca. Los túbulos pronéfricos están densamente poblados por cilios móviles que facilitan el movimiento de filtrado a lo largo del túbulo segmentada, lo que permite el intercambio de varios solutos antes de finalmente salir a través de la cloaca 2-4. Muchos de los genes responsables de la enfermedad renal crónica, incLuding los relacionados con ciliogenesis, han sido estudiados en el pez cebra 5. Sin embargo, un gran inconveniente ha sido la dificultad para evaluar la función renal pez cebra después de la manipulación genética. Ensayos tradicionales para medir la disfunción renal en humanos han demostrado no traslacional para el pez cebra, debido principalmente a su medio acuático y pequeño tamaño. Por ejemplo, no es físicamente posible extraer la sangre de embriones en escena de pescado para el análisis de urea y creatinina contenido, ya que son demasiado pequeñas. Además, el pez cebra no producen suficiente orina para la prueba en un simple proteinuria &#39;varilla&#39;, que a menudo se lleva a cabo durante los exámenes iniciales de los pacientes. Se describe un ensayo fluorescente que utiliza la transparencia óptica del pez cebra para controlar cuantitativamente la liquidación de un colorante fluorescente, con el tiempo, a partir de la vasculatura y hacia fuera a través del riñón, para dar una lectura de la función renal 1,6-9.

Síndrome de Bardet-Biedl (BBS) es una rara ciliopatía heterogénea que afecta aproximadamente a 1: 160.000 personas en todo el mundo 16. Los pacientes presentan una serie de problemas asociados incluyendo riñones poliquísticos, posteriormente los pacientes con frecuencia requieren diálisis o trasplante 24. ESRF es la causa más común de muerte en BBS, con alrededor del 30% de los pacientes que desarrollan ERC 16. En la actualidad, 20 genes no relacionados han sido implicados en BBS...

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Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

El pez cebra es una herramienta popular para modelar la enfermedad renal crónica (ERC). Sin embargo, su pequeño tamaño hace que sea imposible para evaluar la función renal utilizando métodos tradicionales. Se describe un ensayo de aclaramiento renal tinte fluorescente 1 que permite el análisis cuantitativo de la función renal pez cebra en la ERC.

Evaluación del pez cebra función renal mediante un ensayo de Liquidación fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

evaluation-zebrafish-kidney-function-using-fluorescent-clearance

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K vistas.  University College London.  El pez cebra es una herramienta popular para modelar la enfermedad renal crónica (ERC). Sin embargo, su pequeño tamaño hace que sea imposible para evaluar la función renal utilizando métodos tradicionales. Se describe un ensayo de aclaramiento renal tinte fluorescente 1 que permite el análisis cuantitativo de la función renal pez cebra en la ERC. 

Video: Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

El trasplante de médula del riñón entero en adultos de pez cebra

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Investigación

Biología

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Pez cebra todo el montaje de alta resolución doble fluorescente In Situ La hibridación

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Usando la respuesta de optocinético para estudiar la función visual del pez cebra

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinyecciones intravenosa de larvas de pez cebra para el Estudio de la lesión renal aguda

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

El trasplante de células directamente en el riñón de adultos de pez cebra

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Evaluación de la glándula mamaria de desarrollo y función en modelos de ratón

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

La disección del riñón adultos de pez cebra

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Un ensayo de cribado para la identificación de moduladores fluorescente de canales GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Análisis de Composición Nephron y función en el riñón adultos de pez cebra

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...