Este trabajo fue apoyado por las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá. Microfabricación se realizó con el apoyo de la instalación McGill nanoherramientas Microfab en la Universidad McGill y el Departamento de Electrónica de la Universidad de Carleton.

La sangre se recoge de los individuos sanos, con la aprobación del comité de ética de la Universidad de Ottawa (H11-13-06). 1. Microchannel Fabrication Los microcanales son fabricados en base a los métodos estándar de fotolitografía 18. <ol><li> Diseñar la geometría microcanal utilizando un diseño (CAD) asistido por ordenador e imprimir la configuración en una transparencia foto-máscara. Estas máscaras son cruciales ya que dictan la trayectoria de la luz durante el proceso de fabricación. En este caso, las dimensiones de microcanales son 120 micras de espesor, 60 micras de profundidad y 7 mm de longitud. </li><li> En una sala blanca, capa giro un epoxi basada negativo fotorresistente sobre una oblea de silicio a 2000 rpm durante 30 segundos para obtener la profundidad deseada microcanal (60 micras). </li><li> Exponer la oblea y la foto-máscara bajo una lámpara UV a 650 mJ / cm 2 para 70 seg. Asegurar para exponer sólo las áreas transparentes de lafoto-máscara a la luz UV. La exposición de las áreas transparentes permite para la polimerización de las cadenas resultantes en un endurecimiento de la foto-resistir. Sumergir la pieza de silicio en un desarrollador para eliminar el exceso de foto-resistencia. </li><li> Una vez que el molde se fabrica, mezclar un elastómero a base de silicio y un agente de curado en una proporción de 10: 1 para crear una solución de poli-dimetil-siloxano (PDMS). Ponga la solución de PDMS en una cámara de vacío para desgasificar. Vierta en el molde y se calienta a 60 ° C durante 90 min para crear microcanales. Luego unir los canales individuales a un portaobjetos de vidrio utilizando oxígeno unión de plasma durante 90 segundos. Nota: El proceso de PDMS desgasificar se lleva a cabo con el fin de eliminar las burbujas de aire generadas por el proceso de mezcla. </li><li> Asegúrese de que las dimensiones microcanales permiten pruebas con éxito. En este protocolo, los microcanales tienen una sección transversal rectangular de 120 x 60 m. En comparación, un RBC promedio tiene un diámetro de 8 micras y un espesor de 2 micras. Losrefore, el ancho de microcanales es suficiente para observar la agregación adecuada y determinar con precisión los perfiles de velocidad. </li></ol> 2. Preparación de Sangre <ol><li> Recoger la sangre de donantes voluntarios sanos, después de la aprobación de un comité de ética. Tratar la sangre con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) presente en los tubos de recogida (7,2 mg de EDTA en 4 ml de sangre). NOTA: El EDTA se utiliza para evitar la coagulación de la sangre. </li><li> Centrifugar las muestras de sangre tres veces durante 10 min a 1.400 xg (3.000 rpm) con el fin de separar los constituyentes de la sangre. Como resultado de la centrifugación, observar tres capas distintas. NOTA: Las tres capas son la capa de RBC (situado en la parte inferior del tubo), la capa leucocitaria (que consiste en células blancas de la sangre y plaquetas situadas en la parte superior de la capa de RBC) y la capa de plasma (que se encuentra en la parte superior de todos los demás constituyentes). <ol><li> Después de la primera centrifugación, recoger plasma de sangre usando una pipeta de sangre. Evite cualquier contacto con la capa leucocitaria. </li><li> Recoger y disponer de la capa leucocitaria en un recipiente con lejía diluida al 10%. </li><li> Añadir 3 ml de PBS pH 7,4 a cada uno de los tubos con la capa de RBC restante y garantizar el equilibrio apropiado de la centrífuga. Mezclar suavemente los tubos de centrífuga y una vez más en 1.400 xg (3.000 rpm) durante 10 min. NOTA: Asegúrese de que la solución de PBS no contiene magnesio o calcio ya que podrían alterar la adhesión celular. </li><li> Deseche la PBS en los tubos después de la segunda centrifugación y retire la capa leucocitaria restante si está presente. Repita los pasos 2.2.3 y 2.2.4 para la tercera centrifugación para producir glóbulos rojos limpios. </li></ol></li><li> Mezclar la cantidad requerida (0,05, 0,1 y 0,15 ml) de los glóbulos rojos limpias con plasma (0.95, 0.9 y 0.85 ml) en un tubo de 1 ml a fin de obtener RBC-suspensiones con el correspondiente (5%, 10% y 15% ) hematocrito. Compruebe hematocritos con una microcentrífuga. </li></ol> 3. Líquidos Preparación <ol><li> Añadir 60 l de la solución de partículas de trazador fluorescente (1% sólido, partícula d = 0. 86 m, λ = 542 nm abs y emisión λ = 612 nm) en los tubos de suspensión RBC-1 ml. NOTA: Las partículas de trazador fluorescente (teñidos internamente partículas de poliestireno) se utilizan para medir la velocidad del flujo dentro del microcanal. Estas partículas son fluorescentes cuando se exponen a la longitud de onda correspondiente del haz de láser (λ = 542 nm). </li><li> Preparar una solución de PBS pH 7,4 y añadir 60 l de la misma solución de partículas de trazador fluorescente en 1 ml de la solución de PBS. </li></ol> 4. Agregados Tamaño Mediciones <ol><li> Para insertar los fluidos (RBC-suspensiones y PBS) en el microcanal, utilice dos jeringas de vidrio de 25 ly 100 l. Esto haráayudar a reducir el cumplimiento del sistema. Conecte los microcanales a las jeringas a través de tubos y conectores encajan los orificios de entrada. Llenar las jeringuillas de vidrio utilizando la diferencia de presión existente entre el recipiente de fluido y la jeringa. Asegúrese de que no hay burbujas presentes en el sistema. Como un método alternativo, utilizar un sistema de presión controlada para conducir ambos fluidos en el microcanal. </li><li> Coloque el microcanal en un escenario microscopio invertido conectado a una cámara de alta velocidad y un sistema μPIV. La bomba de jeringa a los caudales deseados (por ejemplo, Q = 2 l / h para la sangre engendrar un caudal de Q = 8 l / h para PBS) Programa. NOTA: sólo se utiliza una bomba de jeringa. El uso de dos jeringas de vidrio diferentes, con dos diámetros internos diferentes, es posible variar el caudal que entra en cada rama de la Y-microcanal. </li><li> Inserte los dos fluidos en el doble Y-microcanal cada uno de una rama de entrada diferente y en diferentes caudales como se muestra en <strong&gt; Figura 1. Con el fin de probar diferentes velocidades de cizallamiento, cambiar el caudal de la bomba. Esto mantiene la misma proporción adecuada (4 en este caso) entre las dos ramas 19 (Figuras 2 y 3). Espere a que el flujo de alcanzar el estado de equilibrio antes de la adquisición de las mediciones: inspeccionar visualmente las imágenes de la cámara de alta velocidad para un flujo suave. NOTA: La relación es crucial en la obtención de un perfil de velocidad lineal dentro de la capa de sangre. </li><li> Visualice los glóbulos rojos con la cámara de alta velocidad. Conecte la cámara a un ordenador para controlar, registrar y guardar las imágenes del flujo de fluido. Una vez que los dos flujos de fluidos alcanzan el estado de equilibrio, iniciar la grabación. <ol><li> Adquirir varias imágenes para mejores resultados del tratamiento. Determine un tiempo de exposición de la cámara óptimo para una imagen clara de los agregados. NOTA: El tiempo de exposición de la cámara para este caso fue de 0,5 mseg. La elección del intervalo de tiempo entre cada trama se basa en la velocidad de cuadros de la cámara y la velocidad de flujo en tque microcanal. El tiempo entre cada fotograma procesado en este procedimiento fue de 60 mseg. Por lo tanto una cámara capaz de grabar 18 fotogramas por segundo es suficiente. NOTA: Evite el asentamiento de sangre en el tubo y la jeringa, lo que podría conducir a mediciones erróneas. </li></ol></li><li> Usando técnicas de procesamiento de imágenes (un programa MATLAB en este caso) para mejorar la calidad de la imagen, detectar los agregados en cada una de las imágenes sobre la base de intensidades de los píxeles (ilustrados en la Figura 4) como sigue: <ol><li> Mejorar las imágenes contrastan con el método de ecualización del histograma para obtener una mejor calidad de imagen para cada cuadro. </li><li> Convertir las imágenes en escala de grises en imágenes binarias. Para este propósito, establecer un valor umbral, que van desde 0 a 1, que dicta la conversión de cada píxel. Cualquier píxel en la imagen debajo del valor umbral será detectado como un píxel negro, mientras que los píxeles con valores mayores que el umbral serán detectados como píxeles blancos. </li><li> Llenar elagujeros (si está presente y necesario) que corresponden a las lagunas dentro de un agregado para obtener mejores resultados. </li><li> Detectar las células mediante la determinación de vecinos píxeles blancos en la imagen binaria de modo que las células adyacentes están asociados como agregados. </li><li> Etiquetar los diferentes agregados detectados y convertir la imagen binaria en una imagen verde-azul-rojo (RGB) para una mejor visualización. Combinar los fotogramas originales con cada una de las correspondientes imágenes procesadas para verificar la eficiencia de la técnica de procesamiento de imagen y asegurar que todas las células se toman en consideración, como se muestra en la Figura 5. Realice los pasos 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 y 4.5.5 para todas las tramas capturadas. </li><li> Calcular el área de cada agregado detectado en el marco basado en el número de píxeles detectados. Sobre la base de la ampliación de la lente utilizada, calcular el factor de conversión, utilizando una retícula de calibración, y convertir los resultados a 2 micras. La media de los tamaños de los agregados detectadas en cadamarco y luego un promedio de los resultados para todos los marcos para obtener el tamaño total promedio para cada grabación de RBC-suspensiones. </li><li> Calcular el área de un RBC para determinar un número representativo estimado de glóbulos rojos dentro de cada agregado detectado. El uso de estos resultados, calcular la distribución del porcentaje de glóbulos rojos dentro de cada agregado como una función de los tamaños de los agregados (representados por el número estimado de células en cada agregado), como se muestra en la Figura 6. NOTA: Para medir los agregados de RBC, el software ImageJ podría ser utilizado (en lugar de MATLAB) para realizar las mismas tareas en cada fotograma. </li></ol></li></ol> 5. velocidad del fluido y Shear Puntúa Mediciones Determinar la velocidad del fluido y por lo tanto la velocidad de cizallamiento utilizando un sistema de μPIV. <ol><li> Una vez que los datos se adquiere mediante la cámara de alta velocidad, cambiar a la cámara de doble pulsado utilizado para el sistema μPIV. Utilice un software de imagen para una imagen acquisition del flujo y el procesamiento de imágenes para la determinación de campo de velocidad. </li><li> Tome todas las precauciones necesarias, en función de la clase de láser, antes de encender el láser. A continuación, encienda el sistema, la cámara y el láser. </li><li> Calibrar la cámara basada en la ampliación del objetivo utilizado. Para este propósito, utilizar una microescala de 10 micras de precisión bajo el microscopio y establecer el tamaño de 1 pixel en la imagen. </li><li> Inicie el láser y visualizar las partículas en ambos fluidos. Encuentra el plano medio de los microcanales, centrándose en las partículas más rápidos del caudal (es decir, las partículas más rápidas deben ser el más brillante). </li><li> Ajuste el dt (intervalo de tiempo entre dos tramas consecutivas) para garantizar el desplazamiento adecuado de la partícula. Las partículas más rápidas deben moverse aproximadamente 5 a 10 pixeles entre ambas imágenes. </li><li> Comienza la grabación del flujo. Ajuste el software para adquirir 100 pares de imágenes, 5 ms de diferencia. Realice los pasos 5.4, 5.5 y 5.6 para toda la difdife- RBC-suspensiones y para diferentes velocidades de cizallamiento. NOTA: Más detalles de la metodología se dan en el estudio de Pitts y Fenech 20. </li><li> Procesar las grabaciones adquiridos utilizando el método de correlación cruzada con el software de imágenes. NOTA: Este consiste en discretizar el par de imágenes en ventanas pequeñas de tamaño predeterminado (basado en el flujo de fluido y el intervalo de tiempo elegido por el usuario) llamado ventanas de correlación y siguiendo el desplazamiento de las partículas en cada ventana. <ol><li> En primer lugar, determinar si las imágenes adquiridas requieren pre-tratamiento (incluida la sustracción de fondo, &quot;base-clipping&quot; 21 o una imagen superpuestos 22,23) para un mejor tratamiento de la información. </li><li> A continuación, seleccione el tamaño y la forma de la ventana de correlación, así como del porcentaje de imágenes superpuestas. Un estudio detallado se realizó por Pitts et al. 24 para determinar los parámetros óptimos y las técnicas de pre-procesamiento de imagen para la sangrefluir en diferentes configuraciones de canal. Exprese los resultados como un campo de velocidad media calculada a partir de los pares de 100 imágenes y el error cuadrático medio (RMS) de la velocidad. </li></ol></li><li> Extraer un perfil de velocidad en la salida del canal, a partir de los datos procesados ​​como se muestra en la Figura 7. Para un mejor perfil, promediar el campo de velocidad en el espacio. NOTA: Las barras que componen el perfil de velocidad se corresponde con el tamaño de la ventana de correlación elegido con relación a la anchura del canal. También se muestra el error RMS de la velocidad en la Figura 7, que representa el error en la estimación experimental velocidad. </li><li> Apague el láser una vez que se llevan a cabo todas las medidas y el procesamiento ,. Apague todos los componentes del sistema: software, cámaras, fase móvil, computadoras y láser. </li><li> Para calcular la velocidad de cizallamiento, primero detectar y estimar el espesor de la sangre en los microcanales en función de la grabación de la cámara de alta velocidad. Para este propósito, promedio Todoslos fotogramas de la grabación específica para obtener una imagen de fondo del vídeo. Delimitar la capa de sangre (como se muestra en la Figura 8 para los RBC-suspensiones que fluye a 10 l / hr cuando se suspenden en 5%, 10% y 15% de hematocrito). Obtener el valor de velocidad para el espesor de la capa de sangre correspondiente y calcular la velocidad de cizallamiento dividiendo el valor de la velocidad por el espesor de la capa de sangre. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Utilizando la presente metodología, es posible analizar cualitativa y cuantitativamente el RBC agregados bajo diferentes condiciones de flujo y hematocritos. Para las pruebas de éxito y la detección agregada, es crucial para determinar la relación de velocidad apropiada entre los dos fluidos en la entrada de microcanal. Esta relación es muy importante para obtener un espesor de capa de sangre óptimo donde el perfil de velocidad es casi lineal 19. Otro factor clave para la pr...

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Glóbulos rojos (GR) juegan un papel crucial en la determinación del comportamiento reológico de la sangre. Son casi singularmente responsable de las propiedades particulares de la sangre in vitro e in vivo. En condiciones fisiológicas, los glóbulos rojos ocupan 40% a 45% del volumen de sangre. En la microcirculación, los glóbulos rojos solamente ocupar hasta el 20% del volumen de la sangre debido a diámetros de los vasos más pequeños y el efecto plasma 1 descremado. Este fenómeno de reducción de plasma en la microcirculación se conoce como el efecto Fåhraeus. A bajas velocidades de cizalla, los glóbulos rojos son capaces de tender un puente juntos y formar uno dimensional o estructuras tridimensionales denominadas &quot;rouleaux&quot; o agregados, por lo tanto, contribuir al comportamiento no newtoniano de la sangre. Sin embargo, el mecanismo de la agregación de RBC no se entiende completamente. Existen dos teorías para modelar la agregación de glóbulos rojos: el puente de la teoría de las células debido a la reticulación de las macromoléculas 2 y la fuerza attracla teoría de la causada por el agotamiento de las moléculas debido al gradiente osmótico 3. Típicamente, para la sangre humana, los agregados forman a velocidades de cizallamiento muy bajas 4 que van de 1 a 10 seg -1. Por encima de este rango, los glóbulos rojos tienden a desagregar y fluir por separado dentro del recipiente. La comprensión de las condiciones de la formación de agregados es de una gran importancia para el campo Hemorreología en términos de definir el comportamiento reológico de la sangre. Estos agregados se ven a menudo en el nivel macrocirculation (&gt; 300 m de diámetro) 5. A esta escala, la sangre se considera como un fluido newtoniano y una mezcla homogénea. Sin embargo, estos agregados se ven raramente en el nivel capilar (4-10 micras de diámetro) y son por lo general una indicación de condiciones patológicas tales como la diabetes y la obesidad 6. Otras condiciones patológicas que podrían cambiar la agregación de glóbulos rojos incluyen condiciones inflamatorias o infecciosas,enfermedades cardiovasculares tales como hipertensión o aterosclerosis, trastornos genéticos y las enfermedades crónicas 7. Por lo tanto, la comprensión del mecanismo de agregación de RBC y análisis de estas entidades (mediante la definición de una relación entre el tamaño de estos agregados y las condiciones de flujo) podría conducir a la comprensión del comportamiento microrheological de la sangre y por lo tanto relacionarlo con aplicaciones clínicas. Agregados de glóbulos rojos pueden ser alterados por diversos factores tales como el hematocrito (volumen de glóbulos rojos en la sangre), la velocidad de cizallamiento, el diámetro del vaso, la rigidez de la membrana RBC y la composición de medio de suspensión 8-10. Por lo tanto, se requieren condiciones controladas con el fin de analizar de forma eficaz los agregados de glóbulos rojos. Varios métodos son capaces de analizar la formación de agregados al proporcionar mediciones de agregación estáticos (índice de agregación) que ofrece información relevante sobre el comportamiento de la sangre. Estos métodos incluyen, entre otras cosas, la velocidad de sedimentación globularmétodo 11, el método de transmisión de la luz 12, el método de reflexión de la luz 13 y el método de la viscosidad de baja cizalladura 14. Pocos estudios han tratado de estudiar la agregación de glóbulos rojos y determinar el grado de agregación en condiciones de flujo controladas 15-17. Sin embargo, estos estudios investigan indirectamente RBC tamaños de agregados mediante la determinación de la proporción de espacio ocupado en un sistema de cizallamiento medido basado en imágenes microscópicas de sangre que proporcionan información sobre el grado de agregación, así como la viscosidad local. Por lo tanto, presentamos un nuevo procedimiento para cuantificar directamente RBC agregados en la microcirculación, de forma dinámica, bajo velocidades de cizallamiento controladas y constantes. RBC-suspensiones son arrastradas, en una doble Y-microcanal (como se ilustra en la Figura 1), con una solución tampón fosfato salino (PBS) por lo tanto la creación de un flujo de cizallamiento en la capa de sangre. Dentro de esta sangre capa un karité constantetasa r puede ser obtenida. Los RBC-suspensiones se ensayaron a diferente hematocrito (H) niveles (5%, 10% y 15%) y bajo diferentes velocidades de cizallamiento (2-11 seg -1). La velocidad de la sangre y la velocidad de cizallamiento se determinan mediante un sistema de micro Velocimetría imágenes de partículas (μPIV), mientras que el flujo se visualizaron utilizando una cámara de alta velocidad. Los resultados obtenidos se procesan entonces con un código MATLAB basado en las intensidades de imagen con el fin de detectar los glóbulos rojos y determinar tamaños de agregados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SU8-50 epoxy based negative Photo-resist</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-50 developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-50 series Plasma system&#160;</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td>PE-50 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>B367861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poshpate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracer fluorescent particles solution (15 mL)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>R800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggregometer</td>
			<td>RheoMeditech</td>
			<td>Rheo Scan AnD300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringes (50 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing (Tygon)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>AAA00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed camera (Basler)</td>
			<td>Graftek Imaging Inc.</td>
			<td>basler acA2000-340km</td>
			<td>A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double pulsed camera&#160;</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Imager Intense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope MITAS</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>MITAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nd:YAG laser</td>
			<td>New Wave Research</td>
			<td>Solo-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)</td>
			<td>Chemyx Inc. and Harvard Apparatus</td>
			<td>Nexus3000 and PicoPlus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DaVis software</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Davis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation

La sangre, como biofluido no newtoniano, representa el foco de numerosos estudios en el campo Hemorreología. Constituyentes de la sangre incluyen glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas que se encuentran suspendidas en el plasma sanguíneo. Debido a la abundancia de los glóbulos rojos (40% a 45% del volumen de sangre), su comportamiento dicta el comportamiento reológico de la sangre especialmente en la microcirculación. A velocidades de cizallamiento muy bajas, los glóbulos rojos se ven de montar y entidades forma llamada agregados, lo que provoca el comportamiento no newtoniano de la sangre. Es importante entender las condiciones de la formación de agregados de comprender la reología de la sangre en la microcirculación. El protocolo descrito aquí detalla el procedimiento experimental para determinar cuantitativamente los agregados de glóbulos rojos en la microcirculación bajo velocidad de cizallamiento constante, basado en procesamiento de imágenes. Para este propósito, RBC-suspensiones se prueban y se analizaron en microcanales 120 x 60 micras de poli-dimetil-siloxano (PDMS). Los RBC-suspensiones son entllovió usando un segundo fluido con el fin de obtener un perfil de velocidad lineal dentro de la capa de sangre y así lograr una amplia gama de velocidades de cizalladura constantes. La velocidad de cizallamiento se determina usando un sistema de micro velocimetría por imágenes de partículas (μPIV), mientras que los agregados de glóbulos rojos se visualizaron utilizando una cámara de alta velocidad. Los vídeos capturados de los agregados de glóbulos rojos se analizaron utilizando técnicas de procesamiento de imágenes con el fin de determinar los tamaños de los agregados basados ​​en las imágenes de intensidades.

Un ejemplo del flujo de dos fluidos en la doble Y-microcanal se muestra en la Figura 2 para los glóbulos rojos humanos en suspensión en 5%, 10% y 15% de hematocrito y que fluye a 10 l / hr. La Figura 3 muestra la diferencia en tamaños de agregados cuando el flujo en el canal se reduce de 10 l / hr a 5 l / h para un hematocrito de 10%. Esto da una idea cualitativa de los tamaños de los agregados cuando se varía el hematocrito y la velocidad de cizallamiento. La figura 5</str...

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Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

El protocolo describe los detalles de un procedimiento experimental para cuantificar de glóbulos rojos (RBC) agregados bajo un régimen de cizalladura controlada y constante, basado en técnicas de procesamiento de imágenes. El objetivo de este protocolo es relacionar tamaños de agregados de glóbulos rojos a la velocidad de cizallamiento correspondiente en un entorno controlado de microfluidos.

Medio Ambiente Microfluidic controlada de Investigación Dinámica de agregación de glóbulos rojos

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

controlled-microfluidic-environment-for-dynamic-investigation-red

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K vistas.  University of Ottawa.  El protocolo describe los detalles de un procedimiento experimental para cuantificar de glóbulos rojos (RBC) agregados bajo un régimen de cizalladura controlada y constante, basado en técnicas de procesamiento de imágenes. El objetivo de este protocolo es relacionar tamaños de agregados de glóbulos rojos a la velocidad de cizallamiento correspondiente en un entorno controlado de microfluidos. 

Video: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Plataformas microfabricated para el cultivo celular mecánico dinámico

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Investigación

Bioingeniería

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Microscopía correlativa para el análisis estructural en 3D de Interacciones Dinámicas

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

Plataforma de microfluidos para la medición de quimiotaxis de neutrófilos a partir de sangre entera sin procesar

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Grano de agregación Los ensayos para la caracterización de Putativos Moléculas de Adhesión Celular

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Totalmente automatizada de dispositivos de microfluidos para centrífuga Ultrasensible detección de proteínas a partir de sangre entera

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

3D agregación magnética Stem Cell y biorreactor de maduración para la regeneración del cartílago

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Múltiples pasos Fotolitografia variable Altura de múltiples capas con válvula dispositivos de microfluidos

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Una Cámara de microfluidos Modelo de Flujo de Transfusión de Plaquetas y hemostasia Medidas de deposición de plaquetas y la formación de fibrina en tiempo real

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...