Las aplicaciones clínicas de la tráquea con ingeniería tisular han sido limitadas debido a la estenosis del injerto y la epitelización tardía. Un modelo de ratón de reemplazo ortotópico traqueal permite el estudio de los mecanismos celulares que impulsan la regeneración. Los defectos de segmento largo de las vías respiratorias pueden exceder lo que las terapias actuales son capaces de curar.
La tráquea con ingeniería tisular ofrece el potencial de crear un órgano de reemplazo para estas condiciones. Este modelo se puede aplicar a animales con propiedades transgénicas y de trazado de linaje. A continuación, podemos modular los factores del huésped que contribuyen a la regeneración del injerto.
Uno de los desafíos clave en la producción de los andamios será medir y determinar que los parámetros de electrospinning son los mismos cada vez. Así que cada vez que se produce un andamio, es necesario medir la distancia de punta a colector, la humedad y la temperatura para asegurar que los andamios son los mismos cada vez. Crítico para el éxito de este modelo es el refinamiento de las técnicas microquirúrgicas y el mantenimiento del plano correcto de la anestesia para permitir la ventilación espontánea durante todo el procedimiento.
Dado que la tráquea huésped tiene un diámetro interno de alrededor de un milímetro, el manejo del tejido nativo y el manejo del tejido nativo y la colocación de la sutura son importantes y se demuestran mejor visualmente. Comience por disolver el tereftalato de polietileno ocho por ciento, o PET, en hexafluoroisopropanol y calentar la solución resultante a 60 grados Celsius. Mientras se calienta la solución, disolver tres por ciento de peso de poliuretano, o PU, en hexafluoroisopropanol, combinando las soluciones una vez que la solución PET se haya enfriado.
Cargue una jeringa de 60 mililitros equipada con una aguja de punta contundente de calibre 20 con la mezcla de polímeros. Utilice la jeringa y una fuente de alimentación de CC de alto voltaje establecida en 14 kilovoltios positivos en la aguja, otra fuente de alimentación de CC de alto voltaje establecida en menos tres kilovoltios, una velocidad de flujo de cinco mililitros por hora y una distancia de 20 centímetros de punta a sustrato para electrospiner el polímero en una varilla de acero inoxidable de un milímetro de diámetro girando a 350 rotaciones por minuto. Continúe electrospinning hasta que se alcance un espesor de pared de andamios de 300 micrómetros.
A continuación, deslice el andamio de la varilla, coloque el andamio al vacío durante la noche para eliminar cualquier disolvente residual y esterilizar el andamio con una dosis de luz ultravioleta de 350 milólios por centímetro cuadrado durante unos 15 minutos. En condiciones estériles, retire la piel de las extremidades traseras de un ratón C57-Black/6 de seis a ocho semanas de edad con tijeras finas y fórceps micro-Adson, y utilice los fórceps Dumont número cinco y los fórceps Dumont número 5/45 para eliminar la fascia y los tendones. Separe los huesos para permitir que cada uno de ellos se corte en ambos extremos, y utilice una jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 25 para lavar la médula ósea en un plato de Petri que contenga 30 mililitros de medio RPMI.
Cuando todos los huesos hayan sido lavados, filtre la médula ósea a través de un colador de células de nylon de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros, y transfiera el tubo a un gabinete de bioseguridad. Agregue suavemente la solución celular mononuclear filtrada por el lado de un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de polisucina y diatrizoato de sodio sin mezclar las capas, y separe el plasma de los glóbulos blancos y rojos por separación de gradiente de densidad. Al final de la centrifugación, recoger la capa transparente media que consiste en las células mononucleares de la médula ósea, y lavar las células mononucleares de la médula ósea en una proporción de uno a uno en PBS por centrifugación.
Resuspender el pellet en cinco mililitros de PBS para un segundo lavado, seguido de resuspensión en 10 mililitros de medio DE RPMI fresco para el recuento. Luego, recoger las células con una centrifugación adicional, y diluir las células a una por 10 a las siete células por cinco microlitros de concentración de RPMI fresca. Antes de sembrar el andamio, corte el polímero a una longitud de cinco milímetros según sea necesario, y moje el andamio con cinco microlitros de RPMI medio durante cinco minutos.
Al final de la incubación, retire el exceso de medio y cargue el lumen del andamio con cinco microlitros de la solución de célula mononuclear de médula ósea durante 10 minutos. A continuación, inserte una aguja de calibre 21 a través del lumen del andamio y coloque el injerto en un mililitro de RPMI medio durante la noche en una incubadora de grados Celsius de 37 grados. Después de la inducción de la anestesia general, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo del ojo en el animal receptor, y aplique un ung ón en los ojos del animal.
Sujeta el cabello en el sitio quirúrgico de la barbilla a las clavículas, y coloca el animal en una almohadilla quirúrgica en una posición dorsal reclinado. Usando una técnica aséptica, desinfecte el sitio quirúrgico con un povidona-yodo secuencial, 70%etanol, serie de toallitas de yodo povidona, y mueva el ratón bajo un microscopio diseccionado con la cabeza a las 12 en punto. Utilice tijeras finas y fórceps micro-Adson para hacer una incisión de línea media desde las clavículas hasta el hueso hioides, y utilice Dumont número cinco y el número siete fórceps finos y un hisopo de algodón estéril para limpiar la fascia antes de insertar un retractor Colibri autoconservable en la incisión.
Usa los fórceps para abrir los músculos de la correa para exponer el cartílago tiroideo, el cartílago cricoide y la tráquea, y separa la tráquea de los nervios laríngeos recurrentes que corren paralelos a ambos lados del tejido, seguidos de la separación circunferencial de la tráquea del esófago. Usando una aguja de calibre 20 y un marcador quirúrgico, manche la porción anterior de la tráquea. Haga una incisión debajo del tercer anillo de cartílago traqueal usando un par de tijeras de resorte Vannas-Tubingen y un par de fórceps finos número de Dumont para resecar una sección de tres anillos de la tráquea.
Sosteniendo la tráquea con los fórceps curvos finos, utilice una sutura de nylon estéril 9-0 para asegurar el extremo distal de la tráquea al esternón para crear una traqueotomía temporal, y utilice la aguja del calibre 20 y el marcador quirúrgico para manchar la porción anterior del injerto anterior. Para implantar el injerto, utilice una sutura de nylon estéril 9-0, Dumont número siete fórceps finos, y un soporte de aguja para insertar los puntos posteriores proximales, laterales proximales y proximal-anteriores, y gire el animal 180 grados. Cuando el ratón esté en posición, suelte la traqueotomía temporal y haga una incisión lateral a cinco milímetros de distancia de la parte anterior del injerto para facilitar la anastomosis distal.
Para completar la anastomosis distal, coloque las suturas de manera similar a la anastomosis proximal, y vuelva a aproximar la posición del injerto y los músculos de la correa. Luego, cierre la incisión con suturas de nylon estériles 9-0 en un patrón de carrera, y coloque el animal solo en una jaula de recuperación colocada en una almohadilla de calentamiento con monitoreo hasta la recuperación completa. Dos semanas después de la implantación, algunas células epiteliales basales pueden observarse mediante queratina de células basales cinco y 14 manchas en secciones de tejido de injerto traqueal con ingeniería tisular.
Las células basales también se detectan en la superficie luminal del injerto a los siete días después de la implantación. Tras la explantación y el análisis histológico, la estenosis del injerto se ha identificado como el principal factor que contribuye en ratones implantados por injertos que demuestran signos de dificultad respiratoria y estridor. Tenga en cuenta que el telescopio del injerto y la tráquea nativa es un hallazgo común como resultado de la técnica quirúrgica.
La tinción de F4/80 revela macrófagos host dentro de la región estenótica del injerto junto con la presencia de las células epiteliales basales. Evite la manipulación de los nervios laríngeos recurrentes y asegúrese de que las suturas proximales y distales estén en su lugar para permitir un sello hermético en la anastomosis. Como este protocolo trata de células mononucleares de médula ósea derivadas de ratones agente de nivel de bioseguridad de un agente, es importante llevar un equipo de protección personal adecuado para evitar la contaminación.
