Deseos RAW agradecer a los miembros de la Zon y Davidson laboratorios de investigación de sus innumerables contribuciones a ayudar a desarrollar estrategias que han ido dado forma a esta técnica de disección en el pez cebra adulto en la última década. Además, deseamos expresar nuestra gratitud a los miembros del personal del Centro de Notre Dame para la Investigación de pez cebra para proporcionar una excelente atención permanente para la cría de nuestra colonia de pez cebra. RAW obtuvo financiación de la investigación de la adjudicación NIH NIDDK conceder DK083512 y de laboratorio generosa financiación inicial de la Universidad de Notre Dame.

1. La disección del riñón adultos de pez cebra a partir de una muestra de animales no fijadas <ol><li> Seleccione un pez cebra adultos entre los 3-6 meses de edad para la disección. </li><li> La eutanasia a los peces mediante la colocación en un plato con tricaína 0,2% 7,0 pH de aproximadamente 4-5 minutos, observando cuidadosamente para ver que las branquias dejan de moverse y el corazón deja de latir. </li><li> Con una cuchara, levantar los peces desde el baño tricaína en una pequeña cantidad de solución, se decanta la solución y suavemente coloque el animal en una toalla de papel. </li><li> Use un par de tijeras afiladas para quitar la disección de la cabeza del animal, haciendo un corte justo detrás del opérculo branquial (Figura 1, la ruta A). Deseche la cabeza en un recipiente para residuos biológicos peligrosos. </li><li> Use las tijeras para abrir la disección del cuerpo del animal, haciendo una incisión ventral largo, a partir de la cabeza y terminando en la cola en la base de la aleta caudal (Figura 1, B ruta). </li><li> Quitar los órganos internos del animal con un par de pinzas de disección / fórceps, y colocarlos en los residuos de riesgo biológico. Tenga cuidado de no cepillar la pared dorsal del cuerpo, ya que este es el lugar de los riñones (Figura 2). Si ha seleccionado un pez hembra, será necesario para sacar los óvulos en desarrollo de la cavidad del cuerpo, que puede ser más fácil de hacer con un par de ángulo de fórceps o pinzas. </li><li> Use agujas de disección para pin abrir las paredes del cuerpo a una bandeja de disección, y el ángulo de las patillas, para que el riñón se puede visualizar. El riñón posee una forma característica (cabeza, tronco / silla de montar, la cola) y el color, se mezcle con la pigmentación de tonalidades negro (Figura 2). También puede ver la aorta llena de sangre periférica, que corre por la línea media de la estructura de los órganos. </li><li> Use unas pinzas finas para separar el riñón de la pared dorsal del cuerpo, utilizando un par de pinzas para levantar el riñón como órgano separado de los tejidos conectivos que lo sustentan. </li><li> Con cuidado, coloque el riñón en el vehículo deseado para estudios de células vivas, tales como un tubo de microcentrífuga que contiene 1x PBS para la preparación de FACS. </li></ol> 2. Preparación y disección del riñón adultos de pez cebra a partir de una muestra de animales fijos <ol><li> Prepare una solución de 4% PBST paraformaldehyde/1X. Hervir la solución para disolver la PFA en la solución, dejar enfriar la mezcla a 4 ° C y añadir 0,1% dimetilsulfóxido. Hemos tenido el mayor éxito con la preservación del tejido recién el uso de soluciones de PFA en comparación con alícuotas congeladas. Hacer una solución suficiente para sumergir el pez cebra adulto durante la disección. </li><li> Llenar una bandeja de disección con una solución de fijación suficiente para sumergir los adultos de pez cebra durante la disección. Llevamos a cabo los pasos siguientes con esta bandeja colocada bajo el microscopio, que puede ser colocado en una campana de productos químicos para minimizar la exposición a los olores de la fijación. </li><li> Seleccione un pez cebra adultos entre los 3-6 meses de edad para la disección. </li><li> La eutanasia a los peces mediante la colocación en un plato con tricaína 0,2% pH 7.0 durante aproximadamente 5 minutos, observando cuidadosamente para ver que las branquias y golpes parar el corazón. </li><li> Con una cuchara, levantar los peces desde el baño tricaína en una pequeña cantidad de solución, se decanta la solución y suavemente coloque el animal en una toalla de papel. </li><li> Use un par de tijeras afiladas para quitar la disección de la cabeza del animal, haciendo un corte justo detrás del opérculo branquial (Figura 1, la ruta A). Deseche la cabeza en un recipiente para residuos biológicos peligrosos, e inmediatamente colocar el animal en la bandeja de disección de PFA que contienen. </li><li> Use las tijeras para abrir la disección del cuerpo del animal, haciendo una incisión ventral largo, a partir de la cabeza y terminando en la cola en la base de la aleta caudal (Figura 1, B itinerario circuito), y mantener el cuerpo parcialmente sumergido durante el procedimiento. </li><li> Quitar los órganos internos del animal con un par de pinzas de disección / fórceps, y colocarlos en los residuos de riesgo biológico. Tenga cuidado de no cepillar la pared dorsal del cuerpo, ya que este es el lugar de los riñones (Figura 2). </li><li> Use agujas de disección para pin abrir las paredes del cuerpo, y el ángulo de las patillas, para que el riñón se puede visualizar. El riñón posee una forma característica (la cabeza, silla de montar, la cola) y el color, se mezcle con la pigmentación de tonalidades negro (Figura 2). También puede ver la aorta llena de sangre periférica, que corre por la línea media de la estructura de los órganos. </li><li> Fijar la muestra durante la noche, la colocación de la bandeja a 4 ° C cuando haya terminado con la organización de las muestras que desee. </li><li> Al día siguiente, retire la solución de PFA de la bandeja y reemplazarla con 1x PBST. </li><li> Use unas pinzas finas para separar cuidadosamente del riñón de la pared dorsal del cuerpo, usando un par de pinzas para levantar el riñón como órgano separado de los tejidos conectivos que lo sustentan. El tejido del riñón será suave y flexible del DMSO en la solución de fijación, por lo que es posible dividir el órgano del riñón entero en una sola pieza. </li><li> Utilice un niveldio pipeta para colocar el riñón en un tubo de microcentrífuga. </li><li> El riñón puede ahora ser tratados posteriormente para llevar a cabo montaje histológicos o en su totalidad in situ estudios de expresión génica basada en el estudio deseado. </li></ol> 3. Los resultados representativos: Los pasos que se esquematiza en la figura 1 indican el procedimiento de disección. El riñón puede ser identificado en base a su característica forma y coloración, y la localización anatómica en la pared dorsal de la cavidad del cuerpo del animal, como se muestra en la Figura 2. Después de la disección de una muestra fija de riñón, montar toda la hibridación in situ se puede utilizar para localizar la expresión de un gen de interés, como se muestra en la Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1: Procedimiento que permite el acceso directo para la disección del riñón adulto pez cebra. (A) pez cebra eutanasia se diseca en forma escalonada (indicado por los números y las flechas) para dar al investigador el acceso más fácil a los órganos riñón completo. Las imágenes de la cavidad abdominal antes (B) y después (C) la extracción de los órganos abdominales. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2:. Visualización del riñón del pez cebra en una muestra no fijadas Tras la eliminación de órganos en la cavidad del cuerpo, el riñón aparece como un solo órgano, aplanado que se adhiere a la pared dorsal del cuerpo a través de los tejidos conectivos (A), y ha sido esquematizado (B) para mostrar su forma anatómica. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3: Todo el montaje hibridaciones in situ realizadas en el órgano renal del adulto entero. (A) cadherin17 transcripciones se detectan en los túbulos de las nefronas del riñón adulto, ampliada en (A) (B). Transcripciones mafba se localizan proximal tipos de células nefrona en el riñón adulto (en comparación con los túbulos todo en el panel A). (B &#39; ) Una visión ampliada de expresión mafba revela que las transcripciones son específicamente localizada en el podocito (P), las células de la sangre del filtro (glomérulo) y túbulo contorneado proximal (PCT).

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).</li><li>de Groh, E. D., Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Jackson, R. L., Dai, W., Kitchens, C. A., Day, B. W., Smithgall, T. E., Hukriede, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+histone+deacetylase+expands+the+renal+progenitor+cell+population.">Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor cell population.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 21, 794-802 (2010).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Las células madre adultas son componentes dinámicos y esenciales que mantienen la forma del cuerpo adulto 1. Las células madre adultas también pueden servir para contrarrestar los daños en que incurra el cuerpo durante los estados de enfermedad y la disfunción o pérdida de las células madre adultas pueden llevar a la disminución de la función del órgano y se ha implicado a la unidad de neoplasias malignas y contribuyen al envejecimiento. Las células madre adultas tienen propiedades celulares que los distinguen de otros tipos de células diferenciadas. Tras la división celular, las células madre adultas son capaces de auto-renovación y la producción de células progenitoras que, a su vez puede dar lugar a la descendencia diferenciada distintas. Existe un gran interés en la comprensión de las vías que regulan las decisiones del destino celular y la potencia de las células madre adultas, debido a su importante papel en la homeostasis del tejido 1. Por ejemplo, muchos científicos en la actualidad tratan de identificar las señales que mantienen diferentes poblaciones de células madre adultas en su nicho o microambiente especializado, y cómo este lugar se ve afectada por factores humorales. Adulto las células madre hematopoyéticas (HSC) son células pluripotentes que impulsan la renovación continua de las células de la sangre en los animales 8. La hematopoyesis es un proceso dinámico que está constantemente en curso durante la vida de un organismo vertebrado por la madurez tipos diferenciados de células sanguíneas son de corta duración y por lo tanto deben ser reemplazados regularmente. Cuando se dividen, HSCs satisfacer esta demanda fundamental de auto-renovación y la producción de una serie de células progenitoras que dan origen a los eritrocitos, los linajes de megacariocitos, linfoides y mieloides. Cada uno de estos tipos de células sanguíneas realiza funciones únicas en la circulación, incluido el suministro de gas a cambio de tejido, una forma para el sellado de las lesiones de los vasos sanguíneos a través de la formación de coágulos, o los mecanismos de defensa contra los patógenos invasores. Mientras que las CMH se han reconocido durante muchos años, una gran cantidad de preguntas fascinantes siguen sin respuesta acerca de estas células increíble. Estudios recientes han identificado las subclases de HSCs con distintas a largo plazo de renovación de auto-propiedades, y el esclarecimiento de los componentes del nicho de mercado y las señales que modulan el comportamiento de HSC 8. El pez cebra es ahora uno de los pilares de la hematopoyesis paradigmas de la investigación, en base a los atributos genéticos y moleculares de este modelo animal 8. Investigación utilizando el pez cebra ha dado lugar a nuevos conocimientos sobre la biología de HSC que se conservan en los vertebrados superiores como los mamíferos, destacando la relevancia de las investigaciones biomédicas sangre de pescado 8. Históricamente, el conocimiento sobre las CEH ha allanado el camino para las expediciones que buscan descubrir si otros órganos del cuerpo son mantenidos por las células madre adultas. Numerosas poblaciones de células madre adultas están apreciado que existen, que van a través de diversas estructuras del cerebro con el intestino, la piel y el músculo esquelético. Continuos esfuerzos en el campo de células madre tratan de determinar cómo las células madre adultas y los tipos diferenciados hasta otras células pueden mostrar mayor potencia en diversos entornos. Con respecto a los riñones, no ha habido un gran debate entre los nefrólogos en cuanto a si las células madre existen renal 16. Investigaciones independientes han documentado poblaciones de células de riñón de los mamíferos que poseen distintos grados de potencial regenerativo, pero una comprensión coherente de estos informes aún no se ha logrado. Curiosamente, hay pruebas sólidas para apoyar la idea de que muchas especies de peces poseen células que pueden alimentar con firmeza la regeneración de las nefronas dañadas, así como crecer nefronas totalmente nuevo en la edad adulta 9. Trabajos recientes han identificado las características moleculares de las células del riñón adulto madre en el pez cebra 10,11, y demostró la potencia de auto-renovación de los llamados renal células madre / progenitoras (RPC) 11. Se necesitan más estudios para determinar si las células del riñón análogos están presentes en los mamíferos. Sin embargo, continuaban las investigaciones sobre los mecanismos celulares y moleculares que regulan la RPC de pescado puede dar una idea de cómo hazañas regenerativa puede ser estimulada en el riñón de mamífero. Es evidente que aún queda mucho por comprender acerca de RPC, y que las muchas herramientas disponibles para el investigador del pez cebra pueden ser implementadas para abordar estas cuestiones intrigantes. En este protocolo, que describe nuestro método para la identificación anatómica y la disección del riñón adultos de pez cebra. Medidas alternativas se pueden utilizar para analizar el riñón, como la apertura de la cavidad abdominal con una incisión ventral con tijeras de disección, sin embargo, nos hemos encontrado con más éxito en el acceso a todo el riñón cuando la pared abdominal se fija abierta y la cabeza se retira. Investigadores de la sangre y son del mismo tipo que desean aislar y trabajar con estos tipos de células pueden utilizar cualquiera de los métodos de disección. Cabe señalar que el método se describe para el aislamiento y working con el riñón en los adultos de pez cebra no se limita a los científicos que deseen realizar preguntas de la biología de células madre adultas, como la disección de este órgano puede facilitar los estudios a los investigadores llevar a cabo investigaciones sobre temas que van desde la fisiología del envejecimiento. Además, este método puede ser complementado con otras tecnologías como los transgénicos, con el fin de la etiqueta molecular y luego purificar y estudiar las subpoblaciones discretas de células sanguíneas o de riñón de tipo salvaje o genéticamente pez cebra mutante 11. Mirando hacia el futuro, como los procesos de purificación detallada de los tipos de células madre y progenitoras es vital para obtener conocimiento acerca de cómo se regula su comportamiento, como las pruebas de funcionamiento, tales como el trasplante de progenitores o cultivo constituyen la base sobre la cual la potencia y la identidad de estas células se define. Los avances recientes en métodos progenitoras hematopoyéticas cultura abrir muchas nuevas vías de estudio, y puede ser adaptado para el cultivo de las poblaciones renal 17. Pez cebra genética química han tenido éxito en la identificación de las vías que modulan HSCs y progenitores renal en diversos contextos 18-20, y seguirá siendo una vía útil para poner a prueba en combinación con las técnicas de biología por encima de la celda. En su conjunto, ha habido una serie de aportaciones innovadoras en los campos de la hematología y la nefrología con el modelo de pez cebra, y continuó la investigación en estos ámbitos se compromete a ejercer otras ideas de transformación en los próximos años.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Tijeras de disección </td><td> Roboz </td><td> RS-5882 </td></tr><tr><td> Pinzas de disección </td><td> Roboz </td><td> RS-5010 </td></tr><tr><td> Disección ángulo fórceps </td><td> Roboz </td><td> RS-5058 </td></tr><tr><td> Tricaína </td><td> Sigma </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Electron Microscopy Servicios </td><td> 19210 </td></tr></tbody></table>

dissection of the adult zebrafish kidney

Los investigadores que trabajan en el floreciente campo de la biología de células madre adultas tratar de entender las señales que regulan el comportamiento y la función de las células madre durante la homeostasis normal y los estados de enfermedad. La comprensión de las células madre adultas tiene amplias implicaciones de largo alcance para el futuro de la medicina regenerativa 1. Por ejemplo, un mejor conocimiento sobre la biología de células madre adultas pueden facilitar el diseño de estrategias terapéuticas en las que los órganos se activan para curarse a sí mismos o incluso la creación de métodos de órganos en crecimiento in vitro que pueden ser transplantados a los humanos 1. El pez cebra se ha convertido en un modelo animal de gran alcance para el estudio de la biología de las células de vertebrados 2. Ha habido una amplia documentación y análisis del desarrollo embrionario en el pez cebra 3. Sólo recientemente los científicos han tratado de documentar la anatomía y técnicas quirúrgicas de adultos disección 4, ya que ha habido un movimiento progresista dentro de la comunidad de pez cebra para ampliar las aplicaciones de este organismo de investigación para los estudios en adultos. Por ejemplo, hay expansión de los intereses en el uso de pez cebra para investigar la biología de poblaciones de células madre adultas y hacer modelos sofisticados para adultos de enfermedades como el cáncer 5. Históricamente, el aislamiento del riñón en los adultos de pez cebra ha sido fundamental para el estudio de la hematopoyesis, como el riñón es la localización anatómica de la producción de células sanguíneas en el pescado 6,7. El riñón está compuesto de unidades nefrona funcional se encuentra en los acuerdos arborized, rodeado de tejido hematopoyético que se dispersa a través de los espacios intermedios. El componente hematopoyético se compone de células madre hematopoyéticas (HSC) y sus descendientes que habitan en el riñón hasta que diferenciar terminal 8. Además, ahora se aprecia que un grupo de la función renal células madre / progenitoras (RPC) también habitan en el órgano del riñón del pez cebra y permitir la regeneración del riñón y el crecimiento, como se observa en otras especies de peces 11.09. A la luz de este nuevo descubrimiento, el riñón del pez cebra es un órgano que alberga la ubicación de dos grandes oportunidades para los estudios de biología de células madre adultas. Está claro que muchas cuestiones pendientes podría ser un buen servicio con este sistema experimental. Para alentar la expansión de este campo, es beneficioso para documentar los métodos detallados de visualizar y luego aislar a los órganos del pez cebra riñón adulto. Este protocolo detalla nuestro procedimiento para la disección del riñón en los adultos tanto de animales no fijadas y fijo. La disección de los órganos renales se puede utilizar para aislar y caracterizar las células madre hematopoyéticas y renal y su descendencia mediante técnicas establecidas, como la histología, la fluorescencia de clasificación de células activadas (FACS) 11,12, 13,14 perfiles de expresión, y el trasplante 11,15. Esperamos que la difusión de este protocolo se proporcionará a los investigadores con los conocimientos necesarios para poner en práctica un uso más amplio de los estudios de pez cebra que en última instancia, puede ser traducido para la aplicación humana.

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Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

El riñón del pez cebra es el hogar de los renales y hematopoyéticas adultas células madre / progenitoras, y representa una oportunidad excepcional para estudiar estos tipos de células y su progenie en un organismo modelo de vertebrados. En este sentido, demostrar un procedimiento de disección detallada que permite al investigador identificar y extirpar el riñón del pez cebra adulto, que puede ser utilizado para aplicaciones tales como el aislamiento de células, los trasplantes, y los estudios de expresión de los riñones y / o poblaciones de células sanguíneas.

La disección del riñón adultos de pez cebra

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

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36.5K vistas.  University of Notre Dame. El riñón del pez cebra es el hogar de los renales y hematopoyéticas adultas células madre / progenitoras, y representa una oportunidad excepcional para estudiar estos tipos de células y su progenie en un organismo modelo de vertebrados. En este sentido, demostrar un procedimiento de disección detallada que permite al investigador identificar y extirpar el riñón del pez cebra adulto, que puede ser utilizado para aplicaciones tales como el aislamiento de células, l...

Video: Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

El trasplante de médula del riñón entero en adultos de pez cebra

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Investigación

Biología

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

La disección fina y gruesa de los epitelios sensoriales del oído interno en adultos de pez cebra ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

La disección de los órganos del pez cebra adultos

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

El trasplante de células directamente en el riñón de adultos de pez cebra

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

La disección del corazón en las larvas, juveniles y adultos de pez cebra, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la regeneración de adultos de pez cebra Aleta de cola

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavage adultos de pez cebra

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Análisis de Composición Nephron y función en el riñón adultos de pez cebra

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...