The authors would also like to thank all participants who donated samples for this work. This work was funded by the Office of Justice Program, National Institute of Justice, Department of Justice under award number 2010-DN-BX-K139. The funding agencies had no involvement in the study design, in collection, analysis and interpretation of data, or in the writing of the report. Points of view in this document are those of the authors and do not necessarily represent the official positions of the U.S. Department of Justice.

NOTA: Los líquidos corporales se obtuvieron de voluntarios utilizando procedimientos aprobados por la Universidad de la Junta de Revisión Institucional de la Florida Central. Consentimiento informado, se obtuvo de cada donante. 1. Recolección de biopartículas de objetos y superficies que se tocan <ol><li> Cortar el gel de película al tamaño deseado. Asegúrese de que es el tamaño adecuado para el portaobjetos de microscopio de vidrio que se utiliza como soporte sólido. Por ejemplo, para una &quot;x 1&quot; portaobjetos de vidrio 3, utilizar un tamaño de gel de película de 2 &quot;x 0,75&quot;. NOTA: La longitud y la anchura del material puede reducirse, si se desea, pero no debe exceder este tamaño. </li><li> Remueva la capa blanca del gel de película y una el gel-película al portaobjetos de microscopio (Figura 1). Presione firmemente para asegurar una unión completa. NOTA: Hay una capa protectora superior claro que no se debe quitar para permitir que se aplique presión a lo largo de la pieza de gel-film sin contaminar la superficie del gel de película. Diapositivas gel película preparada (con capa protectora adjunta) se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta que se necesite. </li><li> Retire la película protectora superior transparente del gel de película con unas pinzas estériles cuando esté listo para usar (Figura 1B) la muestra de gel-película. Coloque la superficie del gel de película en contacto directo con el objeto deseado tocado o superficie (Figura 2). Aplique una pequeña cantidad de presión para asegurar la transferencia eficiente de bio-partículas de gel-película. NOTA: Si se aplica demasiada presión, el portaobjetos de vidrio podría romperse. NOTA: múltiples muestreos desde el mismo objeto o superficie se pueden recoger en la misma pieza de gel de película. </li><li> Confirme la transferencia de bio-partículas en el gel-film (Figura 3) colocando el portaobjetos en un microscopio estereoscópico (trans o epi-iluminación se pueden utilizar). Uso magnificación de 20X ~ de las mejores zonas de mayor tamaño de visualización del gel de película, y la ampliación de ~ 200X para mejor viewing bio-partículas individuales. </li><li> Guarde la diapositiva muestra de gel de película a temperatura ambiente en una caja portaobjetos cubierta o utilizar de inmediato para la tinción y o colección / bio-partícula. </li></ol> 2. La tinción opcional de biopartículas para ayudar en la visualización <ol><li> Coloque la diapositiva muestra de gel-película preparada en el paso 1 en una parrilla corrediza mancha sobre un fregadero. </li><li> Usando una pipeta de transferencia desechable, cubrir toda la superficie del gel de película con tinción de azul de tripano (Figura 4A). Incubar a temperatura ambiente durante 1-2 min. </li><li> Retire el exceso de colorante por la inclinación del tobogán para que la mancha se escurra en el fregadero (Figura 4B). NOTA: La diapositiva se puede aclarar por las inundaciones suave con agua estéril utilizando una pipeta de transferencia desechable si es necesario (Figura 4C). </li><li> Permitir el portaobjetos se seque al aire antes de proceder al aislamiento de los bio-partículas. Ver el portaobjetos con un microscopio estereoscópico (~ 20X para la visión global y ~ 200-300X a vbiopartículas individuales IEW) para asegurar la tinción adecuada (Figura 4D-E). NOTA: La diapositiva se puede almacenar a temperatura ambiente en una caja portaobjetos cubierto. </li></ol> 3. El aislamiento de las biopartículas de interés para el análisis <ol><li> Coloque el número apropiado de 0,2 ml tubos de PCR en un bastidor y etiquetar los tubos adecuadamente. </li><li> Preparar la mezcla de amplificación STR (ver Lista de Materiales) en una campana de amplificación por PCR designado o gabinete de bioseguridad. Vortex la mezcla maestra bien y centrifugar brevemente en una mini-centrífuga. <ol><li> El volumen de mezcla de amplificación necesaria por muestra es de 3,5 l; preparar un volumen apropiado de mezcla maestra para el número deseado de muestras. </li></ol></li><li> Pipetear 3,5 l de mezcla de amplificación en cada tubo de 0,2 ml. Tapar cada tubo sin apretar. </li><li> Coloque un pedazo de cinta adhesiva doble sobre un portaobjetos de vidrio limpio o directamente sobre un bloque de vidrio. NOTA: Esto se utiliza para mantener laTubo de 0,2 ml en su lugar durante la recogida de muestras. </li><li> Coloque un pedazo de cinta adhesiva doble sobre un portaobjetos de vidrio limpio. Coloque un pedazo de cinta de soldadura de ola soluble en agua en la parte superior de la cinta adhesiva doble. NOTA: Esta diapositiva puede ser almacenado en un desecador para uso futuro. </li><li> Coloque el primer tubo de 0,2 ml en la doble cara cinta de palo o de bloques preparado en el paso 3.4. Establezca este tubo a un lado hasta que se tomó la muestra. </li><li> Coloque la soldadura de ola de diapositivas cinta soluble en agua bajo el microscopio (ampliación baja). Con la punta de una aguja de tungsteno, raspar suavemente la superficie de la cinta con el fin de recoger una pequeña cantidad (o &quot;bola&quot;) de adhesivo en el extremo de la aguja (Figura 5A). NOTA: El tamaño de la bola puede ser pequeño o grande dependiendo del número de biopartículas que serán recogidos. </li><li> Retire cuidadosamente la aguja de tungsteno con adhesivo de bajo el microscopio sin molestar a la punta de la aguja. La aguja puedeser el lugar en un estante si se desea durante la colocación de la muestra. </li><li> Colocar la muestra preparada de gel de película (de los pasos 1 y 2) en la platina del microscopio. Ajuste el enfoque y la ampliación hasta las biopartículas pueden ser fácilmente visualizados. Identificar los bio-partículas que serán recogidos. NOTA: un bloque de vidrio se puede utilizar para apoyar la diapositiva si es necesario. </li><li> Recuperar la aguja de tungsteno con el balón de adhesivo, y colocar la aguja sobre la superficie del gel de película donde se encuentran los bio-partículas de interés. Presione la punta de la aguja (con adhesivo) hacia abajo de manera que está en contacto con el bio-partícula (Figura 5B). Levante la aguja hacia arriba para garantizar que el bio-partículas se ha recogido. Repita este proceso hasta que se ha recogido el número deseado de bio-partículas. </li><li> Coloque el preparado de 0,2 ml tubo de PCR en la platina del microscopio. Ajuste la ampliación de modo que el fondo del tubo que contiene la mezcla de amplificación está en el foco. </li><li> Introduzca con cuidado el Needl tungstenoe en el tubo de 0,2 ml PCR hasta que la punta de la aguja está en la mezcla de amplificación. NOTA: Esto se realiza mejor mientras observa a través del microscopio. </li><li> Mantenga la aguja en la mezcla de amplificación hasta que se disuelve el adhesivo y el biopartículas se liberan en solución (Figura 5C). Retire la aguja, coloque los 0,2 ml en posición vertical y sin apretar tapar el tubo. </li><li> Repita el procedimiento de recogida de muestras adicionales. Limpie la aguja de tungsteno con alcohol pre-humedecido (isopropanol) toallitas entre muestras. </li></ol> 4. Combinado microvolumen Nucleic Acid Aislamiento (lisis directa) y autosómica Short Tandem Repeat (STR) Perfilado <ol><li> Preparar el tampón de lisis (ver Materiales) en una campana de amplificación por PCR designado o gabinete de bioseguridad. Añadir 1,5 l de tampón de lisis a cada tubo para un volumen de reacción total de 5 l. Cerrar el tubo de tapas herméticamente. NOTA: Los tubos de 0,2 ml ya contienen 3,5 l de lamezcla de amplificación y la colección bio-partículas desde el paso 3. </li><li> Colocar las muestras en el termociclador y amplificar las muestras usando las siguientes condiciones de ciclo: 75 ° C durante 15 minutos; 95 ° C durante 11 minutos; 34 ciclos de 94 ° C durante 20 seg y 59 ° C durante 3 min; 60 ° C durante 10 min; y mantenimiento a 4ºC. <ol><li> Productos de amplificación se almacena a 4 ° C para el almacenamiento a corto plazo. </li></ol></li></ol> 5. La detección del producto - electroforesis capilar (CE) <ol><li> En una placa de 96 pocillos, añadir 10 l de mezcla CE consecutivo (9,7 l de formamida desionizada y el tamaño estándar de 0,3 l, ver Materiales). Añadir 1 l de producto amplificado o una escalera alélica a cada pocillo. PRECAUCIÓN: La formamida es un mutágeno potencial y debe ser manejado en una campana química mientras que use el equipo de protección personal adecuado. </li><li> Utilice condiciones electroforéticas especificados por el fabricante en el manual del kit de amplificación o internally validado condiciones. </li><li> Analizar los datos en bruto con software de análisis de STR. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Aquí hemos descrito métodos para la recolección y análisis de genética mejorada de biopartículas recuperados de las pruebas de ADN toque. El enfoque desarrollado involucra lo siguiente: 1) la recolección de material biológico (es decir, las biopartículas) a través de gel de capa de objetos tocados y superficies, prendas gastadas o la piel humana directa, 2) el examen microscópico del material biológico recuperado para asegurar la recolección de potencial material humano biológica, y 3) la micromanipulación de biopartículas único o pocos utilizando un adhesivo soluble en agua, y 4) perfiles de ADN autosómico-STR de las biopartículas recogieron usando un microtomo (5 l) de una sola etapa de lisis / reacción de amplificación. El uso de una reacción de tubo cerrado de un solo paso reduce el potencial de contaminación de la muestra y la pérdida de manipulaciones de muestra adicionales o transferencia a otros tubos de reacción. El solo paso mejorado microvolumen (5 l) lisis / reacciones de amplificación STR permite la recuperación de la plena o probative STR perfiles del donante de biopartículas único o pocos. Este enfoque fue desarrollado para obtener perfiles individuales STR fuente de contacto pruebas de ADN de una o varias fuentes (por ejemplo, artículos usados ​​de vestir y otros artículos para el hogar, tocado / objetos y superficies manejadas, mezclas de piel / piel). Se ha utilizado con éxito para la detección del donante masculino en muestras físicas simuladas mezcla asalto. Este enfoque podría evaluarse aún más en escenarios adicionales de mezcla de fluidos corporales / tejido tales como víctima rascándose la / su agresor, en la que sólo unos pocos biopartículas del agresor estarían presentes entre una abrumadora cantidad de material biológico de la víctima. Además, ya que este enfoque desarrollado en el estudio actual permite el análisis a nivel biopartículas única, que podría ser utilizado para obtener una mejor comprensión de la naturaleza y el alcance de transferencia secundaria 14-19, en el que un intermediario transfiere un perfil de ADN en un surface, objeto o persona a otro objeto de superficie o de la persona 20. Un enfoque ciego-hisopado para el análisis de transferencia secundaria puede fallar para identificar trazas de material desde el donante secundaria. El enfoque desarrollado aquí permite el análisis de biopartículas único o pocos y por lo tanto los resultados no son confundidos por la presencia de una cantidad abrumadora de material biológico del donante primario. Las metodologías desarrolladas en este trabajo también puede tener implicaciones para el análisis de material biológico rastro en casos de agresión sexual como las relacionadas con la penetración digital de la vagina donde la identificación positiva de pequeñas cantidades de células de la piel del agresor podría ser crucial para establecer que el contacto sexual ocurrido. Mientras que la colección de biopartículas de muestra de gel de película no implica manipulaciones difíciles y complejos, hay pasos críticos en este procedimiento que deban llevarse a cabo con gran cuidado para asegurar el Doccessful transferencia de biopartículas al recipiente de reacción aguas abajo. La colección de biopartículas con el adhesivo soluble en agua debe ser visto microscópicamente (es decir, estereomicroscopio a gran aumento (~ 200-300X) para asegurar que se recogen sólo las biopartículas de interés. Dependiendo del tamaño de la &quot;bola&quot; adhesivo utilizado, hay es el potencial para recoger el material circundante adicional que puede incluir tanto material biológico y no biológico (por ejemplo, fibras, otros residuos). La colección de biopartículas adicionales no deseadas puede resultar en la recuperación de los perfiles de ADN mezclados. La colección de material no biológico puede introducir inhibidores en la lisis micro-volumen / reacciones Str. Si varios biopartículas se recogen con el mismo adhesivo &quot;bola&quot;, hay un potencial de biopartículas recogidos previamente a convertirse unattached del adhesivo. Esto no se observa con frecuencia, pero puede ocurrir cuando un mayor número de bioparticlES son recogidos (por ejemplo, más de 50) con una sola &quot;bola&quot; adhesivo. Si un gran número de biopartículas están dirigidos, se recomienda que se realizan varias colecciones de menos biopartículas pero todos transferidos en el mismo tubo de 0,2 ml. Una vez que se han recogido biopartículas, se debe tener cuidado durante la retirada de la corredera gel de película de la platina del microscopio y la colocación del tubo de 0,2 ml para que la punta de la aguja no se perturba. Durante la colocación de la punta de la aguja en la mezcla de amplificación en la parte inferior del tubo de 0,2 ml, la punta de la aguja no debe hacer contacto con los lados del tubo con el fin de evitar la pérdida de material en los lados del tubo. Mientras que la solubilización del adhesivo es típicamente rápida (~ 30 seg o menos dependiendo del tamaño de la &quot;bola&quot; adhesivo) y puede vigilarse durante el examen microscópico, la punta de la aguja debe ser retirado lentamente de la mezcla de amplificación para asegurar que completa solubilizacióndel adhesivo que se ha logrado. Si el adhesivo no se ha disuelto completamente, la aguja puede ser devuelto al líquido para permitir la disolución completa. Los protocolos descritos aquí se han optimizado para su uso con biopartículas y células humanas de evidencia biológica forense. El tampón de lisis seleccionado es compatible con el kit de amplificación de ADN-STR seleccionado. Si bien puede haber tampones de lisis alternativas adecuadas, su eficiencia en términos de la lisis celular y la compatibilidad con los análisis de aguas abajo debe ser verificada por el usuario. Además, el número de kit de amplificación de STR y ciclo de amplificación se describe en este protocolo ha sido optimizado para su uso con biopartículas único o pocos. Se seleccionó un kit de amplificación de STR próxima generación con informado de una mayor robustez y la sensibilidad y se ha demostrado para dar lugar a la recuperación de perfiles STR de alta calidad de biopartículas único o pocos. Mientras que muchos otros juegos de STR, con diferentes amplifi recomendadonúmero de ciclos de cationes, están disponibles, pueden no poseer la sensibilidad adecuada y por lo tanto tendrían que ser evaluados adecuadamente antes de su uso en estos protocolos. A pesar de la utilización con éxito de los métodos descritos para los perfiles STR recuperación de biopartículas único o pocos, la tasa de éxito de la recuperación de perfil no será 100%. Por lo tanto, para algunas muestras se pueden observar un perfil de ADN parcial limitada o sin perfil. Esto no se puede evitar debido a la incapacidad para identificar de manera concluyente visualmente la mayoría de biopartículas como material celular, el potencial estado de degradación del material nuclear en las biopartículas o pérdida de material de muestra desde el adhesivo recogidos antes de la transferencia al recipiente de reacción. Por lo tanto, no se recomienda el análisis de una sola muestra biopartícula para cada elemento de ADN toque. Con frecuencia recopilamos 20 conjuntos de muestras de una muestra individual en gel de película y recopilaremos conjuntos de muestras adicionales según sea necesario si no se obtiene un perfil STR adecuado. Tél única limitación para las colecciones es la cantidad de material biológico presente en la muestra de gel de película (y probablemente el coste de análisis, aunque las reacciones microvolumen proporcionan la oportunidad de recoger muestras adicionales para un coste similar o inferior como un volumen de reacción estándar único ( por ejemplo, 25 l). Los métodos de perfiles de ADN desarrollados describen aquí proporcionan un enfoque basado molecular para la caracterización, análisis e interpretación de material biológico rastro recuperado de muestras de ADN de toque. Sin embargo, no hay información genética adicional que puede obtenerse a partir de las biopartículas recuperados, además de la determinación del donante (es decir, el perfil de STR) del donante del material biológico. La fuente de tejido o fluido corporal de origen (por ejemplo, la piel frente a la saliva) puede proporcionar información contextual crucial para una investigación criminal. Sin tal determinación, la ambigüedad de la fuente de tejido de origen puede ser explitada como las circunstancias alternativas del delito (por ejemplo, ¿cómo puede haber sido depositado el fluido corporal) podría ser sugerido. Los protocolos de recogida de biopartículas y aislamiento descritos aquí se podrían utilizar para recopilar biopartículas u otras células (por ejemplo, bucal, vaginal) para uso en una identificación de la fuente de tejido (mRNA de perfiles 21-30) estrategia que implica micro-volumen de transcripción inversa (RT) y reacciones de amplificación. Con una optimización adicional también puede ser posible desarrollar un / estrategia de co-aislamiento de ARN de ADN para permitir la identificación del tipo de célula (ARN) y de perfiles STR de la misma muestra, incluyendo biopartículas de pruebas de ADN táctil.

ADN Touch es una forma de evidencia biológica rastro que es la transferencia directa de material celular (por ejemplo, eliminar las células de la piel) de un individuo a un objeto u otra persona durante el contacto físico 1. La capacidad de obtener perfiles de ADN a partir de una variedad de objetos tocados (documentos, ropa de cama, zapatos, armas de fuego, vasos, bolígrafos, maletín manijas) se ha reportado en la literatura 2-9. Un factor crítico en el análisis de las pruebas de ADN tacto es el éxito de la recuperación de la traza material biológico presente. Touch pruebas de ADN se recoge normalmente con un hisopado de la zona sospechosa con un algodón estéril (referido como &quot;ciego-hisopado&quot;). Usando este enfoque, la naturaleza del material biológico recolectado no se conoce y se realiza el muestreo de un área generalizada. La presencia de surcos superficiales o grietas puede impedir el éxito de la recuperación de la frecuencia ya pequeña cantidad de bimaterial de ological presente. Además, un enfoque de &quot;ciego-hisopado&quot; voluntad material celular necesariamente co-muestra de los diferentes individuos cuyas células están presentes en el artículo, incluso si las células de los individuos se encuentran en lugares espacialmente distintas sobre el tema. La recuperación de los perfiles de ADN mezclados, que a menudo son difíciles de resolver en particular con muestras de ADN de bajo plantilla, se observa con frecuencia 8,10,11 y en muchos casos será un artefacto consecuencia del proceso de hisopado sí mismo. Si sólo una pequeña cantidad de material estuvo presente desde uno de los donantes, técnicas de extracción y análisis estándar pueden fallar para recuperar un perfil de la contribuyente menor. Además, el tipo de hisopo o si se utilizó seco o húmedo (pre-humedecido con agua estéril) puede influir en la cantidad de material biológico, que se recaba debido a diferencias en la capacidad de absorción y capacidad de adsorción y la eficacia de liberación del material biológico 12. Smétodos de extracción tandard pueden resultar en la pérdida de muestra adicional debido a la manipulación física que se requiere de los pasos de ejemplo o de transferencia de la muestra. Como se describió anteriormente, las técnicas de hisopado simples para la recuperación de material biológico pueden resultar en la pérdida de cantidades traza de muestra biológica, así como una mayor incidencia de perfiles mezclados debido a un fallo para separar los componentes biológicos individuales. Por lo tanto, hemos tratado de desarrollar estrategias más selectivas y eficientes de recuperación para la recolección de micropartículas celulares presentes en objetos tocados. La estrategia desarrollada para el análisis de material biológico de las pruebas de ADN touch (referido aquí como &quot;biopartículas&quot; debido al hecho de que un núcleo no siempre es visible ya que la mayoría de las células que se encuentran en la capa epidérmica exterior de la piel están muertos o moribundos queratinocitos 13) consiste en lo siguiente: 1) la recolección de material biológico (es decir, las biopartículas) a través fr gel de películaom tocó objetos y superficies, prendas desgastadas o piel humana directa, 2) El examen microscópico del material biológico recuperado para asegurar la recolección de material biológico humano potencial, y 3) de micromanipulación de bio-partículas individuales o pocos utilizando un adhesivo soluble en agua, y 4) los perfiles de ADN autosómico-STR de los bio-partículas recolectadas utilizando un microvolumen (5 l) de un solo paso de lisis / reacción de amplificación. Este procedimiento ofrece numerosas ventajas sobre los métodos de análisis utilizados tradicionalmente. Recuperación de biopartículas utilizando el gel de película permite a un examen microscópico del material biológico presente en la muestra antes del análisis. Si bien la mayoría de las biopartículas recuperados de las pruebas de ADN contacto puede no ser células nucleadas lo que hace más difícil determinar qué o cuántas se deben seleccionar bio-partículas, el examen microscópico de las muestras antes del análisis proporciona a la oportunidad para buscar células nucleadas así maximizing la probabilidad de recuperación perfil de ADN. La colección de biopartículas utilizando adhesivo soluble en agua micromanipulación asistida permite la transferencia directa de biopartículas específicas en tubos de reacción. Este procedimiento se visualizó bajo el microscopio para asegurar la transferencia exitosa del material biológico. La reacción reducido o microvolumen aumenta la sensibilidad al tiempo que reduce el costo de análisis por muestra. Esto permite el análisis de un mayor número de muestras de un elemento de prueba. Debido a la variedad en el estado genético de los bio-partículas en las pruebas de ADN toque, se recomiendan múltiples muestreos de artículos individuales. Aquí, nos demuestran el uso exitoso de los protocolos desarrollados para obtener perfiles genéticos altamente probatorios de los donantes de material biológico en las pruebas de ADN toque. Los métodos de perfiles de recolección biopartícula desarrollado y ADN proporcionan una completa &quot;inteligente&quot; (es decir, específicos, medibles, attaenfoque Enable, realista y oportuna) molecular basado en la caracterización, análisis e interpretación de material biológico rastro. Aunque originalmente desarrollado para su aplicación en el análisis forense de las pruebas de ADN tacto, las estrategias desarrolladas aquí se pueden aplicar a otras fuentes de material biológico y ofrecen la oportunidad de obtener información de identificación individual en el nivel de células individuales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="998">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:320px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">SealRite 1.5 mL natural microcentrifuge tubes, sterile</td>
			<td style="width:147px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:139px;">1615-5510</td>
			<td style="width:320px;">numerous altnerative suppliers are available, but tubes should be sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">0.2 mL PCR tubes with flat cap, natural</td>
			<td style="width:147px;">Phenix Research</td>
			<td style="width:139px;">MPX-200F</td>
			<td style="width:320px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">06-666 and/or 06-666-11C</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:395px;">Alcohol prep pads</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">06-669-62</td>
			<td style="width:320px;">alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Sterile water</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:320px;">18.2 mega-ohm, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Glass microscope slides, frosted, 3&#34; x 1&#34;: 1mm</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">12-544-3</td>
			<td style="width:320px;">alternative brands or sizes are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Disposable transfer pipet</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">13-711-9D</td>
			<td style="width:320px;">alternatives are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Trypan blue solution</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">T8154</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,1000 mL</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Sterile, aerosol-resistant pipet tips</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Mini-centrifuge</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:139px;">M205C</td>
			<td style="width:320px;">others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:395px;">GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block)</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">N8050200 or 4314878</td>
			<td style="width:320px;">other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">3130 Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">3130-01</td>
			<td style="width:320px;">Alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">GeneMapper software</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">various</td>
			<td style="width:320px;">Various versions of the software are available and can be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">WF Gel-Film , x8 retention level</td>
			<td style="width:147px;">Gel-Pak</td>
			<td style="width:139px;">WF-40-x8-A</td>
			<td style="width:320px;">4&#34; x 4&#34; wafer film; can be ordered in other size specifications</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Double sided tape</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:395px;">Glass block, 3&#34; x 1.5&#34; x 3/8&#34;</td>
			<td style="width:147px;">McCrone Microscopes and Accessories</td>
			<td style="width:139px;">370-2</td>
			<td style="width:320px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:395px;">Tungsten needle with holder</td>
			<td style="width:147px;">McCrone Microscopes and Accessories</td>
			<td style="width:139px;">106</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">3M&#160; water soluble wave solder tape, 5414 transparent</td>
			<td style="width:147px;">Allied Electronics</td>
			<td style="width:139px;">70113977</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:395px;">Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem)</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:139px;">95043-992</td>
			<td style="width:320px;">Lysis buffer is prepared in 10 ml portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 ml is used for each sample. To prepare 10 ml of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 mL sterile water, 2.1 mL 10x buffer - blue, 1 mL forensicGEM.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:395px;">STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">4427368</td>
			<td style="width:320px;">Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 ml PCR reaction mix, 1.1 ml Primer set, 0.2 ml (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 ml of the prepared mix is added to the 0.2 mL tube for bio-particle collection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">AmpliTaq Gold DNA polymerase</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">N808-0245</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">HiDi formamide</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">4311320</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">GeneScan 500 LIZ size standard</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">4322682</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">96 well optical reaction plates</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">N8010560</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Plate septa, 96 well</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">4315933</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Performance-optimized polymer, POP-7</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">4363785</td>
			<td style="width:320px;">Alternatives such as POP-4 are acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced genetic analysis of single human bioparticles recovered by simplified micromanipulation from forensic &#8216;touch dna&#8217; evidence

Los perfiles de ADN se pueden obtener a partir de pruebas &quot;toque de ADN &#39;, que comprende trazas microscópicas de material biológico humano. Los métodos actuales para la recuperación de ADN rastro hisopos de algodón empleo o cinta adhesiva para degustar un área de interés. Sin embargo, un enfoque de este tipo &quot;blind-hisopado &#39;co-muestra de material genético molecular de los diferentes individuos, incluso si las células de los individuos se encuentran en lugares geográficamente distintos en el artículo. Por lo tanto, algunas de las mezclas de ADN encontradas en muestras de ADN táctiles son creados artificialmente por el hisopado en sí. En algunos casos, el ADN de una víctima puede ser encontrada en exceso significativo enmascarando así DNA de cualquier agresor potencial. Con el fin de eludir los retos con los métodos de recuperación y análisis estándar, hemos desarrollado un menor costo, método de &quot;análisis inteligente&quot; que se traduce en el análisis genético mejorado de las pruebas de ADN toque. Describimos un un optimizadod eficiente estrategia de recuperación de micromanipulación para la recogida de bio-partículas presentes en muestras de ADN táctil, así como una estrategia de amplificación mejorada que implica un solo paso 5 l amplificación lisis microvolumen / STR para permitir la recuperación de perfiles STR del donante bio-partícula (s). El uso de la persona o pocos (es decir, &quot;grumos&quot;) biopartículas resultados en la capacidad de obtener perfiles de origen individuales. Estos procedimientos representan técnicas mejoradas alternativas para el aislamiento y análisis de biopartículas individuales de las pruebas de ADN toque forense. Aunque no es necesario en cada investigación forense, el método podría ser muy beneficioso para la recuperación de un perfil de ADN autor de una sola fuente en los casos de asalto físico (por ejemplo, la estrangulación) que no puede ser posible mediante técnicas de análisis estándar. Además, las estrategias desarrolladas aquí ofrecen la oportunidad de obtener la información genética en el nivel de células individuales a partir de una variedad de oTher rastro no forense material biológico.

Imágenes representativas de biopartículas individuales y agrupadas que se recuperaron a partir de un cuello de la camisa (100% poliéster) usado por un donante masculino se muestran en la Figura 6 (biopartículas individuales) y la Figura 7 (biopartículas agrupadas). Las biopartículas se recuperaron de la cuello de la camisa usando el protocolo descrito aquí: transferencia de biopartículas desde el cuello de la camisa de gel de película a través del contacto directo, la tinción de las biopartículas recuperados con azul de tripano, la recogida de muestras de biopartículas utilizando una aguja de tungsteno y el adhesivo soluble en agua y el análisis de STR ​​utilizando la amplificación 5 l micro-volumen de lisis / STR. Figuras 6 y 7 representan una muestra típica de biopartículas que ser analizada desde un elemento de ADN contacto individual (20 biopartículas individuales / dobles y de 20 biopartículas agrupadas). El biopartícula (s) recogidos en cada imagen están etiquetados con las mediciones de longitud y anchura (en micras). El percentage de alelos STR recuperados de cada una de las biopartículas (s) recogidos se proporciona en cada imagen individual para demostrar los grados variables de éxito que se puede esperar que se obtendrán de biopartículas con este tipo de pruebas. Las biopartículas recuperados de muestras de ADN táctiles son en gran parte los queratinocitos muertos o moribundos y por lo tanto un perfil de STR ​​probatorio no se obtuvo de cada biopartículas recogido, como se puede ver en las figuras 6 y 7. Para esta muestra cuello de la camisa, los perfiles STR se obtuvieron de 14/20 (70%) de las biopartículas individuales y 15/20 (75%) agrupados biopartículas. Sin embargo, cada uno de los perfiles recuperados rangos de valor probatorio: recuperación alelo 3-97% para los perfiles de biopartículas individuales y recuperación alelo 3-100% para los perfiles de biopartículas amontonados. Debido a la variabilidad en las tasas de éxito, se recomienda la recopilación de numerosos biopartículas de cada elemento de ADN toque. Esto asegura una mejor oportunidad de obtener un muy probatihe perfil STR. El perfil de STR ​​obtenido a partir de una de las muestras de biopartículas individuales del cuello de la camisa se ​​muestra en la Figura 8 (la biopartícula desde el que se originó el perfil se muestra a la izquierda). Casi un perfil de STR completo (28 de 30 alelos, uno locus abandonan, la precisión del perfil obtenido verificada por comparación con un perfil de referencia) se obtuvo de esta biopartículas individual. El perfil obtenido es de alta calidad, con alturas de pico inter-locus razonablemente equilibradas y no alélica de abandono. Alélica de abandono y artefactos altura pico no balanceada se observa frecuentemente con muestras de ADN bajo la plantilla. El perfil de STR ​​obtenido a partir de una de las muestras agrupadas de biopartículas del cuello de la camisa se ​​muestra en la Figura 9. Un perfil completo de STR ​​(30/30 alelos, la precisión del perfil obtenido verificada por comparación con un perfil de referencia) se obtuvo. Como se mencionó anteriormente, un perfil de STR no se recupera de Every biopartículas recogió. Un ejemplo de perfiles de ADN sin éxito de un solo biopartículas (recuperación alelo 3%, 1/30 alelos) se muestra en la Figura 10 (biopartículas individual). Si bien esto biopartícula individuo no tuvo éxito, perfiles STR una prueba convincente de que el donante de las biopartículas en esta muestra se obtuvieron de otras biopartículas recuperados de la misma muestra. Esto ilustra la necesidad de realizar múltiples muestreos sola célula / los grumos del mismo objeto. Los &quot;inteligentes&quot; métodos de análisis desarrollados aquí descritos para las pruebas de ADN táctil se han utilizado con éxito para recuperar perfiles sola fuente probatorios de una sola y biopartículas &quot;agrupadas&quot; de varios tocado objetos y prendas de vestir (por ejemplo, apoyabrazos de la silla, volantes de automóviles, teléfonos celulares, tazas de café, cigarrillos, bolígrafos, camisetas, pantalones cortos, y los suéteres). Sin embargo, de manera importante, este enfoque también se ha utilizado para la detección y el perfil de d machoonor ADN (fuente única) en las muestras de la mezcla física de contacto / asalto simulados (por ejemplo, autor agarrando la muñeca, el cuello o la ropa de la víctima, o el contacto con ropa de cama de la víctima como en las agresiones sexuales). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig1.jpg" /> Figura 1: Preparación de las placas de gel de película para la recogida de biopartículas. (A) La cubierta protectora posterior del blanco se retira con unas pinzas estériles de la pieza de gel de película para exponer el adhesivo. El gel de película luego se adhiere a un portaobjetos de vidrio con una presión firme. (B) Cuando la muestra de gel película está listo para ser utilizado para la recolección de biopartículas, la película protectora transparente superior se retira usando pinzas estériles. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig2.jpg" /> Figura 2: colección biopartículas utilizando gel-películas de diversos sustratos. Las diapositivas gel de película puede ser utilizado para recoger biopartículas de una variedad de superficies. El gel de película se coloca en contacto directo con el objeto o superficie de interés. Una suave presión se aplica con el fin de transferir biopartículas sobre la superficie de gel de la película. Colección de biopartículas de (A) los artículos usados ​​de vestir (cuello del abrigo), (B) Objetos tocó (viajes taza de café), y (C) de la piel humana directa (muñeca masculina) se muestran. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig3.jpg" /> Figura 3:. Biopartículas en un artículo de la ropa desgastada (en el interior de las bragas de la pierna) biopartículas se transfieren a gel de película a través del contacto directo con la superficie del objeto. Biopartículas se pueden encontrar como &quot;matas&quot; o biopartículas individuales / individuales (indicados con flechas rojas). <img<html> alt = &quot;Figura 4&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52612 / 52612fig4.jpg&quot; /&gt; Figura 4:. Tinción opcional de biopartículas en las diapositivas de gel de capa Para una mejor visualización de biopartículas, muestras de gel de capa se pueden teñir con colorante azul tripán. Toda la superficie de gel de película está cubierto por azul de tripano (A). Después de 1-2 minutos de la tinción, la corredera se inclina suavemente para permitir que el exceso de colorante para funcionar fuera de la diapositiva (B). Inundaciones suave con agua estéril (C) se puede utilizar para eliminar el exceso de tinción. Después de la diapositiva se seca el aire, la diapositiva se puede ver bajo el microscopio para asegurar tinción apropiada (D, E). Nota:. No todas las biopartículas aparecerán manchado (es decir, de color azul) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> oad / 52612 / 52612fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5: recogida y análisis de biopartículas. (A) Una pequeña cantidad (o &quot;bola&quot;) de cinta de soldadura de onda soluble en agua (&quot;adhesivo&quot;) se recoge en la punta de una aguja de tungsteno por raspado suave. (B) El adhesivo es entonces tocó a la de gel superficie de la película con el fin de recoger las biopartículas de interés. Biopartículas individuales o múltiples pueden ser recogidos con una bola de adhesivo individual. (C) Una vez se han recogido las biopartículas deseadas, la punta de la aguja se coloca en mezcla de amplificación en un tubo de PCR de 0,2 ml. La aguja se mantiene en el líquido hasta que se disuelva y se observa la liberación de biopartículas en la solución. Todos los pasos en el proceso de recolección se realizan y se observan bajo el microscopio para asegurar el cobro biopartícula exitosa y la transferencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver un lar</a>ger versión de esta figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig6.jpg" /> Figura 6:. Biopartículas individuales en una muestra de cuello de la camisa biopartículas se recupera usando gel de película desde el interior de un cuello de la camisa usada por un donante masculino. Los biopartículas se tiñeron utilizando azul tripán e imágenes de veinte biopartículas individuales diferentes identificados en la muestra se muestran. En cada imagen, la biopartículas que se recogió se rodeó (círculos rojos indicando biopartículas en que se recuperó un perfil; círculos negros indican biopartículas en el que no se recuperó un perfil). La recuperación alelo ciento (número de alelos observados de un máximo de 30) se muestra por encima de la imagen de biopartículas de la que se recuperó un perfil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a><img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig7.jpg" /> Figura 7: agrupados biopartículas en una muestra cuello de la camisa biopartículas se recupera usando gel de película desde el interior de un cuello de la camisa usada por un donante masculino.. Los biopartículas se tiñeron utilizando azul tripán e imágenes de veinte biopartículas agrupadas diferentes identificados en la muestra se muestran. En cada imagen, la biopartículas que se recogió con un círculo (círculos rojos indican biopartículas en el que se recuperó un perfil; círculos negros indican biopartículas en el que un perfil no se recuperó La recuperación alelo ciento (número de alelos observados de un máximo de 30). se muestra para cada biopartícula de la que se recuperó un perfil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 8: Perfil autosómica STR obtenido a partir de una sola biopartículas de un cuello de la camisa masculina Un perfil de STR ​​autosómica se obtuvo de un solo biopartículas (mostrado a la izquierda) usando los 5 l de lisis directa / reacción de amplificación.. La precisión de este perfil se determinó por comparación con una muestra de referencia de los donantes. Quince autosómica loci STR y amelogenina (determinación del sexo) son co-amplificado en una sola reacción y se separó por electroforesis capilar. Los resultados se muestran aquí como un electroferograma. Número de alelos son designación debajo de cada pico en cada locus. El eje x representa el tamaño del fragmento (pares de bases, pb) y el eje Y representa la intensidad de la señal (RFU unidades de fluorescencia relativa; prevista en cada número alelo correspondiente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig8highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de</a><html> esta cifra. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig9.jpg" /> Figura 9: Perfil autosómica STR obtenido de una biopartícula agrupada de un cuello de la camisa masculina Un perfil de STR ​​autosómica se obtuvo de una biopartícula agrupada (mostrado a la izquierda) usando los 5 l de lisis directa / reacción de amplificación.. La precisión de este perfil se determinó por comparación con una muestra de referencia de los donantes. Quince autosómica loci STR y amelogenina (determinación del sexo) son co-amplificado en una sola reacción y se separó por electroforesis capilar. Los resultados se muestran aquí como un electroferograma. Número de alelos son designación debajo de cada pico en cada locus. El eje x representa el tamaño del fragmento (pares de bases, pb) y el eje Y representa la intensidad de señal (RFU unidades de fluorescencia relativa; prevista en cada número de alelo correspondiente).pg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig10.jpg" /> Figura 10:. Ejemplo de un fracaso en la obtención de un perfil STR autosómicos obtenida de un biopartícula recogido El biopartícula individuo se muestra a la izquierda se recogió una muestra de gel de capa cuello de la camisa. Como se puede observar a partir del perfil STR resultante (mostrado a la derecha), se obtuvo un solo alelo (de 30 posible). Número de alelos son designación debajo de cada pico en cada locus. El eje x representa el tamaño del fragmento (pares de bases, pb) y el eje Y representa la intensidad de la señal (RFU unidades de fluorescencia relativa; prevista en cada número alelo correspondiente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig10highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &amp;#8216;Touch DNA&amp;#8217; Evidence

Aquí se describe una estrategia de extracción optimizado y eficiente para la recogida de bio-partículas presentes en &quot;toque de ADN &#39;muestras, junto con un protocolo de amplificación mejorada que implica un / STR amplificación de un solo paso 5 l micro-volumen de lisis, para permitir la recuperación de repetición corta en tándem (STR) perfiles del donante (s) bio-partícula.

Mejorado el análisis genético de Soltero biopartículas Humanos Recuperadas por simplificado Micromanipulación de Evidencia Forense &#39;Touch ADN&#39;

DNA profiles can be obtained from &#8216;touch DNA&#8217; evidence, which comprises microscopic traces of human biological material. Current methods for ...

enhanced-genetic-analysis-single-human-bioparticles-recovered

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &#8216;Touch DNA&#8217; Evidence

15.4K vistas.  University of Central Florida.  Aquí se describe una estrategia de extracción optimizado y eficiente para la recogida de bio-partículas presentes en "toque de ADN 'muestras, junto con un protocolo de amplificación mejorada que implica un / STR amplificación de un solo paso 5 l micro-volumen de lisis, para permitir la recuperación de repetición corta en tándem (STR) perfiles del donante (s) bio-partícula. 

Video: Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &#8216;Touch DNA&#8217; Evidence

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

La disección de Gyrus dentado del hipocampo de ratones adultos

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Investigación

Biología

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

El análisis directo de las células individuales mediante espectrometría de masas a presión atmosférica

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Un alelo-específicas Gene ensayo de expresión para probar la base funcional de las asociaciones genéticas

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for laboratory personnel. Pantropic lentiviruses, such as the commonly used VSV-G pseudotype, are a valuable tool for studying gene function because they can transduce many cell types, including non-dividing cells. However, researchers may wish to avoid production and centrifugation of pantropic viruses encoding oncogenes due to higher biosafety level handling requirements and safety issues. Several potent oncogenes, including c-Myc and SV40 large T antigen, are known to enhance production of induced pluripotent stem cells (iPSC). All other known iPSC-inducing genetic changes (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, and p53 loss of function) also have links to cancer, making them of relatively high safety concern as well. 
While these cancer-related viruses are useful in studying cellular reprogramming and pluripotency, they must be used safely. To address these biosafety issues, we demonstrate a method for transduction of human cells with ecotropic lentivirus, with additional emphasis on reduced cost and convenient handling. We have produced ecotropic lentivirus with sufficiently high titer to transduce greater than 90% of receptor-expressing human cells exposed to the virus, validating the efficacy of this approach. 
Lentivirus is often concentrated by ultracentrifugation; however, this process takes several hours and can produce aerosols infectious to human biomedical researchers. As an alternative, viral particles can be more safely sedimented onto cells by complexation with chondroitin sulfate and polybrene (CS/PB). This technique increases the functional viral titer up to 3-fold in cells stably expressing murine retrovirus receptor, with negligible added time and cost. Transduction of human dermal fibroblasts (HDFs) is maximally enhanced using CS/PB concentrations approximately 4-fold lower than the optimal value previously reported for cancer cell lines, suggesting that polymer concentration should be titrated for the target cell type of interest. We therefore describe the use of methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) to assay for polymer toxicity in a new cell type. We observe equivalent viability of HDFs after viral transduction using either polymer complexation or the standard dose of polybrene (PB, 6 &mu;g/ml), indicating minimal acute toxicity.
In this protocol, we describe the use of ecotropic lentivirus for overexpression of oncogenes in human cells, reducing biosafety risks and increasing the transduction rate. We also demonstrate the use of polymer complexation to enhance transduction while avoiding aerosol-forming centrifugation of viral particles.

Lentiviruses are a valuable research tool for exploring gene function; however, researchers may wish to avoid production of pantropic lentivirus encoding known or suspected oncogenes. As an alternative, we present a safer protocol for use of ecotropic lentivirus on human cells modified to express the ecotropic receptor mSlc7a1.

Transducción de las células humanas con polímeros complejos Lentivirus ecotropic de Mayor Seguridad de la Biotecnología

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Bioquímica y de Evaluación de Rendimiento microscópica de masa grasa en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

La detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por Exon de captura y secuenciación masivamente paralelo

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Culturas alternativas para Pluripotentes Stem Cell Production, mantenimiento y análisis genético

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Análisis de glucocorticoides fecales: Monitoreo suprarrenal no invasiva en los équidos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocolo de laboratorio para análisis genéticos de contenido intestinal de macroinvertebrados acuáticos con grupo-específica rDNA cartillas

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...