Esta investigación fue apoyada por una subvención del NIH: R21AG042066. Nos gustaría dar las gracias a Philip Schulz por sus contribuciones en la creación de los videos de captura de pantalla.

1. Los fagos Producción <ol><li> Realizar todos los procesos de producción de fagos y biopanning en un gabinete de bioseguridad. Producir fagos partículas de las diferentes bibliotecas (Tomlinson I y J bibliotecas y Hojas de biblioteca 21) para el proceso de biopanning utilizando las instrucciones del fabricante (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf). NOTA: Nosotros usamos varias bibliotecas en nuestro proceso de exploración para aumentar la diversidad de los anticuerpos disponibles. </li><li> Brevemente, las bacterias de cultivo de las existencias de las tres bibliotecas en 200 ml de 2xYT que contiene 1% de glucosa y 100 g / ml de ampicilina en un agitador a 37 ° C hasta que OD 600 es 0,4. </li><li> Añadir 8 x 10 11 de fago auxiliar KM13 a 200 ml de las bibliotecas Tomlinson I y J y 8 x 10 11 de fago auxiliar VCSM13 a 200 ml de la biblioteca Sheets. Incubar las muestras de la biblioteca con el fago auxiliar durante 30 min a 37 ° C sin agitación. </li><li> Centrifugar lacultivos a 3.000 xg durante 10 min y resuspender el sedimento celular en 200 ml de 2xYT con 0,1% de glucosa, 100 g / ml de ampicilina y 50 g / ml de kanamicina. </li><li> Incubar las culturas O / N a 30 ° C con agitación y luego girar durante 30 minutos a 3300 xg al día siguiente. </li><li> Añadir 50 ml de polietilenglicol (PEG) 8000 en NaCl 2,5 M a los 200 ml de sobrenadante de cada una de las bibliotecas e incubar en hielo durante 1 hr. Después de precipitación con PEG, girar las soluciones de nuevo durante 30 min a 3300 x g. </li><li> Añadir 1-2 ml de tampón fosfato salino (PBS) al sedimento celular (dependiendo del tamaño de la pastilla) y la transferencia a tubos de microcentrífuga. </li><li> Incubar las partículas de fago en hielo durante 1 hora a 37 ° C con mezcla ocasional antes de centrifugar durante 10 min a 11.600 x g. Recoger el sobrenadante y se almacena a -80 ° C. </li><li> Antes de congelar, transferir un pequeño volumen de las partículas de fago a partir de las tres bibliotecas a otro tubo de microcentrífuga, y titule cada bibliotecaindividualmente utilizando células TG1 para determinar la concentración. A continuación se muestra una descripción del proceso de título para una biblioteca. <ol><li> Se cultivan las células TG1 a OD 600 de 0,4. Añadir 990 l de PBS a 6 tubos de microcentrífuga. </li><li> Para el primer tubo de añadir 10 l de las partículas de fago. Después de mezclar, eliminar 10 l de tubo uno y añadir al tubo 2. Repita este paso para los 4 tubos restantes. </li><li> Añadir 200 l de células TG1 con 6 tubos y añadir 10 l de cada uno de los seis diluciones de fago a estos tubos. Permita que las partículas de fago para infectar durante 30 minutos sin agitación a 37 ° C. </li><li> Plate 100 l de las células á Luria-Bertani placas de agar con 100 g / ml de ampicilina (LBA). Incubar O / N a 37 ° C y luego determinar la pfu / ml utilizando el número de colonias visibles. </li></ol></li></ol> 2. Negativo Proceso biopanning NOTA: Evite demasiados congelación y descongelación de los fagos en todo el proceso biopanning. Identificacióneally, lo mejor es llevar a cabo ya que muchos de los pasos de panorama negativos como sea posible en un día. Después de la finalización de las rondas de cribado negativo o positivo contra cada objetivo es importante para salvar algunos de los fagos en caso de contaminación en cualquier paso. <ol><li> 12 rondas de cribado negativo contra la albúmina de suero bovino (BSA) <ol><li> Añadir 4 ml de 1 mg ml solución / BSA en PBS a 12 inmunotubos e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Combine 1 x 10 12 partículas de fago de cada una de las tres bibliotecas (dejar de lado una pequeña cantidad de esta mezcla de fagos para la futura verificación del proceso de encuadramiento negativo). </li><li> Descartar la solución de BSA desde el primer tubo y se lava el tubo de 2-3 veces con PBS para eliminar cualquier BSA no unido. </li><li> Añadir las bibliotecas de fagos combinados a este primer tubo, incubar durante 30 min a RT en el rotador y recoger los fagos no unidos. </li><li> Repita el paso 2.1.3 con la segunda inmunotubo y añadir los fagos recogidos desde el paso 2.1.4 a esta immunotube. Repita el paso 2.1.4. </li><li> Repita los pasos 2.1.3-2.1.4 con los 10 tubos restantes de la solución de BSA y el fago no unido recogido después de cada incubación. </li><li> Para verificar la eliminación de todas las carpetas de BSA fagos utilizar AFM. Añadir 10 l de fago de la etapa 2.1.2 y 10 l de fago restante después de la etapa 2.1.7 separado a 10 g / ml de BSA unidas a mica escindido. Una versión breve del proceso de AFM se describe en la sección 8. </li><li> Es importante guardar una pequeña cantidad de fagos después de terminar las numerosas rondas de cribado negativo contra cada objetivo para verificar el éxito del proceso de la panorámica. </li></ol></li><li> 10 rondas de cribado negativo contra diversas formas de alfa-sinucleína NOTA: En este proyecto, queremos eliminar los fagos que podrían unirse otras formas agregadas de proteínas como la alfa-sinucleína (monómero, dímero, trímero, etc.) y lo vamos a eliminar alguno de estos fagos (el objetivo es eliminar el mayor muchos fagos de reacción cruzada como sea posible). Permita purificada alfa-sinucleína a agregarse durante al menos 7 días, así que ambas formas monómeros y oligómeros están presentes para paneo negativo. <ol><li> Preparar 4 inmunotubos con 500 g / ml de agregados de alfa-sinucleína en PBS y 4 inmunotubos con 100 mg / ml de agregados de alfa-sinucleína e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Descartar la solución de uno de los tubos con 500 g / ml de agregado alfa-sinucleína, lavar con PBS y añadir la biblioteca de fagos recogidos después de las 12 rondas de paneo negativo con BSA. </li><li> Incubar el tubo durante 30 min a RT en el rotador y recoger los fagos no unidos. </li><li> Repetir los pasos 2.2.3 y 2.2.4 para los tubos restantes con 500 g / ml de agregado alfa-sinucleína y después los tubos con 100 g / ml de agregado alfa-sinucleína utilizando el fago no unido recogido cada vez después de la etapa 2.2.4. </li><li> Repita el paso 2.1.8 usando el fago después de la primera de paneo negativa en contra de 500 g / ml de alfa agregadasinucleína y el fago después de la octava ronda de selección negativa en contra de 100 g / ml de alfa-sinucleína. </li><li> Para eliminar todas las carpetas negativos contra la alfa-sinucleína preparar dos inmunotubos extra con 500 g / ml de agregados de alfa-sinucleína y repita los pasos 2.2.2-2.2.4. </li></ol></li><li> 10 rondas de cribado negativo contra Saludable Human Brain Tissue Homogenado <ol><li> Añadir tampón 1x STEN (50 mM Tris (pH 7,6), NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 0,2% NP-40, 0,2% de BSA, 20 mM PMSF y cóctel inhibidor de proteasa) para el tejido cerebral humano 28. Homogeneizar a 24.000 rpm durante 1 min, las muestras de centrifugación a 3000 rpm y se recoge el sobrenadante. </li><li> Prepare 2 inmunotubos con 2 ml de 50 mg / ml de tejido cerebral humano en PBS y 8 inmunotubos con 10 mg / ml de tejido cerebral humano e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Repita los pasos 2.2.3-2.2.5 primero con los tubos que contienen 50 mg / ml de tejido cerebral humano y luego con aquellos que contienen 10 mg / ml de b humanatejido lluvia usando el fago no unido recogido después el panorama negativo contra la alfa-sinucleína. </li><li> Repita el paso 2.1.8 usando el fago después de la primera de paneo negativa en contra de 50 g / ml de tejido cerebral humano y el fago después de la décima ronda de selección negativa en contra de tejido cerebral humano. </li></ol></li><li> 8 rondas de cribado negativo contra Saludable Immunoprecipitated TDP-43 <ol><li> Immunoprecipitate saludable proteína TDP-43 desde sano tejido cerebral humano utilizando el protocolo descrito en la sección 9. Debido a la menor cantidad de proteína inmunoprecipitada, llevar a cabo estas rondas de cribado negativo utilizando mica. </li><li> Cleave ocho superficies de mica. </li><li> Para la primera mica añadir ~ 100 l de 5 mg / ml de la proteína inmunoprecipitada y se incuba durante 5-10 min a TA. </li><li> Lavar la mica 5 veces con 0,1% PBS con Tween 20 (PBST). </li><li> Añadir ~ 100 l de fago después el panorama negativo contra el tejido sano del cerebro y se incuba durante 5-10 min aRT. </li><li> A medio camino de la incubación del paso 2.4.5, realizar la etapa 2.4.3 usando el segundo mica. </li><li> Recoger el fago del paso 2.4.5 y lavar la mica 5 veces con 0,1% PBST. </li><li> Lave mica desde el paso 2.4.6 y añadir el fago de 2.4.7. </li><li> Repita los pasos 2.4.4 al 2.4.9 hasta que el fago se desplaza negativamente contra los ocho mica con la proteína inmunoprecipitada. Repita el paso 2.1.7 usando el fago después de una y ocho ronda de cribado negativo. </li></ol></li><li> 2 rondas de cribado negativa contra FTD Immunoprecipitated TDP-43 <ol><li> Immunoprecipitate proteína TDP-43 de los cerebros de las personas con FTD. </li><li> Cleave 2 superficies de mica. </li><li> Añadir 50 l de 10 g / ml de FTD TDP-43 a uno mica. Incubar durante 5 min a TA. </li><li> Lave la mica 5 veces con 0,1% PBST. </li><li> Añadir 50 l de fago recogido después de paneo negativa en contra de TDP-43 saludable. Incubar durante 5 min. </li><li> Recoge los fagos no unidos. </li><li> Repeats pasos 2.5.3 a 2.5.6 con el segundo mica y el fago no unido recogida en 2.5.6. </li></ol></li></ol> 3. Desplazamiento Positivo contra Immunoprecipitated TDP-43 de las personas con ELA <ol><li> Immunoprecipitate proteína TDP-43 de los cerebros de las personas con ELA. Cleave 3 superficies de mica. Añadir 50 l de 10 g / ml de ALS TDP-43 a uno mica. Incubar durante 5 min a TA. Lave la mica 5 veces con 0,1% PBST. </li><li> Añadir 50 l de fago recogido después de paneo negativa en contra de TDP-43 saludable a la mica. Incubar durante 5 min. </li><li> Recoge los fagos no unidos. También recoge los fagos unidos usando tres métodos de elución. Es importante mantener todos los fagos recogidos en estos pasos paneo independientes. <ol><li> En primer lugar, añadir 50 l de tripsina (1 mg / ml en PBS) a cada mica e incubar durante no más de 10 min. Recoger la solución y guardar. A continuación, añadir 50 l de trietilamina 100 mM (TEA) a cada mica e incubar durante no más de 10 min. Collect la solución, añadir un volumen igual de tampón 1 M Tris-HCl pH 7,4 y guardar. </li><li> En tercer lugar, añadir 50 l de TG1 a una DO 600 de 0,4 directamente a la mica y se incuba durante 30 min a 37 ° C. También añadir los fagos recogidos de los dos métodos de elución en 3.3.1 a 100 l de TG1 en OD 600 de 0,4 y se incuba durante 30 minutos a 37 ° C. </li></ol></li><li> Repita los pasos 3,1 con una segunda mica. </li><li> Tome el fago no unido recogido en el apartado 3.3.2. utilizando la primera mica con ELA TDP-43 y agregarlo a la segunda mica con ELA TDP-43. Incubar durante 5 min. </li><li> Repite todos los pasos de 3,3 segundos para estos conjuntos de mica. </li><li> Combinar las células TG1 infectadas con los fagos eluidos con tripsina de las dos ALS TDP-43 y la placa de mica en placas de LBA. Repetir el mismo proceso para el té y TG1 eluyó fagos de los dos ALS TDP-43 mica para un total de tres placas. NOTA: Debido a la participación de la TDP-43, tanto en la ELA y FTD, algunos de los clones aislados en eldos rondas de cribado positivo contra la ELA TDP-43 pueden ser específicas para este objetivo, pero algunos también pueden unirse FTD. Para aislar mejor ALS clones específicos, tomar el fago no unido recogido después de 2 rondas de cribado negativo contra FTD TDP-43 (ya que estas dos rondas de cribado negativo deberían haber eliminado cualquier objetivo que es reactivo a FTD TDP-43) y el uso de estos fagos en una ronda más de panning positiva contra la ALS TDP-43 antígeno sobre mica (ALS preparar el TDP-43 mica como se describe anteriormente en 3.3 y 3.4). </li><li> Repite todos los pasos de 3,3 con esta tercera mica ALS y la placa de las células TG1 infectadas en tres placas LBA O / N a 37 ° C. Al día siguiente, contar el número de colonias en las placas de 6 LBA con el potencial clones ALS. Debe haber un menor número de colonias en las tres placas LBA con los posibles clones ALS después de la tercera ronda de cribado positivo en comparación con las tres placas LBA después de las dos rondas de cribado positivo. </li></ol> 4. El cultivo y el fago Productoion de potenciales clones positivos contra la ELA específico TDP-43 <ol><li> Crecer cada colonia a partir de los 6 placas en placas de 96 pocillos que contienen 100 l de 2xYT con 1% de glucosa y 100 g / ml de ampicilina en un agitador a 37 ° CO / N. </li><li> La siguiente transferencia día 10 l de los pocillos que contienen los clones de las 3 placas de LBA después de la tercera ronda de selección positiva con la proteína ALS TDP-43 a tubos de microcentrífuga que contienen 1 ml de 2xYT con 1% de glucosa y 100 g / ml de ampicilina . </li><li> Añadir glicerol a todas las culturas en las placas de 96 pocillos a una concentración final de 15% y congelar las placas a -80 ° C. Permita que las culturas 1 ml crezcan durante 2-3 horas con agitación a 37 ° C. </li><li> Añadir 10 9 de fago auxiliar KM13 y permitir que el fago auxiliar para infectar durante 1 hora a 37 ° C con agitación. Centrifugar las células durante 10 minutos a 3000 xg, descartar el sobrenadante y añadir 1 ml de 2xYT con 0,1% de glucosa, 100 g / ml de ampicilina y 50 mg / ml de Kanamycin. </li><li> Cultura de las células O / N a 30 ° C con agitación. Centrifugar los tubos a 3.300 xg durante 30 min, Transferir el sobrenadante a nuevos tubos de microcentrífuga y se añaden 250 l de PEG / NaCl a cada tubo. </li><li> Incubar los tubos en hielo durante 1 hr. Centrifugar los tubos de nuevo en 3300 xg durante 30 min, descartar el sobrenadante y añadir 100 l de PBS a cada tubo. </li><li> Incubar los tubos en hielo durante 1 hr. Girar los tubos durante 10 min a 11.600 xg y transferir el sobrenadante a nuevos tubos. Guarde los fagos a -80 ° C. </li></ol> 5. La secuenciación de potenciales Clones ALS <ol><li> Repita el paso 4.2 y permite a las culturas creciendo O / N a 37 ° C con agitación. El día siguiente realizar preparaciones de plásmidos de ADN de los clones de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Secuenciar los clones usando la apropiada adelante y atrás primers. </li></ol> 6. Detección potenciales clones positivos contra la ELA específico TDP-43 Uso de ELISA indirecto <ol><li> Añadir 100 l de 2,5 mg / ml de ALS, FTD y el tejido cerebral humano sano a los pocillos de una placa de ELISA de alta unión para cada clon potencial ALS. Incubar las placas a 37 ° C durante 1 hora con agitación lenta. </li><li> Lavar las placas 3 veces con PBST 0,1%. Añadir 200 l de 2% de leche en polvo en PBS al pocillo e incubar las placas a 37 ° C durante 1 hora con agitación lenta. </li><li> Repetir la etapa de lavado y luego añadir 100 l de cada fago diluida al menos 1/100 en PBS a los pocillos. Después de la incubación y etapas de lavado, añadir 100 l de 1 / 1.000 anti-M13 HRP a cada pocillo. Lavar las placas y visualizar utilizando el kit de sustrato de quimioluminiscencia femto ELISA. </li></ol> 7. Producción scFv y de detección sistemática mediante ELISA indirecto <ol><li> Crecer HB 2151 células a OD 600 de 0,4. Añadir 5 l de las diferentes fagos para 20 l de las células HB 2151. Permita que los fagos 30 min para infectar a 37 ° C sin agitación. Divida placas LBA en las redes de maneraque aproximadamente 20 clones se pueden sembrar en cada uno. </li><li> Añadir 5-10 l de cada uno de fagos infectados bacterias en la placa e incubar O / N a 37 ° C. Al día siguiente añadir colonias individuales a 1 ml de 2xYT con 0,1% de glucosa y 100 g / ml de ampicilina y agitar a 37 ° C durante 3-4 horas hasta que OD 600 es de 0,6. </li><li> Añadir 1 l de 1 M isopropiltiogalactósido (IPTG) a cada tubo y se incuba O / N a 30 ° C con agitación. Girar los tubos a 11.600 xg durante 10 min y cosechar el sobrenadante para la prueba de ELISA. </li><li> Para la prueba ELISA seguir los mismos procedimientos en la sección 6, excepto que en lugar de fagos en 6,5 añadir el scFv sin diluir y el 6,6 añadir 100 l de 1/1000 9E10 HRP. </li></ol> 8. Proceso AFM <ol><li> Añadir 10-20 l de antígeno diana a mica escindido y se incuba durante 5-10 min. Lavar la mica 5 veces con agua. Añadir 10 a 20 l de los fagos a la mica e incubar durante 5 a 10 min. </li><li> Lave la mica 5 veces wi nuevoª agua y deje que la mica se seque al aire. Visualizar fago de unión utilizando AFM 1. Ejecutar el proceso de formación de imágenes AFM utilizando el modo tapping AFM con un controlador Nanoscope IIIa en el aire a temperatura ambiente 29. Las sondas de AFM de silicio tienen una frecuencia de resonancia de 300 kHz y una constante de resorte de 40 N / m. Utilice una velocidad de barrido de 3,05 Hz y una resolución de escaneo de 512 muestras / línea. </li><li> Procesar las imágenes por aplanamiento básica del fondo para asegurar que todos los tamaños de partícula son comparables dentro de cada imagen. Ancho de Fago (no la longitud) puede variar de una imagen a otra debido a otros tamaños de partículas y el área de exploración, pero nunca va a comprometer la precisión de si o no fago se une al antígeno. </li><li> Si durante la verificación de AFM para cada conjunto de fagos de panning negativos son visibles en la mica, realizar rondas de adición hasta que no se detectan los fagos antes de proceder a la siguiente serie de panning negativo. </li></ol> 9. La inmunoprecipitación de Target Antígeno <ol><li> Para Isolate el antígeno diana (TDP-43), añadir 250 g de tejido homogeneizar cerebro (de corteza motora), 100 l de dilución 1/100 de la anti-TDP 43 anticuerpo policlonal y 1x STEN búfer a 700 l volumen total a un Eppendorf tubo 28. </li><li> Incubar O / N a 4 ° C en un rotador. Lavar A / G cuentas de agarosa con el 1x STEN amortiguan 2-3 veces y añadir 25 ml de la mezcla de tejidos. Se incuba a 4 ° C durante 1,5 horas en un rotor y centrifugar a 2.000-4.000 rpm durante 1 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento una vez con tampón 1x STEN y 5 veces con PBS. Añadir 40-60 l de tampón 1x STEN al sedimento y hervir durante 5 min. Después de que las muestras son frescas, centrifuga y se recoge el sobrenadante. Utilice SDS-PAGE y transferencia Western para verificar el éxito del proceso de inmunoprecipitación 30. </li></ol> 10. Dot Blot Analysis <ol><li> Cortar papel de nitrocelulosa en pequeños rectángulos para cada clon que se pondrá a prueba. Dot 2 l de ALS, FTD y muestras de tejido cerebral humanos sanos hasta el papel de nitrocelulosa y deje que se seque por completo. </li><li> Añadir 1-2 ml de 5% de leche en polvo en PBS y se deja agitar durante 1 hora a RT. Añadir 1 ml de dilución 1/100 de cada fago y se deja agitar O / N a 4 ° C. Lavar la membrana 3 veces durante 10 min cada uno con 0,5% PBST. </li><li> Añadir 1 ml de 1 / 1.000 dilución de anti-M13 HRP y se deja agitar durante 1 hora a RT. Repita el procedimiento de lavado y se visualizaron utilizando la solución de quimioluminiscencia occidental. </li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43:+the+relationship+between+protein+aggregation+and+neurodegeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+lobar+degeneration.">TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration.</a> FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).</li><li>Ling, S. -. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology:+clinical+applications+and+recent+innovations.">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+single-chain+antibodies+from+a+human+synthetic+phage+display+library+for+detection+of+Bacillus+thuringiensis+(Bt).">Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt).</a> Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+characterization+of+single-chain+recombinant+antibodies+against+spring+viraemia+of+carp+virus+from+mouse+phage+display+library.">Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library.</a> Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).</li><li>Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+Ubiquitinates+Tar-DNA+Binding+Protein-43+(TDP-43)+and+Promotes+Its+Cytosolic+Accumulation+via+Interaction+with+Histone+Deacetylase+6+(HDAC6).">Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6).</a> Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).</li><li>Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Antibody+Specificity+to+Different+Protein+Morphologies+by+AFM.">Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM.</a> Langmuir. 25, 912-918 (2008).</li><li>Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+brain-reactive+autoantibodies+and+behavioral+deficits+in+the+MRL+model+of+CNS+lupus.">Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus.</a> Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).</li><li>Jo&#324;czyk, E., K&#322;ak, M., Mi&#281;dzybrodzki, R., G&#243;rski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+external+factors+on+bacteriophages&#8212;review.">The influence of external factors on bacteriophages&#8212;review.</a> Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).</li><li>Hammers, C. M., Stanley, J. 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The authors have nothing to disclose.

Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, Parkinson&#8217;s, ALS and FTD1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress ...

La presencia de variantes de la proteína ha sido implicado como un factor en la progresión de muchas enfermedades, incluyendo enfermedades neurodegenerativas tales como Alzheimer, Parkinson, ALS y la demencia frontotemporal (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11. Formas oligoméricas de las proteínas beta-amiloide y la alfa-sinucleína se cree que son las especies tóxicas responsables de la enfermedad de Alzheimer y el Parkinson, respectivamente 2,3,4,5. Agregados de la TAR DNA-proteína de unión 43 (TDP-43) se han relacionado con ALS y FTD 12,13,14. Por lo tanto los reactivos como los anticuerpos que se dirigen selectivamente las diferentes variantes de la proteína pueden ser herramientas poderosas para servir como marcadores de diagnóstico y terapéuticos potenciales. En este estudio, se centró en el desarrollo de reactivos que se unen selectivamente variantes de la proteína TDP-43 implicados en la ELA, sin embargo, la técnica descrita en este documento debe ser aplicable al aislamiento de los reactivos frente a una amplia gama de protein variantes. La agregación citoplásmica de TDP-43 ha sido identificada como una característica patológica en la ELA 15,16,17,18,19. Típicamente TDP-43 se encuentra en el núcleo de todas las células de un individuo normal, aunque tiende a desplazarse entre el citosol y el núcleo 15,17. Formas Sin embargo, en ALS agregados de TDP-43 se detectan en el citoplasma de neuronas y glia seleccione con concentraciones más bajas se encuentran en el núcleo lo que sugiere el movimiento de TDP-43 desde el núcleo hasta el citoplasma durante la progresión de la enfermedad 16,20. Mientras la agregación de TDP-43 se encuentra en la mayoría de los casos de ELA, que no tiene en cuenta todos los casos desde el 1% -2% de los casos de ELA total (o 15% -20% de los casos de ELA familiar) están vinculados a mutaciones en el superóxido dismutasa 1 (SOD1) 15,17 gen. Debido a la importancia del papel de TDP-43 en la gran mayoría de los casos de ELA, aquí nos centramos en el desarrollo de reactivos de anticuerpos basados ​​que pueden unirse selectivamente a TDP-43 variantes que sonpresente en el tejido cerebral ALS humana utilizando nuestras técnicas biopanning basado novela AFM. Inicialmente tenemos un repertorio diverso de los dominios de unión a anticuerpos. Se combinaron los tres (scFv) bibliotecas de fragmentos diferentes de presentación de fagos de cadena único dominio variable de anticuerpo, (Tomlinson I y J y Hojas de bibliotecas 21). El proceso de toma panorámica se divide en fases de panorama negativo y positivo. Los fagos de las bibliotecas son primero sometidos al proceso de panning negativo durante el cual los fagos reactivo a múltiples antígenos están excluidos desviado. Después de la finalización de cada ronda de selección negativa contra cada antígeno fuera del objetivo, el proceso se controla por imágenes de AFM para asegurar que toda fago de unión a los antígenos fuera de objetivo se han eliminado. Sólo después de verificar por AFM de imágenes que se eliminan todos los fagos reactivos Qué podemos hacer para el próximo objetivo. Para aislar reactivos contra TDP-43 variantes implicadas en la ELA hemos utilizado los siguientes antígenos paneo negativos:<html> 1) BSA para eliminar los fagos que se unen débilmente o no específicamente a las proteínas; 2) agregada alfa-sinucleína para eliminar los fagos que se unen a elementos estructurales genéricas de agregados de proteínas; 3) homogeneizados de tejido cerebral humano para eliminar los fagos que se unen a cualquiera de las proteínas u otros componentes presentes en las muestras post-mortem del tejido cerebral humano sano; 4) inmunoprecipitada TDP-43 a partir de cerebro humano sano para eliminar los fagos que se unen a todos TDP-43 formularios relacionados con el cerebro humano sano; y 5) inmunoprecipita TDP-43 aislada de homogeneizados de cerebro FTD para eliminar los fagos que se unen TDP-43 variantes asociadas con la no-ELA patología. Después de la eliminación de todos fago reactivo a todos los antígenos fuera de objetivo, se procedió entonces a la fase de panning positivo durante el cual se aíslan fragmentos de anticuerpos que se unen al antígeno de interés, en este caso TDP-43 inmunoprecipitada a partir de tejido cerebral ALS humana. Estos anticuerpos aislados pueden ser reactivos a las formas de TDP-43 agregados o modificados. &quot;&gt; Biopanning fago convencional se centra principalmente en la fase de panning positivo 22,23. Por lo general, la diana de interés se inmoviliza, la biblioteca de fagos añadió y los fagos unidos se eluyó. Los fagos se amplifican y se añade a la meta de nuevo. Este proceso de amplificación y la incubación por lo general se repite varias veces para aumentar el porcentaje de fagos de unión positiva. Si bien las variaciones de este proceso se han utilizado ampliamente para aislar reactivos de anticuerpos contra una amplia gama de antígenos diana, por lo general requiere grandes cantidades de antígeno diana purificada 24,25,26, 27, mientras que nuestro proceso sólo requiere pequeñas cantidades de antígeno diana. El protocolo descrito aquí se puede utilizar para aislar reactivos que se unen selectivamente a antígenos diana que están presentes en concentraciones muy bajas, sin la necesidad de purificación y la panoramización se pueden realizar directamente contra antígeno presente en muestras de tejidos complejos. El uso de protocolos de panning negativos exhaustivos que se han verificadopor AFM asegura que los clones aislados contra el antígeno positivo deben unirse selectivamente el objetivo incluso cuando no purificada o enriquecida. Kasturirangan y colaboradores (2003) han llevado a cabo un proceso biopanning negativa y positiva similar para aislar anticuerpos reactivos a oligomérica beta-amiloide mediante la concentración de nanogramos del objetivo 5. Aquí ampliar este proceso para permitir la generación de reactivos que se unen selectivamente a la proteína específica de la enfermedad variantes directamente a partir de muestras de tejidos humanos. En estudios futuros se pretende investigar más a fondo no sólo el valor de diagnóstico de los reactivos aislados aquí, sino también evaluar su relevancia terapéutica para el tratamiento de ALS. En general, nuestra nueva tecnología basada biopanning AFM debe ser aplicable al aislamiento de cualquier variante de proteína específica de la enfermedad en cualquier material biológico sin la necesidad de purificación de proteínas o modificación, incluso cuando el antígeno diana concentrations son extremadamente bajos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="940">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:287px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:212px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:323px;">Tomlinson I and J Libraries</td>
			<td style="width:287px;">MRC (Cambridge, England)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sheets Library</td>
			<td style="width:287px;">MRC (Cambridge, England)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2xYT</td>
			<td style="width:287px;">BD Sciences</td>
			<td style="width:119px;">244020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Glucose</td>
			<td style="width:287px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0188-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:287px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0339-25G</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">KM13 Helper Phage</td>
			<td style="width:287px;">MRC (Cambridge, England)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:287px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">5880</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Polyethylene Glycol 8000</td>
			<td style="width:287px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">6510</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:287px;">Macron</td>
			<td style="width:119px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:287px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0404-1KG</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:287px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">PX1405-1</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:287px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0781-500G</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">TG1 Cells</td>
			<td style="width:287px;">MRC (Cambridge, England)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria-Bertani Agar</td>
			<td style="width:287px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">1.10283.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:287px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">STEN buffer</td>
			<td style="width:287px;">Crystalgen Inc.</td>
			<td style="width:119px;">33429775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Immunotubes</td>
			<td style="width:287px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">470319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Mica</td>
			<td style="width:287px;">Spruce Pine Mica</td>
			<td style="width:119px;">24365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Tween 20</td>
			<td style="width:287px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Trypsin</td>
			<td style="width:287px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T-0303</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triethylamine</td>
			<td style="width:287px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T-0886</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Glycerol</td>
			<td style="width:287px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0854-1L</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">DNA Plasmid Prep Kit</td>
			<td style="width:287px;">qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27106</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Non-Fat Milk Powder</td>
			<td style="width:287px;">Carnation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">96-Well High Binding ELISA Plate</td>
			<td style="width:287px;">Costar</td>
			<td style="width:119px;">3590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Anti-M13 HRP</td>
			<td style="width:287px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">27-9421-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:323px;">ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit</td>
			<td style="width:287px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">37074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody</td>
			<td style="width:287px;">ProteinTech</td>
			<td style="width:119px;">10782-2-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">A/G Agarose Beads</td>
			<td style="width:287px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">HB 2151 Cells</td>
			<td style="width:287px;">MRC (Cambridge, England)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropylthiogalactoside</td>
			<td style="width:287px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">13325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">9e10 HRP</td>
			<td style="width:287px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Nitrocellulose Membrane</td>
			<td style="width:287px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">162-0115</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:287px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Sorvall RC 6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:287px;">Veeco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AFM Probes</td>
			<td style="width:287px;">VistaProbes</td>
			<td style="width:119px;">T300R-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel atomic force microscopy based biopanning for isolation of morphology specific reagents against tdp-43 variants in amyotrophic lateral sclerosis

Debido variantes de proteínas juegan un papel crítico en muchas enfermedades incluyendo TDP-43 en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la alfa-sinucleína en la enfermedad y el beta-amiloide y tau en la enfermedad de Alzheimer, es de vital importancia para el desarrollo de reactivos específicos morfología que pueden dirigirse selectivamente Parkinson estas proteínas específica de la enfermedad variantes para estudiar el papel de estas variantes en la patología de la enfermedad y para posibles aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Hemos desarrollado nuevos microscopía de fuerza atómica (AFM) técnicas biopanning base que permiten el aislamiento de los reactivos que reconocen selectivamente variantes de proteínas específicas de la enfermedad. Hay dos fases clave implicados en el proceso, las fases de panning negativos y positivos. Durante la fase de panning negativo, los fagos que son reactivos a los antígenos fuera de objetivo se eliminan a través de múltiples rondas de cribado sustractiva utilizando una serie de antígenos cuidadosamente seleccionados fuera de objetivo. Una característica clave de la negativafase de la panorámica es la utilización de imágenes de AFM para vigilar el proceso y confirmar que se eliminan todas las partículas de fago no deseados. Para la fase de panning positivo, el antígeno diana de interés se fija sobre una superficie de mica y fagos unidos se eluyen y se tamiza para identificar los fagos que se unen selectivamente al antígeno diana. La variante de proteína diana no necesita ser purificado proporcionando los controles negativos apropiados de panning se han utilizado. Incluso objetivo variantes de proteínas que sólo están presentes en concentraciones muy bajas en el material biológico complejo se puede utilizar en la etapa de panning positivo. A través de la aplicación de esta tecnología, hemos adquirido anticuerpos contra proteínas variantes de TDP-43 que se encuentran de forma selectiva en el tejido cerebral ALS humana. Esperamos que este protocolo debe ser aplicable a la generación de reactivos que se unen selectivamente variantes de proteínas presentes en una amplia variedad de diferentes procesos biológicos y enfermedades.

En la Figura 1, el esquema muestra el proceso paneo negativo por el cual hemos eliminado fago de unión fuera de objetivo antígenos de nuestra biblioteca utilizando inmunotubos. Inicialmente Empezamos con BSA ya que este es un agente de bloqueo común y cualquier fagos que reaccionan de forma no específica con este objetivo sería problemático en inmunoensayos futuras. A continuación, hemos eliminado aglutinantes a agregados de alfa-sinucleína para eliminar los fagos que son reactivos con estructur...

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Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Novela Microscopía de Fuerza Atómica Based biopanning para el aislamiento de Morfología reactivos específicos contra la TDP-43 variantes en la esclerosis lateral amiotrófica

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

novel-atomic-force-microscopy-based-biopanning-for-isolation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.7K vistas.  Arizona State University. Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Video: Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Inmovilización de bacterias para tratamiento de imágenes de microscopía de fuerza atómica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Investigación

Bioingeniería

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

La cuantificación de las propiedades mecánicas de la glicocálix endotelial con la Microscopía de Fuerza Atómica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Un nuevo método para la localización de cuentas fluorescentes Reporter cerca de la superficie de la célula de la cultura para Microscopía de Fuerza de Tracción

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

In Situ Microscopía para la determinación en tiempo real de la morfología de una sola célula en bioprocesos

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Aplicación de microscopía de fuerza atómica para detectar la osteoartritis temprana

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automatización De Las Mediciones De Microscopio De Fuerza Bio-Atómica En Cientos De Células De C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning and transmission electron microscope, to the invention of atomic force microscopy, and advances in fluorescent imaging, there have been substantial gains in technologies that enable the study of small materials. Conpokal is a portmanteau that combines confocal microscopy with atomic force microscopy (AFM), where a probe &#8220;pokes&#8221; the surface. Although each technique is extremely effective for the qualitative and/or quantitative image collection on their own, Conpokal provides the capability to test with blended fluorescence imaging and mechanical characterization. Designed for near simultaneous confocal imaging and atomic force probing, Conpokal facilitates experimentation on live microbiological samples. The added insight from paired instrumentation provides co-localization of measured mechanical properties (e.g., elastic modulus, adhesion, surface roughness) by AFM with subcellular components or activity observable through confocal microscopy. This work provides a step by step protocol for the operation of laser scanning confocal and atomic force microscopy, simultaneously, to achieve same cell, same region, confocal imaging, and mechanical characterization.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Presented here is the protocol of the Conpokal technique, which combines confocal and atomic force microscopy into a single instrument platform. Conpokal provides same cell, same region, near simultaneous confocal imaging and mechanical characterization of live biological samples.

Microscopía de Fuerza Atómica y Confocal de Escaneo Láser Casi Simultánea (Conpokal) en Células Vivas

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...