סיוע טכני המסופק על ידי Jaipreet Bharj. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהאיחוד האירופי-FP7 (SYSCILIA -241,955) והכליות הולנדי הקרן (CP11.18).

הצהרת אתיקה: בעלי חיים תחזוקה, בעלי, ונהלים מוגדרים ונשלטים על ידי בעלי חיים (הליכים מדעיים) Act 1986. כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו תחת רישיונות שניתנו על ידי שר הפנים (PIL מס &#39;70/7892) בעמידה בביולוגית שירותי קבוצת ניהול והוועדה אתיקה הביולוגיים השירותים, SGUL, לונדון, בריטניה. כל המאמצים שנעשו כדי לצמצם את מספר בעלי החיים המשמשים וכדי לחדד את שני ההליכים והבעלים כדי למזער את הסבל ולשפר את הרווחה. 1. הכנה של מכשירים, הרדמה, ופלורסנט דיי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות חולץ micropipette ונימים סטנדרטיים ורוסיליקט קיר (ללא חוטים) למשוך מחטים באורך המתאים לmicroinjection (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן עובש agarose לכיוון של עוברים להזרקה קלה לקרום הלב (איור 1). דבק כ sl מיקרוסקופ עשר זכוכיתאידו יחד כדי ליצור &quot;מדרגות&quot; של שקופיות קיזוז. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש טיפת דבק שרף אפוקסי הסט המהיר במרכזו של כל שקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה לגזור קטע של כ 78 מ&quot;מ באמצע דרך אורך דרך שתי טפטפות פלסטיק 10 מיליליטר באמצעות אזמל מחומם מבער בונזן, להסיר מסתיימת כפי שראוי. צרף וחתכים דבק פיפטה (שרף אפוקסי) לשקופיות זכוכית נערמו כדי לספק יציבות כדי לאפשר העובש לטבול לתוך צלחת פטרי 90 מ&quot;מ. לעשות כל מאמץ כדי להבטיח את פינות השקופיות ליישר אנכיות לרצפת צלחת פטרי. לאפשר זמן דבק להגדיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עופרת העובש בפתרון agarose 2% שנעשה במי דגים (שקבל את האקווריום). יוצקים agarose לתוך צלחת פטרי 90 מ&quot;מ ומניח את התבנית על גבי צלחת פטרי הפתוחה, המאפשר את השקופית נערמה קצוות כדי לצלול בזווית מתחת לפני שטח agarose. השאר להגדיר על ספסל המעבדה למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את גבס השקופיות ולכסות את agarose-טבוע שקופיות עם מים דגים טרייםהמכיל חומר הרדמה Tricaine (ראה שלב 1.9) בשעה 01:25 יחס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הפתרונות של dextran rhodamine צבע (RD). rhodamine B Resuspend 10,000 מגה וואט שכותרת dextran במי ultrapure autoclaved לעשות ריכוז מניות של 50 מ&quot;ג / מיליליטר. עבור microinjection, נוסף לדלל את המניות לריכוז סופי של 5 מ&quot;ג / מיליליטר במי ultrapure autoclaved. הערה: תאי פיגמנט מתחילים להבחין בדג זברה מ -24 שעות לאחר הפריה (hpf); אלה יכולים לטשטש סמני ניאון במהלך רכישת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכב היווצרות מלנוציט באמצעות N -Phenylthiourea (PTU), אשר חוסם melanogenesis באמצעות עיכוב של טירוסינאז. הפוך פתרון מניות 0.003% מPTU ידי המסת אבקת PTU במי אקווריום, פתרון חום על 60 מעלות צלזיוס לsolubilize באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עוברי דג הזברה בפתרון מתילן כחול, פטריות קלות, כדי למנוע פריחת פטרייתי ולהגדיל את ההישרדות. הוסף 2 מיליליטר של פתרון מניות מתילן כחול, המכיל 0.1% מתילן כחול בuמים ltrapure, ל1 ליטר של מים ושימוש באקווריום כמדיום עובר סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכיבים את ריכוז מניית 15 מ&quot;מ של Tricaine מלח methanesulfonate / אתיל 3-aminobenzoate כפי שהורה &quot;ספר דג הזברה &#39;23 ב. להרדים את העוברים וכתוצאה מכך המשותק כדי לבצע את הליך microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרדמת העוברים, לכוון אותם, להדמיה באמצעות הנכסים שאינם רעילים וצמיג של methylcellulose. כדי להפוך הכנת 200 מיליליטר של methylcellulose 3%, לצנן 130 מיליליטר מים ב -20 ° C למשך 30 דקות ומניחים על קרח. מחממים 70 מיליליטר של מים עד 80 מעלות צלזיוס בכוס זכוכית, להוסיף 6 גרם של methylcellulose, ולהתסיס באמצעות מוט זכוכית עד שכל החלקיקים רטוב ומפוזר באופן שווה. מוסיף את המים קרים כקרח, לערבב, ולאפשר ההכנה להתקרר על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני aliquoting לצינורות 50 מיליליטר. הערה: הורדת הטמפרטורה מאפשרת methylcellulose להפוך מסיס. הפתרון יהיה עבה יותרכמלחלח אבקה. 3 methylcellulose% ניתן לאחסן ללא צמיחת חיידקים לתקופות קצרות של שבוע על 4 מעלות צלזיוס או יותר ב -20 ° C. ודא methylcellulose הגיע RT לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע זריקות של צבע ניאון לדג הזברה להשתמש הגדרה סטנדרטית microinjection (איור 1 ג). זה מורכב ממדחס אוויר מחובר למערכת ווסת לחץ שמזינה לתוך מחזיק פיפטה ישר לשימוש עם 1.0 נימי קוטר חיצוניות. בעל פיפטה יש שוכן בתוך micromanipulator MM33 הקומפקטי 3 ציר שליטה מאובטח לצלחת בסיס פלדה על ידי דוכן מגנטי. ניתן דמיינו עוברים, מניפולציות והזריקו באמצעות מיקרוסקופ לנתח סטריאו. </li></ol> 2. דג הזברה בעלי וטיפול טרום הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על דג הזברה כמתואר 23 בעבר. השתמש בהגדרת אקווריום המספקת מים הסירקולציה מחודשים מסופקים בטמפרטורה קבועה של 28.5 מעלות צלזיוס, מותנה pH 6.8-7.2 ומוליכות של 450-550 מייקרו-שניות עם סודיום ביקרבונט ומיידי אוקיינוס ​​מלח ים, בהתאמה. השתמש wildtype או קווי דג הזברה מהונדסים כמתאים לניסוי, שמירה על צפיפות גרב של 15 זכרים לנקבות 15 ל8 טנק L. הגדר את photocycle מתקן דגים עד 14 שעות של אור יום בין 09:00-23:00. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השרצה דג הזברה מתחילה בתחילת photocycle, כאשר האורות להדליק בבוקר. כדי להבטיח ניתן לאסוף ביצים המרביות מבלי להפריע את הדגים, לצלול (מוסיף המכיל רשת, זמין ממומחי דג הזברה) טנקי רבייה לטנקי מניית wildtype הערב לפני האוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום האוסף, לאפשר 30-40 דקות לדגים להשריץ, לאחר שיאסוף ולשטוף ביצים באמצעות מסננת תה ומים באקווריום טריים. להפקיד את הביצים ניקו במדיום עובר המכיל 90 מ&quot;מ צלחת פטרי ולדגור על 28.5 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את העוברים עם PTU לעכב melanoספר בראשית. בשעת 8 בhpf, להעביר עוברי קיימא בנוזל מינימאלי לצלחות פטרי טריות המכילות 1: 100 PTU עד בינוני עובר ודגירה נוספת על 28.5 מעלות צלזיוס עד 72 hpf. הערה: PTU יכול לגרום למומים התפתחותיים אם משתמש בו בשלבים מוקדמים יותר כך צריך להיות מוגבלים לפרסם 8 שלבי hpf, אך ניתן לטפל בי מאוחר ככל 24 hpf. תוספת מאוחרת של PTU לא תחסום באופן מלא פיגמנטציה עין אך היא בדרך כלל מוצלח ועיכוב היווצרות מלנוציט תא המטען. </li></ol> 3. Microinjection הערה: קרום הלב encases הלב אבל מופרד להגנה וקלות התנועה של הלב על ידי נוזל בתוך חלל קרום הלב. מטרתו של נוהל זה היא להזריק RD לתוך חלל קרום הלב, זה מאפשר לספיגה מהירה של הצבע למערכת כלי הדם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחטי עומס עם 6 μl - בדילול RD, באמצעות טיפים microloader ולהבטיח לבעל המחט של micromanipulator. לשבור את הקצה של המחט באמצעות טיפקס בסדרהמלקחיים ed (איור 1 א). הזז את פתרון RD לקצה המחט על ידי ניצול מרבי משך דופק להגדרת דקות, לחזור לMSEC פעם מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מיקרומטר שלב, ווסת הלחץ, וחידודים לאורך קצה מחט (באמצעות מלקחיים) כדי להתאים את הגודל של רביב גורש 100 מיקרומטר בקוטר, זה משווה ל 0.5 נפח nl (איור 2 א). הערה: כאשר שבירת המחט, להיזהר לא לשבור יותר מדי את אחרת זה יעשה כיול נפח ההזרקה קשה. במידת צורך, לשבור עוד קצה המחט כדי להגדיל את גודל הירידה עם זאת, לשמור על עובי מחט המאפשר כניסה לקרום הלב ללא כיפוף או נזק מופרזים לרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הזריקה, להרדים את העוברים במדיום עובר המכילים Tricaine. הגדר את 2 x 35 מ&quot;מ צלחות פטרי המכילים 5 מיליליטר בינוני עובר, &#39;Tricaine&#39; תווית אחת ו&#39;שחזור &#39;האחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200μl של המניה Tricaine לצלחת שכותרתו כראוי. ברגע מוכן להזרים, בחר עובר בודד ב 72 hpf ולהעביר בנוזל מינימאלי למנת Tricaine. לפקח על הפעילות של העובר, לבדוק את העובר הוא הרדים ומשותק על ידי תסיסה עדינה באמצעות קצה microloader קטוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העובר הרדים להזרקת העובש ולהתמצא העובר בתוך שוקת agarose כך בצד השמאל פונה כלפי מעלה, מיצוב הלב בצד השמאל של שדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק RD ללב, לחדור את קרום הלב עם המחט ולהזריק nl 1 של RD לתוך חלל קרום הלב של העובר המורדם (איור 2, פנל מימין). למשוך את המחט לאחר הזרקה. העבר את העובר המוזרק בנוזל מינימאלי ל&#39;צלחת השחזור &#39;ולפקח דקות 1. העבר את עובר הפרט לצלחת 24 היטב המכילה 1 מיליליטר בינוני עובר טרי (המכיל PTU) ולתייג כראוי. הערה: קרום הלב הוא קשה, עם זאת יש נקודת תורפה בולטת בצומת שבו קרום הלב פוגש את קשתות ventro-הזנב בלוע וצק חלמון dorso-מקורי (חץ איור 2). המחט צריכה להיות מופנה לחריץ זה. כאשר המחט נמצאת במקום, ברז משרד אצבע על גבי micromanipulator יאפשר כניסה לתוך חלל קרום הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.2-3.6 לפחות 10 עוברים לכל קבוצת ניסוי, למקם כל דגים ובנפרדים ומעקב ניסיוני בודד היתר ייחודי labelto. לדגור על 28.5 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. </li></ol> 4. הדמיה רכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעת 3 לאחר שעה הזרקה (HPI) להרדים עוברים כפי שתואר לעיל ולהעביר לצלחת פטרי המכילה 35 מ&quot;מ methylcellulose 3%. דחף בעדינות העוברים לmethylcellulose ולהתמצא כך הצד לרוחב ניתן הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונה של העובר תחת UV, באמצעות מסנן עבור o להדמיהf נפלטה אור ב 570 ננומטר (איור 2 ג). לאחר רכישת תמונה, לאפשר את העובר להתאושש לפני החלפה במיועדת גם. לרכוש תמונות לכל עוברים המוזרקים ודגירה נוספת על 28.5 מעלות צלזיוס. הערה: בפרוטוקול זה השתמשנו סטראו ניאון עם מערכת סינון TXR, מצלמה DFC300FX ותוכנת יישום המתאימה. רשום את ההגדרות המדויקות רכישה לרכישת תמונה שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגיל 24 HPI, לרכוש סיבוב של תמונות שנייה כפי שתואר לעיל. ברגע שכל התמונות שנרכשו, בשני HPI 3 ו -24 HPI, יחס אנושי להשליך את העוברים או להשתמש באמצעים אחרים ניסיוניים למשל, אימונוהיסטוכימיה. </li></ol> עיבוד 5. תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת עוצמת ניאון של כל עובר מוזרק, בשעה 3 HPI ו -24 HPI, על ידי ניתוח תמונות באמצעות תוכנת ImageJ של NIH. כדי למדוד עוצמת ניאון, פותח תמונה בImageJ ולציין אזור של עניין (ROI) בשעה 1(בחירת → עריכת → לציין) 00 px 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הלב במרכז ROI (איור 2 ג), להגדיר מדידות לכלול בקנה מידה אפורה ממוצעת ואזור (לנתח → מדידות סט), לבצע מדידה (לנתח → מידה). השלם עבור כל קבוצה של תמונות, בשעה 3 HPI ו -24 HPI, לכל עובר ולהעביר ערכים בקנה מידה אפורה ממוצע לגיליון אלקטרוני לעיבוד נוסף. הערה: בחרנו גודל roi קבוע של 100 px 2 כמו זה מקיף את לב פרטני בין עוברים. הלב נבחר לביצוע מדידות בשל גודלו הגדול המאפשר מיקום נוח למדוד תוכן ניאון של הדם לפני כניסה לכליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות תוכנה סטטיסטית מתאימה. השוואה בין קבוצות למובהקות סטטיסטיות באמצעות מבחן t של סטודנט. </li></ol>

<ol>
	<li>Hentschel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).</li><li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+zebrafish+kidney:+a+tale+of+two+tubes.">Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes.</a> Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).</li><li>Ma, M., Jiang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged2a-notch+signaling+mediates+cell+fate+choice+in+the+zebrafish+pronephric+duct.">Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct.</a> PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).</li><li>Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+the+differentiation+of+transporting+epithelia+and+multiciliated+cells+in+the+zebrafish+pronephros.">Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros.</a> Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Cardenas-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+CCDC28B+reveals+its+role+in+ciliogenesis+and+provides+insight+to+understand+its+modifier+effect+on+Bardet-Biedl+syndrome.">Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome.</a> Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).</li><li>Osborn, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+FTO+antagonises+Wnt+signaling+and+leads+to+developmental+defects+associated+with+ciliopathies.">Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies.</a> PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).</li><li>Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+body+stability+and+ciliogenesis+requires+the+conserved+component+Poc1.">Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1.</a> J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).</li><li>Tobin, J. L., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+renal+function+in+zebrafish+models+of+ciliopathies.">Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies.</a> Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).</li><li>Torres, V. E., Harris, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease:+the+last+3+years.">Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years.</a> Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).</li><li>Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease+-+clinical+and+genetic+aspects.">Autosomal dominant polycystic kidney disease - clinical and genetic aspects.</a> Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).</li><li>Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+kidney+disease.+1:+Identification+and+analysis+of+the+primary+defect.">Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect.</a> J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).</li><li>Reynolds, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+splicing+in+the+PKD2+gene+as+a+cause+of+polycystic+kidney+disease.">Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease.</a> J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).</li><li>Pazour, G. J., San Agustin, a. j. t., Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystin-2+localizes+to+kidney+cilia+and+the+ciliary+level+is+elevated+in+orpk+mice+with+polycystic+kidney+disease.">Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease.</a> Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).</li><li>Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polycystic+kidney+disease+proteins,+polycystin-1,+polycystin-2,+polaris,+and+cystin,+are+co-localized+in+renal+cilia.">The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia.</a> J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).</li><li>Baker, K., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+of+cilia+in+disease:+the+human+ciliopathies.">Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies.</a> Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).</li><li>Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+and+signaling+pathways+in+mammalian+development,+health+and+disease.">Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease.</a> Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).</li><li>Hruscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR/Cas9+genome+editing+with+low+off-target+effects+in+zebrafish.">Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish.</a> Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system.">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li><li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+morpholino+experiments:+don't+stop+making+antisense.">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).</li><li>Gerlach, G. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organogenesis+in+the+zebrafish:+insights+into+vertebrate+nephrogenesis+and+regeneration.">Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).</li><li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>Forsythe, E., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bardet-Biedl+syndrome).">Bardet-Biedl syndrome).</a> Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).</li><li>Corbetta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+simple+kidney+cysts+in+patients+with+primary+hyperparathyroidism.">High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism.</a> J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).</li><li>Veleri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+Bardet-Biedl+syndrome+gene+BBS9/PTHB1+leads+to+cilia+defects.">Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects.</a> PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).</li><li>Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , (2003).</li><li>Chang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permselectivity+of+the+glomerular+capillary+wall+to+macromolecules.+II.+Experimental+studies+in+rats+using+neutral+dextran.">Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran.</a> Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

דג הזברה להציע כלי רב ערך למודל מחלה גנטית אנושית, השימוש בם כמכשיר מדעי לin vivo מחקר איפשר מחקרים מפורטים של ההתפלגות הגנטית של רבים מערכות ביולוגיות, כוללים הכליות. הרבה עכשיו הבין על איך כליות דג הזברה מתפתחות ופונקציות. הדמיון הבולט לnephrogenesis והומולוגיה עם גנים ...

הכליה האנושית משחקת תפקיד מכריע בסינון פסולת המטבולית מן הדם ומתאושש מומסים נדרשים כדי לקיים הומאוסטזיס הסלולר. ישנם מספר מחלות גנטיות אנושיות הגורמות להפרעות בתפקוד כליות. מחלת הכליות התורשתית הנפוצה ביותר היא מחלה אוטוזומלית דומיננטית בכליות פוליציסטיות (ADPKD) מאופיינת בהתפתחות של שלפוחיות נוזל מילא בתוך צינוריות נפריטית; הנזק שנגרם על ידי cystogenesis הוא מזיק לכליות פונקציה 10. יש ADPKD התרחשות של 1: 800 - 1: 1000 ומהווה 8-10% מהחולים באי ספיקת כליות סופנית (ESRF) 11. מספר גנים היו מעורבים לגרום ADPKD כולל polycystin-1 (PKD1) ו-2 (PKD2), המהווים כ 85% ו- 15% מהמקרים, בהתאמה 12,13. יתר על כן, מוצרי הגן לPKD1 ו-2 למקם את cilium והם יסוד לciliogenesis 14,15. יש עכשיו משפחה מוכרת של הפרעות גנטיות אנושיות, הידוע בשםciliopathies, המשפיע על פעילות cilia ולגרום למחלת כליות כרונית 16. המספר הולך וגדל של מחלות גנטיות אנושיות המשפיעות על התפתחות ותפקוד הריסים הוא ציור העניין העולמי באברון שריד שנחשב בעבר זה. Cilium, בליטה סלולרית דמוי שיער, מועשרת בקולטנים ותעלות יונים הכרחיים לתמרה של אירועי תא איתות מפתח. Cilium מורכב מaxoneme מבוסס microtubule, מובנה בדרך כלל לתשע כפילויות microtubule מסודרות רדיאלית עם או בלי זוג microtubules הגופייה מרכזי. מבנה axonemal מגדיר את הסוג ואופן פעולה הריסים. הסדר microtubule 9 + 2 מעניק תנועתיות לcilium שבו הוא ניצל בתנועה של נוזלים על פני משטחי אפיתל. תצורת 9 + 0 היא הניעה שאינה אלא הוא האמינה בעיקר פונקציה באירועי איתות תאית 17. מלבד CKD, את ההשלכות של חוסר תפקוד הריסים הן קבוצה של מאפייןתכונות ciliopathy הכוללות, השמנת יתר, ניוון רשתית, פולידקטיליה, ופגיעה קוגניטיבית 16. עם זאת, CKD הוא בין המזיקה ביותר לאיכות חיים של החולה ולכן כוח מניע מרכזי מאחורי הפיתוח של דגמים מתאימים בvivo לCKD הריסים קשורים. דג הזברה הוא מודל מצוין להבין את האטיולוגיה של מחלה גנטית אנושית. הפיתוח מהיר שלהם, ייצור של מספר הגדול של ביצים, רקמה שקופה, וצמיחה ברחם לשעבר מאפשר תהליכי התפתחות דג הזברה להיות דמיינו ואירועים ביולוגיים מניפולציות בקלות רבה. גנים ניתן לשנות גנטי באמצעות ההצלחה האחרונה של כלים לעריכת הגנום (CRISPR 18 וTALENS 19), הפילו את השימוש בטכנולוגית morpholino antisense 20, או מוסדרים פרמקולוגית על ידי התוספת של תרכובות לסביבה המימית שלהם. ואכן, דג הזברה להציע פלטפורמה למתחייבת דוארxperiments שאינם מתירנית במודלים של בעלי חיים אחרים. בעוד דג הזברה הם בעלי חוליות פשוטות יחסית (בהשוואה לבני אדם) הם חולקים איברים רבים נשמרים פונקציונלי, גנים, ותהליכי איתות במשותף עם בני אדם. לדוגמא, בכליות דג הזברה היא דומות להפליא במבנה ותפקוד בהשוואה לבני האדם 21,22. עם זאת, בניגוד לכליות היונקים שמתפתחת דרך רצף של שלבים, כל אחד מסומן על ידי כליות מפותחות יותר (כִּליַת רֵאשִׁית, כליה בינים, וmetanephros), דג הזברה העוברית מתפתחת רק כִּליַת רֵאשִׁית, בצורה לא בוגרת ביותר של כליות. בעוד ניתן למצוא מיליוני nephrons להרכיב את אבני הבניין של הכליות היונקים, עובר דג הזברה יש רק שניים. Glomeruli, המאפשרת לתסנין הדם הראשוני, הם התמזגו בקו האמצע רק הגחון לאב העורקים. מסנני דם דרך glomeruli לtubules pronephric הפועלים caudally לאורך הציר, פיוזינג לפני היציאה דרך הביב. Tu pronephricbules הם ריסי בכבדות עם cilia ניעתי, כי הם מתירנית לזרימה של תסנין לכיוון יציאת הזנב 3,4. מבנה pronephric פשוט זו שומר על הומאוסטזיס דג הזברה דרך מספר שבועות של צמיחת זחל שבו הם לפתח סופו של דבר למבנה כליה בינים מורכב יותר 21. עם זאת, מעולם לא דג הזברה מתפתחת metanephros 21. למרות מוזרויות דג הזברה, נפרון דג הזברה הוא מקוטע עם פרופילי ביטוי גנים שווים לזה שנצפה ביונקים ובכך מציע ללא תחרות במודל vivo לnephrogenesis 3,22. באופן שיגרתי בחולים, נבחנו צורך בתפקוד כליות באמצעות סדרה של בדיקות דם ושתן. בדרך כלל הדם מנותח למומס מלחים, אוריאה וקריאטינין. רמות גבוהות של אוריאה, קריאטינין וריכוזי מלח חריגים מעידות על בעיות בתפקוד כליות. בדיקת שתן באמצעות מדיד colorimetric מזהה רמות חריגות של החלבון, blooד, מוגלה, חיידקים והווה סוכר בדגימות שתן. בדיקות כאלה בדרך כלל דורשים כ 30 מיליליטר של שתן או 5 - 10 מיליליטר של דם. זה כבר קשה לתרגם סוגים אלה של מבחני לקטנים באורגניזמים מודל vivo, כגון דג הזברה, בעיקר בשל האופי הבלתי אפשרי של איסוף דם או שתן מספיק כדי לבצע את assay. כאן, אנו מתייחסים לחוסר בדיקות פונקציה מתאימות דג הזברה כליות ולתאר טכניקה חדשנית למחקר שלה. על ידי הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך זרם הדם אנו יכולים לפקח ובנפרד לכמת לאורך זמן הסינון והפרשה של פעילות ניאון מהדם דרך הכליות. שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור נזק לכליות הנגרמות על ידי מחלה, שאנו מספקים דוגמה ל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="708">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller</td>
			<td style="width:136px;">Intracel</td>
			<td style="width:136px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">borosilicate standard wall capillaries</td>
			<td style="width:136px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:136px;">VWR International</td>
			<td>631-0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Epoxy Resin Glue</td>
			<td style="width:136px;">Evo-Stik</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>D-1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">air compressor&#160;</td>
			<td>Jun-Air</td>
			<td>OF302-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Picospritzer III&#160;</td>
			<td>Parker Instruments&#160;</td>
			<td>051-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">compact 3-axis control micromanipulator&#160;</td>
			<td>Marzhauser</td>
			<td>MM33&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dissecting stereo microscope</td>
			<td style="width:136px;">Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stage micrometer&#160;</td>
			<td>Pyser- SGI</td>
			<td>02A00404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay

עובר דג הזברה מציע מודל צייתן ללמוד organogenesis ומודל מחלה גנטית אנושית. למרות פשטותו היחסית, בכליות דג הזברה מתפתחות ופונקציות כמעט באותה הצורה כמו בני אדם. הבדל עיקרי בבנייה של הכליה האנושית הוא נוכחותם של מיליונים nephrons בהשוואה לדג הזברה שיש רק שניים. עם זאת, פישוט מערכת כה מורכבת ליחידות פונקציונליות בסיסיות סייע ההבנה של איך כליות מפתחת ומפעילות. בדג הזברה, קו האמצע ממוקם glomerulus אחראי על סינון הדם הראשוני לשתי צינוריות pronephric שלסטות לרוץ בילטרלי במורד הציר העוברי לפני שהוא נדבק זה לזה בביב. Tubules pronephric מאוכלסים בכבדות על ידי cilia ניעתי שיקל על התנועה של תסנין לאורך אבובית מפולחת, המאפשר החלפה של מומסים שונים עד שלבסוף יציאה באמצעות 2-4 הביב. גנים רבים אחראים למחלת כליות כרונית, including אלה הקשורים לciliogenesis, נחקרו בדג הזברה 5. עם זאת, תיקו גדול בחזרה היה הקושי בהערכת תפקוד כליות דג הזברה לאחר מניפולציה גנטית. מבחני מסורתיים למדידת הפרעות בתפקוד כליות בבני האדם הוכיחו translational לא לדג זברה, בעיקר בשל הסביבה המימית שלהם וגודל קטן. לדוגמא, זה לא אפשרי מבחינה פיזית כדי לחלץ דם עוברי ממבוימים דגים לניתוח של תוכן אוריאה וקריאטינין, כפי שהם קטנים מדי. בנוסף, דג הזברה אינה מייצר מספיק שתן לבדיקה על &#39;המדיד&#39; פרוטאינוריה פשוטה, המבוצע לעתים קרובות במהלך בדיקות ראשוניות מטופל. אנו מתארים assay ניאון שמנצל את השקיפות האופטית של דג הזברה כדי לפקח כמותית האישור של צבע ניאון, לאורך זמן, מכלי הדם והחוצה דרך הכליות, לתת קריאה מתוך תפקוד הכלייתי 1,6-9.

תסמונת Bardet-Biedl (BBS) היא ciliopathy הטרוגנית נדיר שפוגע בכ -1: 160,000 איש ברחבי העולם 16. חולים הנוכחיים עם מספר הבעיות הקשורות כוללים כליות פוליציסטיות, לאחר מכן חולים לעתים קרובות דורשים דיאליזה או השתלת כליה 24. ESRF הוא הגורם השכיח ביותר למוות בBBS, עם כ -30% מחולים שפתח CK...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay at JoVE.com

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

דג הזברה הוא כלי פופולרי למודל מחלת כליות כרונית (CKD). עם זאת, גודלם הקטן עושה את זה בלתי אפשרי להעריך תפקוד הכלייתי בשיטות מסורתיות. אנו מתארים assay אישור כליות צבע ניאון 1 המאפשר ניתוח כמותי של תפקוד כליות דג הזברה בCKD.

הערכה של תפקוד כליה דג הזברה באמצעות assay עמילות פלורסנט

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

evaluation-zebrafish-kidney-function-using-fluorescent-clearance

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K Views.  University College London.  דג הזברה הוא כלי פופולרי למודל מחלת כליות כרונית (CKD). עם זאת, גודלם הקטן עושה את זה בלתי אפשרי להעריך תפקוד הכלייתי בשיטות מסורתיות. אנו מתארים assay אישור כליות צבע ניאון 1 המאפשר ניתוח כמותי של תפקוד כליות דג הזברה בCKD. 

Video: Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

שימוש בתגובה optokinetic ללמוד לתפקד החזותי של דג הזברה

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

תחזוקה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; אוכלוסיית קייג

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.