Jaipreet Bharj tarafından sağlanan teknik destek. Bu çalışma, AB-FP7 (SYSCILIA -241.955) ve Hollanda Böbrek Vakfı (CP11.18) hibe ile desteklenmiştir.

Etik Beyanı: Hayvan bakım, hayvancılık ve prosedürler Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 Tüm hayvan deneyleri Biyolojik uygun Ana Sekreteri (PIL No 70/7892) tarafından verilen lisanslar altında gerçekleştirilmiştir tarafından tanımlanan ve kontrol edilir Hizmetleri Yönetimi Grubu ve Biyolojik Hizmetleri Etik Komitesi, SGUL, Londra, İngiltere. Tüm çabalar kullanılan hayvanların sayısını azaltmak ve refah acı en aza indirmek ve geliştirmek amacıyla hem usul ve hayvancılık rafine yapılmıştır. 1. Araçların, Anestezik hazırlanması ve Floresan Boya <ol><li> Bir mikropipet çektirmesi ve (filamentler olmadan) borosilikat standart duvar kılcal mikroenjeksiyon (Şekil 1A) için uygun uzunlukta iğneler çekin kullanma. </li><li> Perikard (Şekil 1B) içine kolay enjeksiyon için embriyo yönlendirme için bir agaroz kalıp olun. Tutkal yaklaşık on cam mikroskop slBirlikte ides ofset slaytlar bir &#39;merdiven&#39; oluşturmak için. En iyi sonuçlar için, her slayt merkezinde hızlı set epoksi reçine yapıştırıcı bir damla kullanın. </li><li> Kaldırmak, bir Bunsen beki ısıtılmış neşter kullanılarak iki adet 10 ml&#39;lik plastik pipetler ile uzunluk yarım yaklaşık 78 mm&#39;lik bir bölümünü kesip pipet gibi uygun biter. Takın ve yığılmış cam slaytlar tutkal (epoksi reçine) pipet bölümleri kalıp 90 mm Petri kabı içine daldırma izin istikrar sağlamak. Slayt köşeleri Petri kabı yere dik hizaya sağlamak için her türlü çabayı gösteriyoruz. Tutkal zamanı ayarlamak için izin ver. </li><li> Balık, su içerisinde yapılan% 2 agaroz çözelti içinde kalıp döküm (akvaryum de elde edilmiş). Bir 90 mm Petri kabı içine agaroz dökün ve istiflenmiş slayt agaroz yüzey altında bir açı ile su altında kenarları izin veren açık bir petri kabı üzerine kalıp yerleştirin. 30 dakika için laboratuar bankta ayarlamak için bırakın. </li><li> Slayt döküm çıkarın ve taze balık su ile slayt baskılı agaroz kapakTricaine anestezik içeren 1:25 oranında (adım 1.9 bakınız). </li><li> Rodamin dekstran (RD) boya çözümleri olun. Süspanse rodamin B 10,000 MA, 50 mg / ml&#39;lik bir stok konsantrasyonu için otoklava, aşırı saf su içinde dekstran etiketli. Mikroenjeksiyon için daha otoklavlanmış, aşırı saf su içinde 5 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar stok seyreltin. NOT: Pigmentli hücreler 24 saat sonra döllenme (hpf) den Zebra balığı ayırt başlar; Bu görüntü alımı sırasında floresan işaretçileri belirsiz olabilir. </li><li> Blok tirozinaz inhibe etmek suretiyle melanojenezin K -Phenylthiourea (PTU) kullanarak melanosit oluşumunu inhibe eder. Tam olarak çözündürülmesi için 60 ° C&#39;de akvaryum su, ısı çözeltisi propiltiourasil&#39;in tozunun çözülmesiyle propiltiyourasil&#39;i bir% 0.003 stok solüsyonu olun. </li><li> , Metilen mavisi çözeltisi, hafif fungisit zebrafish embriyolar inkübe mantar blum önlemek ve hayatta kalma artırmak için. U içinde% 0.1 Metilen mavisi ihtiva eden, metilen mavisi stok çözeltisi 2 ml ilave edilirltrapure su, standart bir embriyo ortamı olarak akvaryum su ve kullanım 1 L. </li><li> &#39;Zebra balığı Kitap&#39; 23 belirtildiği gibi Tricaine / etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu 15 mM stok konsantrasyonu Makyaj. Embriyoların uyutmak ve dolayısıyla mikroenjeksiyon işlemi gerçekleştirmek için onları hareketsiz. </li><li> Embriyoların anestezi sonra, metilselüloz, toksik olmayan ve yapışkan özelliklerini kullanarak görüntüleme için, yönlendirilmesi. % 3 metilselüloz 200 ml&#39;lik bir hazırlık yapmak buz üzerinde 30 dakika karıştırıldı ve bir yer için -20 ° C &#39;de suyun 130 ml soğuk için. , Bir cam beher içinde, 80 ° C&#39;ye kadar 70 mi kadar su Isı metilselüloz 6 g ekleyin ve bütün parçacıkları ıslatıldığında ve düzgün bir şekilde dağılmıştır kadar bir cam çubuk kullanılarak çalkalayın. Buz soğukluğunda su ekleyin karıştırın ve hazırlama 50 ml tüpler içinde aliko haline önce 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de soğumaya bırakın. NOT: sıcaklık düşürülmesi metil çözünür olmayı sağlar. Çözelti daha kalın olacakToz hidratlar gibi. % 3 metil bakteriyel 4 ° C &#39;de bir haftalık, kısa süreler için büyüme ya da -20 ° C&#39;de daha uzun olmayan saklanabilir. Metilselüloz Kullanmadan önce RT ulaşmıştır emin olun. </li><li> Zebra balığı içine floresan boya enjekte gerçekleştirmek için bir standart mikroenjeksiyon set-up (Şekil 1C) kullanın. Bu 1.0, dış çap kapiller ile kullanım için düz bir pipet tutucusunun içine besleyen bir basınç düzenleyici sistemine bağlı bir hava kompresörü oluşur. Pipet tutucu bir manyetik stand ile bir çelik taban plakasına sabitlenmiş bir MM33 kompakt 3-eksenli kontrol mikromanipülatör içinde muhafaza edilmelidir. Embriyolar manipüle, görsel ve bir stereo mikroskop kullanarak enjekte edilebilir. </li></ol> 2. Zebra balığı Yetiştirme ve Ön-enjeksiyon tedavisi <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi 23 zebrafish koruyun. 28.5 ° C sabit sıcaklıkta verilen sirkülasyon suyu sağlayan bir akvaryum set-up kullanınPH 6.8 şartına - 7.2 ve sodyum bikarbonat ve Anında Okyanus Deniz Tuzu ile 450-550 uS iletkenliği sırasıyla. 8 L tank başına 15 kadın 15 erkek bir stoklama yoğunluğu muhafaza, deney uygun olarak yabani-tip veya transgenik zebrabalıkları hatları kullanın. 09:00-23:00 arasında gün ışığı 14 saat balık tesisi photocycle ayarlayın. </li><li> Zebra balığı yumurtlama ışıkları sabah açmak photocycle, başında başlar. Toplamadan önce yabani türde stok tanklarına akşam üreme tankları (zebrabalıkları uzmanları temin içeren örgü ekler,) batığın, maksimum yumurta balık bozmadan toplanabilir sağlamak. </li><li> Sonra bir çay süzgeci ve taze akvaryum su kullanarak yumurta toplamak ve durulayın, balık için 40 dk yumurtlamaya - toplama gününde, 30 izin. Bir 90 mm Petri kabı içeren embriyo ortamda temizlenir yumurta bırakır ve 28.5 ° C sıcaklıkta inkübe edilir. </li><li> Melano inhibe etmek için propiltiyourasil&#39;i embriyo tedavidoğuşu. 8 hpf, 1 içeren taze petri kaplarına minimal sıvı içinde canlı embriyo transferi: embriyo ortamına 100 PTU ve daha 72 hpf kadar 28.5 ° C&#39;de inkübe. NOT: PTU yani 8 hpf aşamalarını göndermek için sınırlı olmalıdır erken aşamalarında kullanıldığında gelişimsel bozukluklara neden olabilir, ama geç 24 hpf olarak tedavi edilebilir. PTU Geç eklenmesi tamamen göz pigmentasyon engellemek ama genelde başarılı ve gövde melanosit oluşumunu inhibe vermezse. </li></ol> 3. Mikroenjeksiyon NOT: perikard kalp encases ama perikard boşluğu içinde sıvı ile koruma ve kardiyak hareket kolaylığı için ayrılır. Bu işlemin amacı, bu damar sistemine boya hızlı alımı için izin veren, perikardiyal boşluğuna RD enjekte edilmesidir. <ol><li> 6 ul yük iğneler - Microloader ipuçlarını kullanarak, RD seyreltilmiş ve mikromanipülatör iğne tutucu içine sabitleyin. İnce tipp kullanarak iğne ucunu kırıned forseps (Şekil 1A). , Dakika ayarına darbe süresi maksimize ederek iğne ucu RD çözüm taşı kez tam msan geri dönmek. </li><li> Çapı 100 um sınırdışı damlacık boyutunu ayarlamak için (forseps kullanarak) iğne ucu uzunluğu bir sahne mikrometre, basınç regülatörü ve inceliklerini kullanarak, bu 0.5 nl hacmi (Şekil 2A) eşittir. NOT: İğneyi kırma yaparken, aksi takdirde zor enjeksiyon hacmi kalibre yapacak kapalı çok kırmak için değil dikkatli olun. Gerekirse ayrıca bununla birlikte açılan boyutunu artırmak dokunun aşırı bükme veya zarar vermeden perikard girişi izin veren bir iğne kalınlığı korumak için iğne ucu bölünürler. </li><li> Enjeksiyon öncesinde, Tricaine içeren embriyolar embriyo ortamda uyutmak. 5 ml embriyo orta, etiket, bir &#39;Tricaine&#39; ve diğer &#39;Kurtarma&#39; içeren 2 x 35 mm Petri kapları ayarlayın. </li><li> 200 ekleuygun şekilde etiketlenmiş çanak stok Tricaine ul. Enjekte etmek kez hazır, 72 hpf bireysel embriyo seçmek ve Tricaine çanak minimal sıvı içinde aktarmak. Embriyonun aktivitesi Monitör, embriyo anestezi uygulandı ve kesilmiş bir Microloader ucu kullanılarak hafif çalkalama ile hareketsiz hale test edin. </li><li> Enjeksiyon kalıp anestezi embriyo transfer ve sol tarafı yukarı bakacak şekilde görüş alanının solunda kalp konumlandırma böylece agaroz çukur içinde embriyo yolunuzu. </li><li> Kalbin içine enjekte RD için, iğne ile perikard delmek ve anestezi embriyo (Şekil 2B, sağ panel) perikard boşluğuna RD 1 nl enjekte. Enjeksiyondan sonra iğneyi çekiniz. &#39;Kurtarma çanak&#39; minimal sıvı enjekte embriyo transfer ve 1 dakika izlemek. 1 ml taze embriyo ortamı (PTU ihtiva eder) ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka bireysel embriyo transferi ve uygun olarak etiketleyin. NOT: Perikard zor, ancak perikard ventro-kaudal farenks kemerler ve dorso-rostral yolk kesesi (Şekil 2B ok ucu) karşılayan kesiştiği bir kayda değer bir zayıf nokta vardır. İğne bu oluk yönelik olmalıdır. İğne yerinde olduğunda, mikromanipülatör üstünde bir parmak sağlam bir musluk perikard boşluğuna girişini kolaylaştırmak olacaktır. </li><li> Ayrı bir kuyu ve benzersiz labelto izin bireysel deneysel takipleri her balık yer, deney grubu başına en az 10 embriyolar için 3.6 - 3.2 tekrarlayın adımları. 3 saat 28.5 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> 4. Görüntüleme Toplama <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi 3 saat sonra, enjeksiyon (HPI) de embriyolar anestezi ve% 3 metilselüloz içeren 35 mm Petri tabağına aktarın. Yavaşça metilselüloz içine embriyolar itmek ve lateral yan görüntülü böylece yolunuzu. </li><li> Görselleştirme o bir filtre kullanılarak, UV altında embriyo bir görüntü eldef 570 nm (Şekil 2C) ışığı yaydığı. Görüntü alındıktan sonra, embriyo iyi belirlenmiş içinde değiştirmeden önce kurtarmak için izin verir. Tüm enjekte embriyolar için görüntü elde ve daha 28.5 ° C&#39;de inkübe. NOT: Biz TXR filtre seti, bir DFC300FX kamera ve ilgili uygulama yazılımı ile bir floresan stereomikroskopta kullanılan bu protokolde. Sonraki görüntü elde etmek için tam satın alma ayarları bir yere not edin. </li><li> Yukarıda açıklandığı gibi 24 HPI anda, görüntülerin bir ikinci tur kazanır. Tüm görüntüleri elde edildikten sonra, 3 HPI ve 24 HPI hem de, insanca embriyoların imha veya diğer deneysel yollarla, örneğin, immunohistokimyasal için kullanın. </li></ol> 5. Görüntü İşleme <ol><li> NIH ImageJ yazılımı kullanarak görüntüleri analiz ederek, 3 HPI ve 24 HPI de, her enjekte embriyo floresan yoğunluğu niceliğini. , Floresan yoğunluğu ölçmek ImageJ bir görüntüyü açmak ve 1 faiz (roi) bir bölgeyi belirtmek için00 px 2 (Düzen → seçimi → belirtin). </li><li> Roi (Şekil 2C) merkezinde kalp yerleştirin, (→ tedbir Analiz) ölçümü gerçekleştirmek, (→ set ölçümleri analiz) ortalama gri skala ve bölgeyi kapsayacak şekilde ölçümler ayarlayın. Embriyo başına, 3 HPI ve 24 HPI de, görüntülerin her set için tamamlayın ve daha fazla işlem için bir elektronik tabloya ortalama gri skala değerleri aktarmak. NOT: Bu embriyolar arasındaki bireysel kalpleri kapsar Biz 100 px 2 sabit roi boyutu seçilir. Kalp nedeniyle önce böbrek girmeden kan floresan içeriğini ölçmek için elverişli bir konuma sağlayan geniş boyutuna ölçümler yapmak için seçildi. </li><li> Uygun istatistiksel yazılım kullanarak istatistiksel analiz gerçekleştirin. Bir öğrencinin t-testi kullanılarak istatistiksel anlamlılık için gruplar karşılaştırın. </li></ol>

<ol>
	<li>Hentschel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).</li><li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+zebrafish+kidney:+a+tale+of+two+tubes.">Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes.</a> Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).</li><li>Ma, M., Jiang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged2a-notch+signaling+mediates+cell+fate+choice+in+the+zebrafish+pronephric+duct.">Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct.</a> PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).</li><li>Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+the+differentiation+of+transporting+epithelia+and+multiciliated+cells+in+the+zebrafish+pronephros.">Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros.</a> Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Cardenas-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+CCDC28B+reveals+its+role+in+ciliogenesis+and+provides+insight+to+understand+its+modifier+effect+on+Bardet-Biedl+syndrome.">Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome.</a> Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).</li><li>Osborn, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+FTO+antagonises+Wnt+signaling+and+leads+to+developmental+defects+associated+with+ciliopathies.">Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies.</a> PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).</li><li>Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+body+stability+and+ciliogenesis+requires+the+conserved+component+Poc1.">Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1.</a> J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).</li><li>Tobin, J. L., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+renal+function+in+zebrafish+models+of+ciliopathies.">Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies.</a> Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).</li><li>Torres, V. E., Harris, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease:+the+last+3+years.">Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years.</a> Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).</li><li>Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease+-+clinical+and+genetic+aspects.">Autosomal dominant polycystic kidney disease - clinical and genetic aspects.</a> Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).</li><li>Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+kidney+disease.+1:+Identification+and+analysis+of+the+primary+defect.">Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect.</a> J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).</li><li>Reynolds, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+splicing+in+the+PKD2+gene+as+a+cause+of+polycystic+kidney+disease.">Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease.</a> J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).</li><li>Pazour, G. J., San Agustin, a. j. t., Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystin-2+localizes+to+kidney+cilia+and+the+ciliary+level+is+elevated+in+orpk+mice+with+polycystic+kidney+disease.">Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease.</a> Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).</li><li>Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polycystic+kidney+disease+proteins,+polycystin-1,+polycystin-2,+polaris,+and+cystin,+are+co-localized+in+renal+cilia.">The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia.</a> J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).</li><li>Baker, K., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+of+cilia+in+disease:+the+human+ciliopathies.">Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies.</a> Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).</li><li>Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+and+signaling+pathways+in+mammalian+development,+health+and+disease.">Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease.</a> Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).</li><li>Hruscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR/Cas9+genome+editing+with+low+off-target+effects+in+zebrafish.">Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish.</a> Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system.">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li><li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+morpholino+experiments:+don't+stop+making+antisense.">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).</li><li>Gerlach, G. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organogenesis+in+the+zebrafish:+insights+into+vertebrate+nephrogenesis+and+regeneration.">Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).</li><li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>Forsythe, E., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bardet-Biedl+syndrome).">Bardet-Biedl syndrome).</a> Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).</li><li>Corbetta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+simple+kidney+cysts+in+patients+with+primary+hyperparathyroidism.">High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism.</a> J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).</li><li>Veleri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+Bardet-Biedl+syndrome+gene+BBS9/PTHB1+leads+to+cilia+defects.">Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects.</a> PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).</li><li>Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , (2003).</li><li>Chang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permselectivity+of+the+glomerular+capillary+wall+to+macromolecules.+II.+Experimental+studies+in+rats+using+neutral+dextran.">Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran.</a> Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Zebra balığı, insan genetik hastalık modellemek için değerli bir araç sunmak, in vivo araştırma için bilimsel bir enstrüman olarak kullanılması böbrek dahil olmak üzere birçok biyolojik sistemlerin, genetik arıza detaylı çalışmalar sağlamıştır. Çok şimdi Zebra balığı böbrek geliştirir ve işlevleri nasıl anlaşılmaktadır. İnsan nefrogenezisi ve hastalığa neden olan genlerin 21 ile homoloji çarpıcı benzerlikler anlamada temel hale nasıl Zebra balığı resimli...

İnsan böbrek kanından metabolik atıkların filtreleme ve hücresel homeostazı sürdürmek için gerekli eriyiklerin kurtarma önemli bir rol oynar. Böbrek fonksiyon bozukluğuna neden olan insan genetik hastalıkların bir dizi vardır. En yaygın kalıtsal böbrek hastalığı böbrek tübülleri içindeki sıvı dolu keseler gelişimi ile karakterize otozomal dominant polikistik böbrek hastalığı (polikistik böbrek) &#39;dir; cystogenesis kaynaklanan hasar böbrek fonksiyonu 10 için zararlıdır. 800-1: polikistik böbrek 1 oluştuğunun vardır 1,000 ve 8 hesapları - son dönem böbrek yetmezliği (SDBY), 11 hastada% 10. Birkaç genler yaklaşık% 85 ve sırasıyla 12,13 vakaların% 15 için muhasebe, polikistin-1 (PKD1) ve -2 (PKD2) dahil ADPKD neden suçlanmıştır. Ayrıca, gen PKD1 ürünleri ve -2 cilium lokalize ve ciliogenesis 14,15 temelidir. Olarak bilinen insan genetik bozukluklar, tanınmış bir aile artık varkirpikler fonksiyonunu etkileyebilir ve CKD 16 neden ciliopathies. siliyer gelişimini ve fonksiyonunu etkileyen insan genetik hastalıkların giderek artan sayıda bu kez kabul körelmiş organel küresel ilgi çekiyor. kirpik, saç benzeri hücresel çıkıntı, reseptörler ve anahtar hücre sinyal olayları transdüksiyonu için gerekli iyon kanalları ile zenginleştirilmiştir. kirpik tipik olarak ya da tekil mikrotübül merkezi bir çift olmaksızın dokuz radyal olarak düzenlenmiş mikrotübül çifti içine yapılandırılmış bir mikrotübül göre aksonem oluşur. axonemal yapısı siliyer eylem türünü ve modunu tanımlar. 9 + 2 mikrotübül düzenlemesi epitel yüzeyleri boyunca sıvıların hareketi kullanılmaktadır kirpiğin hareketliliğini bahşeder. 9 + 0 yapılandırması olmayan hareketlidir ama hücresel sinyal olaylar 17 ağırlıklı olarak işlev inanılmaktadır. Dışında CKD gelen, siliyer disfonksiyon sonuçları karakteristik bir dizi vardır, obezite, retina dejenerasyonu, polidaktili ve kognitif bozukluk 16 dahil ciliopathy özellikleri. Ancak, CKD hastanın yaşam kalitesi en zararlı ve bu nedenle silier ilgili CKD için vivo modellerde uygun gelişiminin arkasındaki önemli bir itici güç arasındadır. Zebra balığı, insan genetik hastalığının etyolojisi anlamak için mükemmel bir model. Bunların pratik geliştirme, yumurta, çok sayıda şeffaf doku ve eski in utero büyüme üretimi zebra balığı gelişim süreçleri görsel ve biyolojik etkinlik önemli kolaylıkla idare edilmesine olanak sağlamaktadır. Genler genetik, genom düzenleme araçları (CRISPR 18 ve TALENS 19) son başarısını kullanılarak değiştirilmiş antisens morfolino teknolojisi kullanılarak 20 nakavt, ya da farmakolojik onların su ortamında bileşiklerin eklenmesi ile kontrol edilebilir. Nitekim, Zebra balığı e üstlenmek için bir platform sunuyoruzDiğer hayvan modellerinde izin veren değil xperiments. Zebra balığı iken insanlarda ile birçok ortak işlevsel korunmuş organları, genleri ve sinyalizasyon işlemleri paylaşan (insanlara kıyasla) nispeten basit omurgalılar vardır. Örneğin, Zebra balığı böbrek insanlara 21,22 oranla yapısında ve fonksiyonunda oldukça benzer. Ancak, fazların bir arkaya yoluyla gelişir memeli böbrek aksine, her bir daha gelişmiş böbrek (pronephros, mezonefros ve metanephros) ile işaretlenmiş, embriyonik zebrafish sadece bir pronephros, bir böbreğin en olgunlaşmamış formu geliştirir. Nefron milyonlarca memeli böbrek yapı taşlarını oluşturan bulunabilir iken, Zebra balığı embriyo sadece iki sahip. İlk kan süzülen kısım için izin glomerüller, aort orta hatta sadece ventral olarak kaynaşmıştır. Cloaca yoluyla çıkmak için önce eritme, eksen boyunca kaudal çalıştırmak Pronephric tübüllerine glomerüllerden kan filtreleri. Pronephric tubules ağır kaudal çıkış 3,4 doğru süzülen maddenin akışına toleranslılar hareketli kirpikler ile kirpikli edilir. Bu basit Pronephric yapı onlar sonunda bir daha karmaşık yapıya mezonefros 21 haline larva büyümenin birkaç hafta boyunca Zebra balığı homeostazı korur. Bununla birlikte, zebra balığı, bir metanephros 21 geliştirir olmadı. Zebra balığı özel duruma rağmen, zebra balığı nefron memelilerde görülen eşit gen sentezleme profilleri ile bölümlere ve böylece nefrogenezisi 3,22 in vivo modelinde rakipsiz sunmaktadır. Rutin hasta, kan ve idrar testleri bir dizi böbrek fonksiyonu için test edilir. Tipik haliyle, kan çözülmüş tuzları, üre, kreatinin için analiz edilir. Üre, kreatinin ve anormal tuz konsantrasyonu yüksek düzeyde böbrek fonksiyonu ile ilgili sorunlar göstergesidir. Bir kolorimetrik çubuğunu kullanarak İdrar tahlili proteini, bloo anormal seviyelerini algılard irin, bakteri ve idrar örneklerinde şeker mevcut. Kanın 10 ml - Bu gibi testler, normal olarak idrar yaklaşık 30 ml ya da 5 gerektirir. Bu esas olarak tahlili gerçekleştirmek için yeterli kan ya da idrar toplama imkansız olması sebebiyle, söz zebrabalıkları gibi in vivo model organizmaların, küçük deneylerde, bu tür çevirmek için zor olmuştur. Burada, biz uygun zebrabalıkları böbrek fonksiyon testleri eksikliğini gidermek ve çalışma için yenilikçi bir teknik tarif. Kan akışı içine bir floresan boya enjekte edilmesi Böbreğin ile kandan süzme ve floresan aktivitesi atılımını izlemek ve ayrı ayrı zaman içinde ölçmek mümkündür. Bu yöntem, bir örnek teşkil hastalığın neden olduğu böbrek hasarı, çalışma için kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="708">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller</td>
			<td style="width:136px;">Intracel</td>
			<td style="width:136px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">borosilicate standard wall capillaries</td>
			<td style="width:136px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:136px;">VWR International</td>
			<td>631-0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Epoxy Resin Glue</td>
			<td style="width:136px;">Evo-Stik</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>D-1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">air compressor&#160;</td>
			<td>Jun-Air</td>
			<td>OF302-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Picospritzer III&#160;</td>
			<td>Parker Instruments&#160;</td>
			<td>051-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">compact 3-axis control micromanipulator&#160;</td>
			<td>Marzhauser</td>
			<td>MM33&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dissecting stereo microscope</td>
			<td style="width:136px;">Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stage micrometer&#160;</td>
			<td>Pyser- SGI</td>
			<td>02A00404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay

Zebra balığı embriyo organogenezi çalışma ve insan genetik hastalık modellemek için bir uysal bir model sunuyor. Göreli basitliğine rağmen, Zebra balığı böbrek geliştirir ve insanlar hemen hemen aynı şekilde çalışır. İnsan böbrek yapımında önemli bir fark sadece iki olan Zebra balığı göre nefron milyonlarca varlığıdır. Ancak, temel fonksiyonel birimler halinde böyle karmaşık bir sistemin basitleştirilmesi böbrek geliştirir ve nasıl çalıştığını anlayışımızı destekli etti. Zebra balığı, glomerulus bulunduğu orta hat cloaca birbirine kaynaştırarak önce embriyonik eksen aşağı ikili çalıştırmak sapmak iki Pronephric tübüllerine ilk kan filtrasyon sorumludur. Pronephric tübüller ağır nihayet cloaca 2-4 vasıtasıyla çıkmadan önce çeşitli çözünenlerin alışverişini sağlayan, parçalı tübül boyunca süzülen maddenin hareketini kolaylaştıran hareketli kirpikler tarafından doldurulur. CKD, inc sorumlu Birçok genlerciliogenesis ile ilgili olanlar luding, zebrabalıkları 5 incelenmiştir. Ancak, büyük bir beraberlik geri genetik manipülasyon sonra Zebra balığı böbrek fonksiyonunu değerlendirmede zorluk olmuştur. İnsanlar çoğunlukla nedeniyle sucul ortamda ve küçük boyutu, Zebra balığı olmayan translasyonel kanıtladık Geleneksel tahliller böbrek disfonksiyonu ölçmek için. Örneğin, embriyonik üre ve kreatinin içeriğinin analizi için balık kademeli gelen bunlar çok küçük oldukları gibi, kan çıkarmak için fiziksel olarak mümkün değildir. Buna ek olarak, Zebra balığı genellikle ilk hasta muayeneleri sırasında yapılan basit bir proteinüri &#39;yağ çubuğu&#39; üzerinde test için yeterli idrar üretemezler. Böbrek fonksiyonu 1,6-9 üzerinden bir okuma vermek için, damar ile ilgili ve dışarı böbrek yoluyla niceliksel olarak, zaman içinde, bir floresan boya açıklık izlemek için zebrabalıkları optik saydamlığı kullanan bir floresan deneyi tarif eder.

Dünya çapında 16 160,000 kişiyi: Bardet-Biedl sendromu (BBS) yaklaşık 1 etkileyen nadir heterojen ciliopathy olduğunu. Polikistik böbrekler olmak üzere ilgili bir takım sorunlar ile başvururlar, daha sonra hastalar sıklıkla böbrek diyaliz veya transplantasyon 24 gerektirir. SDBY CKD 16 gelişmekte olan hastaların yaklaşık% 30 ile, BBS içinde en sık ölüm nedenidir. Şu anda, 20 sigara ile ilgili genler yayınlanmış genotip-fenotip dernek ile BBS suçlanmıştır. BB...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay at JoVE.com

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Zebra balığı, kronik böbrek hastalığı (KBH) modellemek için popüler bir araçtır. Ancak, kendi küçük boyutu imkansız geleneksel yöntemlerle böbrek fonksiyonlarını değerlendirmek için yapar. Biz CKD zebrafish böbrek fonksiyonunun kantitatif analiz sağlayan bir floresan boya böbrek boşluk tahlil 1 açıklar.

Bir Floresan Gümrükleme Testi kullanarak Zebra balığı Böbrek Fonksiyon Değerlendirilmesi

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

evaluation-zebrafish-kidney-function-using-fluorescent-clearance

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K Görüntüleme.  University College London.  Zebra balığı, kronik böbrek hastalığı (KBH) modellemek için popüler bir araçtır. Ancak, kendi küçük boyutu imkansız geleneksel yöntemlerle böbrek fonksiyonlarını değerlendirmek için yapar. Biz CKD zebrafish böbrek fonksiyonunun kantitatif analiz sağlayan bir floresan boya böbrek boşluk tahlil 1 açıklar. 

Video: Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Tüm Böbrek İliği Nakli

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biyoloji

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Zebrafish görme fonksiyonu çalışma optokinetik yanıt

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

GIRK Kanal Modülatörler belirlenmesi için Floresan Tarama Testi

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Zebra balığı Geliştirme Sırasında Photoconvertible Proteinler kullanma Cep Takip

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek Nefron Kompozisyon ve Fonksiyon Analizi

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Bir bakımı<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Nüfus Kafes

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.