Los esferoides de células de cáncer de mama descritos en este documento permitirán a los investigadores investigar los mecanismos moleculares de las interacciones de las células endoteliales de las células cancerosas que están involucradas en la proliferación y metástasis de las células cancerosas. La principal ventaja de este modelo 3D es que proporciona una disposición celular más realista que mejora la fiabilidad de las inferencias con respecto a la fisiopatología y el tratamiento del cáncer de mama. Demostrando el procedimiento estará Giovanna Azzarito, una estudiante de doctorado de mi laboratorio.
Comience tratando o transfectando las células chapadas durante 24 horas, o según lo desee. Para identificar la distribución celular en esferoides, lave las células con un mililitro de Hanks'Balanced Salt Solution o HBSS, que contiene calcio y magnesio y permanezca en HUVEC utilizando 0,5 microgramos por mililitro de colorante azul. Y células MCF-7 que utilizan 0,5 colorantes verdes micromolares diluidos en el medio de crecimiento.
Coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius y cinco por ciento de CO2 durante 30 a 40 minutos. Lave las células con un mililitro de HBSS sin calcio y magnesio. Luego agregue un mililitro de reactivo de desprendimiento enzimático, que es 0.25% tripsina para HUVEC y 0.5% viajes en cuatro MCF-7 a cada plato marrón usando una pipeta P1000.
Elija cada tipo de célula por separado en un tubo de poliestireno inferior redondo de cinco mililitros y agregue un mililitro de suero fetal de pantorrilla al 10% o medio FCS utilizando una pipeta P1000 para detener la reacción enzimática. Luego centrifugue las suspensiones celulares a 250 veces G durante cinco minutos. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y suspenda las células en un mililitro de medio libre de esteroides.
Utilice 100 microlitros de cada suspensión celular diluida con 10 mililitros de diluyente 2 para determinar el número total de células. Encienda la máquina y enjuague presionando los botones de función e inicio, con la solución diluyente 2 en un vial de contador celular. Use la configuración como cuatro y presione start para medir el espacio en blanco con una solución fresca de Diluent 2.
Cambie el vial de centelleo con 100 microlitros de suspensión celular en 10 mililitros de solución de Diluent 2. Utilice configurar como cuatro y pulse start para medir las muestras. Anote el número de celdas por mililitro en la pantalla digital, luego prepare cinco mililitros de cada suspensión celular y mézclelos para obtener un volumen final de 10 mililitros en una proporción de uno a uno, utilizando pipeta de repetición manual para pipetear 100 microlitros de la suspensión celular en cada pozo de la placa de fondo en U de 96 pocillos.
Coloque la placa en una incubadora en condiciones estándar de cultivo de tejidos y verifique si hay una formación de esferoides después de 48 horas. Tome fotografías de estos esferoides a un aumento de 40 X utilizando un microscopio estéreo de contraste de fase o fluorescencia. Para preparar el cultivo de gota colgante mezclar las suspensiones celulares en una proporción de uno a uno para obtener un volumen final de dos mililitros.
Use una pipeta P20 para ver la mezcla celular en forma de gotas de 15 microlitros en el cable invertido de una placa de Petri de 10 centímetros. Invierta la tapa con las gotas y agregue cinco mililitros de medio base EBM-2 en la parte inferior del plato para evitar la evaporación de las gotas. Recolecte aproximadamente 50 esferoides en un tubo de 1.5 mililitros con la punta intestinal de una pipeta de microlitro P200.
Deje que se asienten en el fondo del tubo por gravedad y luego deseche el sobrenadante. Arregle estos esferoides con 500 microlitros de 4% PFA durante una hora a temperatura ambiente. Hervir la solución de Nobel Algor al 2% en PBS usando una placa caliente con un revuelo magnético durante tres a cinco minutos para disolver el polvo auguroso por completo y enfriarlo a unos 60 grados centígrados.
Retire el PFA con una pipeta P1000, lave estos esferoides con 500 microlitros de PBS y deje que se sedimenten. Una vez asentado, deseche el sobrenadante, pipete cuidadosamente 600 microlitros de solución de ágora en el tubo de 1,5 mililitros con esferoides y coloque el tubo inmediatamente en una centrífuga con un rotor horizontal a 177 veces G durante dos minutos. Agregue una cuerda corta en el medio de la Solución Agro para quitar fácilmente el tapón del tubo.
Solidifique el tapón Agros sobre hielo, o a cuatro grados Celsius agregue 500 microlitros de PBS en el tubo de 1.5 mililitros para evitar que se seque el pellet. Adquirir imágenes de secciones esferoides usando un microscopio estereoscópico. Calcule la cantidad de solución necesaria para agregar 10 microlitros por pocillo de una mezcla de alam de calcio y homodímeros de etidio diluidos usando EBM-2 en una proporción de uno a 50.
Agregue la mezcla de tinción a los esferoides y coloque la placa en la incubadora bajo el estándar, las condiciones de cultivo de tejidos durante 30 a 60 minutos. Adquiera imágenes con un aumento de 40 X utilizando el microscopio estereoscópico de fluorescencia. En las placas del fondo en U se observó la formación de esferoides 48 horas después de la siembra de siete células MCF.
Sin embargo, la formación de esferoides no se observó en el caso de las células endoteliales o linfáticas. La siembra del MCF siete más células endoteliales o MCF siete más células linfáticas en una proporción de uno a uno también resultó en la formación de esferoides. Se registró un crecimiento secuencial dependiente del tiempo del esferoide MCF siete que osciló entre 24 y 120 horas.
El tamaño de los esferoides aumentó de alrededor de 100 micrómetros a alrededor de 200 micrómetros durante cinco días. Con una mayor tasa de crecimiento observada en los esferoides tratados con el estimulador del crecimiento. La estructura de los esferoides y la forma de sus células no mostraron anomalías después de la transfección con oligonucleótidos de control en presencia de lipofectamina.
Las células que expresan su marcador proliferativo Ki-67 se distribuyeron homogéneamente en estos esferoides. Escindido a caspasa tres tinciones de estos esferoides mostraron células apáticas después de cuatro días de cultivo. El estudio de las células en estos esferoides con CD-31 y Ki-67 reveló que el 55% de las células son epiteliales, el 45% son endoteliales y el 25% de las células están proliferando.
Para evaluar el porcentaje de células vivas y muertas, los esferoides de cuatro días de edad se tiñeron con calcio Aam y etidio-homodímero. Un esferoide recién pensado también tinción de células muertas y vivas reveló que los esferoides son muy sensibles a las condiciones de congelación. Al seguir su protocolo, asegúrese de que se utilicen células sanas para mezclar afrodita Otra cosa a recordar sería evitar dañar estas afroditas durante la tapa DP para obtener una buena sección también asegurante para paladar la afrodita antes de que el across polimerize.
Este modelo podría mejorarse aún más mediante la inclusión de otras células, como los fibroblastos involucrados en la progresión del tumor y su uso para evaluar la eficacia de los agentes terapéuticos dirigidos a un crecimiento del cáncer.
