This work was supported in part by National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (to M.D.C.), R39 GM-048071 (to I.P.), and R01 NS-074987 (to T.E.L.) and the National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (to C.M.W., T.E.L. and M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (to M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (to J.G.W.), and funding from the George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).

HINWEIS: Ethics Statement: Das Protokoll für die Behandlung der Tiere wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) von der University of California, Irvine, Protokoll # 2010-2943 genehmigt. 1. Entfernen des Rückenmarks <ol><li> Zeigen Papierhandtücher mit ~ 100% Flüssigkeit Isofluran USP benetzt in euthanizing Kammer und legen trockenen Papierhandtücher auf. Zeigen Maus in Kammer auf der Oberseite des trockenen Papiertüchern so Maus die Isofluran nicht berühren, und sicherstellen, dass die Kammer bedeckt. Frühestens nach einer Minute nach dem Atemstillstand zu gewährleisten, dass die Maus euthanasiert. </li><li> Führen Sie einen Rückendurchtrennung des Halses, um sicherzustellen, wird die Maus getötet. Haben einen Genickbruch nicht durchführen, da dies das Rückenmark beschädigt werden. </li><li> Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol, um das nasse Haar. </li><li> Scharfe Feine Schere, um die Haut und Haar von der Rückseite der Maus zu entfernen, um die Wirbelsäule von etwa Gebärmutterhalskrebs Lamina 1 aussetzen (C1) Zu sakralen Lamina 4 (S4). </li><li> Mit einem Skalpell mit einer # 10 Klinge, stellen Schnitte auf der linken und rechten Seite der Wirbelsäule, um es von Muskeln und Fett zu trennen. Dadurch wird die Entfernung von dem Rückenmark erleichtert. </li><li> optional: eine gekrümmte Luer Rongeure kann zur Schaufel entfernt zusätzliche Fleisch werden. </li><li> Halten Sie die Spitze der Wirbelsäule mit Wellen Graefe Pinzette, legen Titan gebogenen Vannas Schere mit der gewölbten Seite nach oben in das freiliegende Wirbelsäule an C1, man aufpassen, das Rückenmark nicht zu berühren. </li><li> Schieben Sie den Titan gebogenen Vannas Schere ganz nach rechts und machen einen kleinen Schnitt. Eine kleine Crunch-Sound zu hören sein und fühlte, wie die Schere die Wirbel. Wiederholen Sie diesen Schnitt auf der äußersten linken Seite des Kabels. Achten Sie darauf, nicht zu schnell zu gehen oder zu groß, von einem Schnitt, da dies das Risiko eine Beschädigung der Schnur mit der Schere. </li><li> Die einzelnen Plättchens sollte mit der Pinzette angehoben, nachdem die Seiten der Wirbelsäule geschnitten zu werden. REPEAT Sie diesen Schritt für jede Schicht bis S4, weiterhin zu halten und ziehen Sie die Rückenmarkswirbel. Hinweis: die Wirbel oberhalb der Transplantatstelle wahrscheinlich ab, wenn man ihn auf die Transplantatstelle geschnitten kommen. Fahren Sie den Vorgang ab knapp unter der Transplantation Website. </li><li> optional: legen Sie den Wirbel nach unten um zu sehen, wo die Transplantation Website hat und zu messen und schneiden ~ 20 mm rostral und kaudal der Transplantation Website. HINWEIS: Bei der Transplantation von NPCs mehr nicht als transplantierten NPC benötigt in der Regel nicht weiter migrieren als 15 mm sein. Die Höhe der Wirbelsäule benötigt wird abhängig vom Experiment und Migrationseigenschaften der Zelltyp verpflanzt. Machen rostralen und kaudalen Schnitte, die zur Transplantation Website gleich weit sind die Transplantation Website, um während der Bildgebung leichter entfernt werden können. </li><li> Mit einem Skalpell mit einer # 11 Klinge sorgfältig geschnitten Ganglien auf der rechten und linken Seite der Bauchseite der Wirbelsäule ausgehend von der rostralen Ende. Dies wkrank ermöglichen das Rückenmark aus dem ventralen Wirbel leichter entfernt werden. HINWEIS: Fertig schnell (Schritte von 1,7 bis 1,11), wird das Rückenmark nicht austrocknen. Allerdings kann 1x PBS auf die Schnur verabreicht werden, um sie feucht zu halten. </li><li> Drehen Sie die Maus und halten Sie die Maus nach oben, damit das Rückenmark nach unten zeigt. Schieben Sie vorsichtig das Rückenmark mit geschlossenen gezackten Graefe Pinzette. Ohne nicking das Rückenmark, sorgfältig geschnitten verbleibende Ganglien, damit das Rückenmark in einem einzigen intakten Stück angehoben werden. </li><li> Stellen Sie sicher, das Rückenmark in RPMI-1640 und auf Eis für den Transport zum 2P Mikroskop. </li></ol> 2. Herstellung von Spinal Cord for Imaging <ol><li> Einbetten des Rückenmarks in Agarose <ol><li> Halten Sie die isolierten Rückenmark in gekühlt RPMI-1640 auf Eis vor der Bildgebung. </li><li> Abwiegen Agarose (niedrige Geliertemperatur) und euch eine 5% ige Lösung in 5 ml 1x PBS. Mikrowelle den 5% igen Lösung für 15 Sekunden, um den ag lösenmachte sich auf und lassen Sie die Lösung abkühlen auf 37 ° C. </li><li> Bereiten Sie das Rückenmark, indem Sie sie auf ein Blatt Parafilm mit der Bauchseite nach oben ein. </li><li> Pipette ca. 5 ml 5% Agarose-Lösung über die Bauchseite der Wirbelsäule. Lassen die Agarose verfestigt durch Abkühlen auf Raumtemperatur. Voll Erstarrung dauert ca. 5 min. </li><li> Eine dünne Schicht von Gewebekleber auf eine 22 mm Quadratdeckglas. </li><li> Kehren Sie die eingebettete Rückenmark, indem die Bauchseite auf Parafilm. Die Rückenseite wird nun nach oben zeigen. Halten Sie das Deckglas auf der Rückenseite, und tauchen Sie die Agarose eingebettet Rückenmark / Deckglas Vorbereitung in RMPI, den Klebstoff zu verfestigen. Entfernen Sie das überschüssige erstarrte Agarose mit einer Rasierklinge. </li></ol></li><li> Montage des Rückenmarks auf dem Mikroskoptisch <ol><li> Vaseline auf die Unterseite des Deckglases. Dies stabilisiert die Vorbereitung während der Perfusion. </li><li> Stellen Sie das Rückenmark Zubereitung in eineAbbilden und auf dem Mikroskoptisch mit der ventralen Seite nach oben in Richtung des 25X Tauchobjektivseite. Die speziell angefertigten Bild auch ca. 20 mm tief, 50 mm lang und 50 mm breit. </li><li> Bild während Superfusion der Vorbereitung mit wärmten (37 ° C), mit Sauerstoff angereichert (95: 5 Sauerstoff: Kohlendioxid-Carbogen) RPMI-1640-Medium ohne Serum. <ol><li> Vorwärmen Medien bis 37 ° C im Wasserbad und an der Schlauchpumpe, indem Sie den Schlauch in die Medienflasche. </li><li> Behalten die Flüssigkeitstemperatur bei 37 ° C eine Heizvorrichtung an der Verbindung der Rohrleitung mit der Kammer. Superfuse Medium durch gut bei 3 ml / min unter Verwendung von Schläuchen auf die Schlauchpumpe (1B) verbunden ist. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 2P Imaging des ventralen Rückenmark <ol><li> Mikroskop-Setup <ol><li> Erwerben Sie Bilder von Thy1-eYFP Rückenmark mit einem Chameleon Ultra-Ti: Saphir-Laser bis 900 nm eingestellt. Dämpfen Laserleistung auf dieProbe auf &lt;5%, um minimale Phototoxizität 16 zu gewährleisten. Haltetemperatur durch Perfusion sauerstoff perfundiert RPMI-1640 mit einer konstanten 37 ° C unter Verwendung einer einzelnen Inline-Lösung Heizvorrichtung stabile Bildgebung zu gewährleisten und um Gewebe Drift und Zellschäden zu verhindern. </li><li> Um eGFP und eYFP Fluoreszenzsignal zu trennen, setzen Sie ein 520 nm Single-Rand dichroitischen und eine 560 nm Single-Rand dichroitischer Strahlteiler in Reihe 2P Emission in drei Kanäle zu trennen, absichtlich Spaltung der grüne Emission, um die Sichtbarkeit zu verbessern. HINWEIS: Diese Kanal werden als blau-grün (Mission &lt;520 nm), grün-gelb (520-560 nm) und rot (Emissions&gt; 560 nm) bezeichnet. Photomultiplierröhren detect emittierte Licht in jedem Kanal. </li></ol></li><li> Lokalisierung Bildgebung Bereiche von Interesse <ol><li> Mit dem Okular und eine Hellfeld-Lichtquelle, konzentrieren sich die Tauchziel am ventralen Rand des Rückenmarks, ein Referenzpunkt gesetzt. </li><li> Stellen Sie sicher, Umgebungslichtquelle ausgeschaltet ist und swJuckreiz an 2P Anregung durch Öffnen der Laserverschluß. </li><li> Falls verfügbar, bei der Suche Gewebe für Bereiche von Interesse, verwenden Sie eine niedrigere Auflösung, höhere Lautstärke ohne Digitalzoom und eine höhere Abtastrate als beim Erwerb von endgültigen Bilder. Typische Einstellungen mit diesem System bei der Suche Gewebe für eine Region von Interesse sind: Auflösung: 256 Pixel; Volumen: x = 600 &amp; mgr; m, y = 600 um, z = 0 bis 300 &amp; mgr; m. </li><li> Beachten Sie die eYFP Axone in der Nähe des ventralen Rand des Rückenmarks. Signal der zweiten Harmonischen aus Kollagen (blau) am hellsten in der Rückenmarksgewebe Rand. Suchen Sie die eYFP Axone nur auf die zweite harmonische Signal dorsal aus dem Kollagen und eYFP Signal wird in der grün-gelb Kanal visualisiert. </li><li> Finde die Transplantatstelle in der Längsmitte des Rückenmarks Präparation 14. Bei Mäusen 1 Tag nach eGFP-NPC-Transplantation, suchen Sie die Transplantation Website durch die Fokussierung des Strahlengangs in der z-Ebene tief in das Gewebe. Die Transplantation Website will unterscheiden sich leicht zwischen den Tieren, sondern ist in der Regel ~ 200 &amp; mgr; m von der ventralen Rand entfernt. Beachten Sie die Cluster von eGFP-NPCs in der weißen Substanz Wege, näher an der ventralen und Seitenränder in Mäusen nach Tag 1 nach der Transplantation. </li></ol></li><li> Der Erwerb endgültigen Bilder <ol><li> Erwerben Bildauflösung von 512 Bildpunkten; Volumen: x = 270 &amp; mgr; m, y = 212 &amp; mgr; m und z = 100 &amp; mgr; m mit 6 Slidebook Software. Kompilieren z-Stacks durch den Erwerb von sequenziellen Fokusebenen in Schritten von 2,5 um. </li><li> Führen Sie eine bidirektionale Abtastung mit der richtigen Zeilensprung-Offset, um eine schnelle Quantifizierung eventueller Migrieren von Objekten im Rückenmark zu gewährleisten. Sicherzustellen, dass die ideale Erfassungsbildrate zellulären Geschwindigkeit zu bestimmen, innerhalb des Rückenmarks ist ungefähr 1 Rahmen / sec. HINWEIS: Imaging-Einstellungen können auf individuelle Benutzereinstellungen, wie beispielsweise Erfassungsbildrate, Bildauflösung und Bildmengen geändert werden. Größere Bildmengen werden in der Regel länger, um in einem giv erwerbenen Auflösung. </li><li> Analysieren, Ernte, glatt und Pseudoslidebook-Bilddateien mit Bildanalyse-Software wie Bitplane Imaris 7.7. Produzieren letzte Zeitraffer-Videos durch Kämmen aufeinanderfolgenden Bildgebungsvolumen mittels eines automatisierten Verfahrens in Slidebook und Imaris. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+model+of+MS:+utility+for+understanding+disease+pathophysiology+and+treatment.">The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment.</a> Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).</li><li>Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+repair+in+multiple+sclerosis:+the+role+of+cell+transplantation.">Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation.</a> Neurosci Lett. 456 (3), 101-106 (2009).</li><li>Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+remyelination+is+induced+by+transplant+rejection+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis.">Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis.</a> J Neuroimmunol. 212 (1-2), 74-81 (2009).</li><li>Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination,+axonal+sparing,+and+locomotor+recovery+following+transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+the+MHV+model+of+multiple+sclerosis.">Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis.</a> Exp Neurol. 187 (2), 254-265 (2004).</li><li>Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+replacement+therapies+to+promote+remyelination+in+a+viral+model+of+demyelination.">Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination.</a> J Neuroimmunol. 224 (1-2), 101-107 (2010).</li><li>Greenberg, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+remyelination+of+spinal+cord+axons+by+engrafted+neural+precursor+cells+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis.">Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (22), E2349-E2355 (2014).</li><li>Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olig1+function+is+required+for+remyelination+potential+of+transplanted+neural+progenitor+cells+in+a+model+of+viral-induced+demyelination.">Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination.</a> Exp Neurol. 235 (1), 380-387 (2012).</li><li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis.">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).</li><li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+mismatch+results+in+neural+progenitor+cell+rejection+following+spinal+cord+transplantation+in+a+model+of+viral-induced+demyelination.">MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination.</a> Stem Cells. 30 (11), 2584-2595 (2012).</li><li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+inflammatory+multiple+sclerosis+lesions+have+an+intermediate+activation+status.">Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status.</a> J Neuroinflammation. 10, 35 (2013).</li><li>Coyle, P. K., Rizvi, S. A., Coyle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+3.">Ch. 3.</a> Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders. 3, 43-70 (2011).</li><li>McManus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCP-1,+MCP-2+and+MCP-3+expression+in+multiple+sclerosis+lesions:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> J Neuroimmunol. 86 (1), 20-29 (1998).</li><li>Calderon, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+CXCL12+(SDF-1alpha)+in+the+pathogenesis+of+multiple+sclerosis:+regulation+of+CXCL12+expression+in+astrocytes+by+soluble+myelin+basic+protein.">A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein.</a> J Neuroimmunol. 177 (1-2), 27-39 (2006).</li><li>Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+transplantation+of+mouse+neural+stem+cells+into+the+spinal+cords+of+mice+infected+with+neurotropic+mouse+hepatitis+virus.">Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus.</a> J Vis Exp. 53, e2834 (2011).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+two-photon+microscope+for+video-rate+Ca(2+)+imaging.">Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging.</a> Cell Calcium. 30 (6), 383-393 (2001).</li><li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Vis Exp. 82, e50826 (2013).</li><li>Farrar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber.">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li><li>Pakan, J. M., McDermott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+investigate+radial+glia+cell+behavior+using+two-photon+time-lapse+microscopy+in+an+ex+vivo+model+of+spinal+cord+development.">A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development.</a> Front Neuroanat. 8, 22 (2014).</li><li>Fenrich, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows.">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> J Physiol. 590 (Pt 16), 3665-3675 (2012).</li><li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system.">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336, 1676-1681 (2012).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296 (6089), 1869-1873 (2002).</li><li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+immune+system.">Two-photon imaging of the immune system.</a> Curr Protoc Cytom. Chapter 12 (Unit12 26), (2012).</li><li>Matheu, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4-activated+B+cells+out-compete+Toll-like+receptor+9-activated+B+cells+to+establish+peripheral+immunological+tolerance.">Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), E1258-E1266 (2012).</li><li>Matheu, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+phases+of+CD8+T+cell+response+in+the+lung+following+H1N1+influenza+infection+and+sphingosine+1+phosphate+agonist+therapy.">Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy.</a> PLoS One. 8 (3), e58033 (2013).</li></ol>

The authors have no competing interests.

Echtzeit-2P Bildgebung von intaktem Gewebe ist erforderlich, um NPC Kinetik und Interaktionen nach der Transplantation in die demyelinisierten Maus Rückenmark zu untersuchen. Intravital Imaging-2P wird häufig verwendet, um zelluläre Dynamik auf der Rückenseite des Rückenmarks in lebenden Mäusen zu bestimmen und wurde genutzt, um Rücken Demyelinisierung in demyelinisierende Erkrankung 17-19 studieren. Da transplantierte NPCs wandern zur ventralen weißen Substanz, die zu tief, um Bild in situ mit 2P-Mik...

Mausmodelle der Demyelinisierung, einschließlich experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) und intrakranielle Infektion mit neuroadapted Maus-Hepatitis-Virus (MHV), sind ausgezeichnete Werkzeuge zur molekularen Signalwege und zellulären Interaktionen mit der Krankheit zu studieren. Sie haben dazu geführt, und unterstützt die Wirksamkeit der FDA zugelassenen pharmazeutischen Therapien, die sich vornehmlich an Einstellung der Autoimmun- und Entzündungs ​​1. Sobald jedoch endogenen Remyelinisierung ausgefallen ist, die gegenwärtig zugelassenen Therapien nicht wirksam beheben demyelinisierten Läsionen im zentralen Nervensystem. Daher sind die Reparaturorientierten Therapien in diesem Stadium der Erkrankung kritisch für die Linderung von chronischen Symptomen und Verbesserung der Lebensqualität. In letzter Zeit wurden neurale Vorläuferzellen (NPCs) in den Vordergrund als eine mögliche regenerative Therapieform gekommen, um Bereiche der Entzündung und Demyelinisierung Ziel. Mehrere Studien haben die Fähigkeit der NPCs zu endogeno induzieren hervorgehobenRemyelinisierung uns und machen Sie direkt in die Remyelinisierung 2-8. Da NPCs in direktem Remyelinisierung beteiligt sind, ist es unerlässlich, die Kinetik und Wechselwirkungen mit körpereigenen Zellen nach der Transplantation zu verstehen. Nach der Transplantation, wandern NPCs ventral Bereichen der weißen Substanz Schaden, dann rostral und kaudal in Bezug auf die Transplantatstelle 5,9. Die Kinetik der Migration unterschiedlich in Reaktion auf Umweltreize; NSC in einen nicht beschädigten Rückenmark transplantiert größere Geschwindigkeiten als NSC in einen beschädigten Bandkabel 6 transplantiert. Nach einer Wanderungsperiode übertragen NSC proliferieren umfassend, mit einer höheren Geschwindigkeit in einer beschädigten Wirbelsäule relativ zu intaktem Rückenmark 6. Schließlich sind die meisten NPCs differenzieren sich in Oligodendrozyten und initiieren direkten Remyelinisierung 4,6,9. Die demyelinisierten Läsion ist komplex und kann eine vielfältige Population von Zellen in verschiedenen Stadien einer umfassenctivation. Zum Beispiel kann ein aktiver Multipler Sklerose (MS) Läsion eine signifikante Population von aktivierten T-Zellen, M1 Mikroglia und M1 Makrophagen, aber eine chronische Stumm MS Läsion kann hauptsächlich aus reaktiven Astrozyten mit wenig Entzündungszellen 10-13 umfaßt, umfassen. Aufgrund der Vielfalt von Effektorzellen, Zwei-Photonen (2P) Bildgebung in Mausmodellen der Demyelinisierung ist ein äußerst nützliches Werkzeug zur besseren Verständlichkeit lokalen zellulären Interaktionen innerhalb der Läsion. MS und vielen intensiv genutzt MS Forschungsmodellen wird die Mehrzahl von Läsionen an der Bauchseite des Rückenmarks, einer Region unzugänglich intravitalen 2P Abbildungs ​​aufgrund Läsionstiefe und dem hohen Lipidgehalt des Rückenmarks. Um diese Probleme und Untersuchung der Zell-Zell-Wechselwirkungen innerhalb Läsionen entlang der ventralen Rückenmark umgehen haben wir ein einfaches ex vivo 2P Abbildungs ​​Zubereitung 6 entwickelt. Diese Studie folgt auf eine frühere Veröffentlichung Methoden, die zeigten,die Prozedur zur Verpflanzung enhanced green fluorescent protein (eGFP) exprimierenden NSC in das Rückenmark von Mäusen nach JHMV Stamm von MHV-induzierten Demyelinisierung 14. Fünf Wochen alten Mäusen mit JHMV infiziert und mit eGFP-NPCs transplantiert bei thorakalen Ebene 9 am Tag 14 nach der Infektion. Die hier vorgestellte Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zum Extrahieren des Rückenmarks, geben Sie ein Ex-vivo-Agarose Vorbereitung und Bild transplantiert eGFP-NPC-Interaktionen mit verbesserten gelb fluoreszierendes Protein (eYFP) exprimierenden Axone. Mäuse, eYFP unter der neuronalen spezifischen Thy1 Promotor In diesem Verfahren wurden 15 verwendet. Nur ein Teil der Axone zum Ausdruck eYFP, so dass es nützlich für die Abbildung einzelner Axone. Hier zeigen wir, Rückenmark nach 7 Tagen nach der Transplantation entfernt; jedoch kann das Rückenmark zu jedem Zeitpunkt nach der Transplantation gewonnen werden. Während wir zeigen, Wechselwirkungen von NPCs mit beschädigten Axone können unsere Protokoll in Kombination mit genetischen Fluoreszenzmarker eingesetzt werdenvon anderen Zelltypen in einer Vielzahl von zellulären Interaktionen ganzen Rückenmark der Maus vorkommen untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="858">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:381px;">Isoflurane, USP</td>
			<td style="width:175px;">Piramal Critical Care, Inc</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">14060-09</td>
			<td>sharp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">scalpel blade #10</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">scalpel handle</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Luer rongeurs</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">16001-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Graefe forceps</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Vannas scissors</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">15615-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">scalpel blade #11</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:175px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">12-115F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">A9414-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Parafilm</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Vetbond (tissue adhesive)</td>
			<td style="width:175px;">3M</td>
			<td style="width:136px;">1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">22 mm square cover slip</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">12-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">25x dipping objective, 1.1 NA</td>
			<td style="width:175px;">Nikon</td>
			<td style="width:136px;">CFI Apo LWD 25XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Single inline solution heater</td>
			<td style="width:175px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:136px;">64-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">520 nm single-edge dichroic beam splitter</td>
			<td style="width:175px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF520-Di02-25x36</td>
			<td>Brightline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">560 nm single-edge dichroic beam splitter</td>
			<td style="width:175px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF560-FDi01-25x36</td>
			<td>Brightline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">photomultiplier tubes</td>
			<td style="width:175px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:136px;">R928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">C/L variable-speed tubing pump</td>
			<td style="width:175px;">Masterflex</td>
			<td style="width:136px;">77122-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">digital thermometer</td>
			<td style="width:175px;">Comar Instruments</td>
			<td style="width:136px;">3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Coherent</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Slidebook 6 software</td>
			<td style="width:175px;">3i</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Imaris 7.7 software</td>
			<td style="width:175px;">Bitplane</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

<html> Während die explantiert Rückenmark Bildgebungsprotokoll kann verwendet werden, um jede Fluoreszenz innerhalb des Rückenmarks zu visualisieren, unser Vertreter Ergebnisse zeigen eGFP-NPC-Interaktionen mit eYFP-Axone. Zunächst zeigen wir die eingebetteten ventralen Rückenmark Zubereitung in 1A. Als nächstes zeigen wir die 2P Mikroskopaufbau und Schlüsselkomponenten in der 1B, Fig. 2 zeigt eGFP und eYFP Fluoreszenz in einem Z-Stapel innerhalb des ventralen Rückenmark. Erwerb ...

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Eine neue ex vivo Herstellung zum Abbilden der Rückenmark der Maus. Dieses Protokoll ermöglicht die Zwei-Photonen-Bildgebung von lebenden zellulären Interaktionen ganzen Rückenmark.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

two-photon-imaging-of-cellular-dynamics-in-the-mouse-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.1K Aufrufe.  University of California, Irvine.  Eine neue ex vivo Herstellung zum Abbilden der Rückenmark der Maus. Dieses Protokoll ermöglicht die Zwei-Photonen-Bildgebung von lebenden zellulären Interaktionen ganzen Rückenmark. 

Serie: Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging der Maus Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

Diffusionsbildgebung in der Ratte Halsmark

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Eine In Vivo Duo-Farbe-Methode für Imaging-vaskuläre Dynamik nach Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminektomie und Rückenmarksfenster-Implantation in der Maus

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...