Name: controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation
Uploaded: 2015-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation at JoVE.com

이 작품은 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회에 의해 지원되었다. 미세는 맥길 대학 맥길 나노 장비 Microfab 시설과 칼턴 대학에서 전자 공학학과의 지원으로 수행되었다.

혈액은 오타와 대학 (H11-13-06)의 윤리위원회의 승인을 건강한 사람들에서 수집됩니다. 1. 마이크로 채널 제작 마이크로 채널은 표준 포토 리소그래피 방법 (18)을 기반으로 제조된다. <ol><li> 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 마이크로 채널 형상을 설계하고 투명 포토 마스크의 구성을 인쇄 할 수 있습니다. 그것들은 제조 공정 동안 광 경로를 지시 때문에 이러한 마스크는 매우 중요하다. 이 경우, 마이크로 사이즈, 깊이 120 ㎛의 두께 60 μm의 길이 7mm이다. </li><li> 클린 룸에서는, 스핀 코팅, 에폭시 계 네거티브 마이크로 원하는 깊이 (60 ㎛ 인)을 획득하기 위해 30 초 동안 2000 rpm으로 실리콘 웨이퍼 상에 포토 레지스트를. </li><li> 웨이퍼와 650 엠제이 / 70 초 CM 2에서 UV 램프에서 포토 마스크를 노출. 단지 투명 영역을 노출 시키도록 보장자외선 빛에 포토 마스크. 투명 영역의 노광의 경화의 결과 사슬 중합 가능 포토 레지스트. 과량의 제거 현상에 실리콘 편을 담그고하는 포토 레지스트. </li><li> 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)의 용액을 만들기 위해 1 : 몰드가 제조되면, (10)의 비율로 실리콘계 엘라스토머와 경화제를 혼합한다. 탈기 진공 챔버에 PDMS 용액을 넣어. 주형에 부어 90 분 마이크로 채널을 생성하는 60 ° C로 가열한다. 90 초 동안 산소 플라즈마를 사용하여 접합 유리 슬라이드에 개별 채널을 결합. 주 : PDMS의 탈기 공정이 혼합 공정에 의해 생기게 기포를 제거하기 위해 수행된다. </li><li> 마이크로 크기가 성공적으로 테스트 할 수 있는지 확인합니다. 이 프로토콜에서, 마이크로 채널은 120 X 60 ㎛의 직사각형의 단면을 갖는다. 이에 비해 평균 RBC 8 ㎛의 직경 2 ㎛의 두께를 갖는다.refore는 마이크로 채널 너비는 적당한 응집을 관찰하고 정확하게 속도 프로파일을 결정하기에 충분하다. </li></ol> 2. 혈액 준비 <ol><li> 윤리위원회의 승인 후, 건강한 자원 봉사 기증자로부터 혈액을 수집합니다. 수집 튜브에 존재하는 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)와 피 (혈액 4 mL를 7.2 밀리그램을 EDTA)을 치료. 주 : EDTA는 혈액 응고를 방지하는 데 사용됩니다. </li><li> 혈액 성분을 분리하기 위해 1400 XG (3000 RPM)에서 혈액 샘플을 10 분 동안 세 번 원심 분리기. 원심 분리의 결과, 세 개의 서로 다른 층들을 관찰한다. 주 : 세 층 (튜브의 하단에 위치) RBC 층 (RBC 층의 상부에 위치 백혈구 및 혈소판 이루어진) 버피 코트하고 플라즈마 층 (전체의 상단에 위치한 성분). <ol><li> 첫 번째 원심 분리 후, 혈액 피펫을 사용하여 혈장을 수집합니다. 어떤 C를 피버피 코트 콘택트에. </li><li> 수집 및 10 % 희석 한 표백제 용기에 버피 코트 폐기하십시오. </li><li> 나머지 적혈구 층 튜브에 각각 PBS 산도 7.4의 3 ㎖를 추가하고 원심 분리기의 적절한 균형을 보장합니다. 조심스럽게 10 분 동안 1,400 XG (3000 RPM)에서 다시 원심 분리 튜브를 혼합한다. 주 :이 세포 부착을 변경할 수 있기 때문에 PBS 용액이 어떤 마그네슘이나 칼슘이 포함되어 있지 않음을 확인합니다. </li><li> 두 번째 원심 분리 한 후 튜브에 PBS를 폐기하고있는 경우 나머지 버피 코트를 제거합니다. 반복 세 번째 원심 분리 청소 적혈구를 생성하는 2.2.3와 2.2.4 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 해당 (5 % RBC-현탁액을 얻기 위해 10 % 내지 15 %를 1 ㎖의 튜브에서 플라즈마 (0.95, 0.9 및 0.85 mL)로 세정 적혈구의 요구량 (0.05, 0.1 및 0.15 ml)에 섞어 ) 헤마토크릿. 마이크로 원심과 적혈구 용적률을 확인합니다. </li></ol> 3. 유체 준비 <ol><li> 형광 추적 입자 용액 60 μl를 추가 (1 % 고체, D 입자 = 0. 86 μm의는, λ는 = 542 nm의 복근 은 1 ml의 RBC 서스펜션 튜브에 λ 방출 = 612 ㎚). 주 : (내부적 폴리스티렌 입자를 염색) 형광 트레이서 입자 내의 미세 유동의 속도를 측정하는데 사용된다. 레이저 빔 (λ = 542 ㎚)의 대응하는 파장에 노출 될 때 이들 입자는 형광. </li><li> pH 7.4의 PBS 용액을 준비하고 PBS 용액 1 ㎖에 동일한 형광 트레이서 입자 용액 60 μL를 추가한다. </li></ol> 4. 골재 크기 측정 <ol><li> 마이크로 채널에서의 유체 (RBC-현탁액과 PBS)를 삽입하려면, 25 μL, 100 μL의 두 유리 주사기를 사용합니다. 이 의지시스템의 컴플라이언스를 줄이는 것을 돕는다. 튜브 및 항목 구멍을 맞는 커넥터를 통해 주사기에 마이크로 연결합니다. 유체 용기와 주사기 사이에 존재하는 압력 차이를 이용하여 유리 주사기를 채우기. 기포가 시스템에 존재하지 확인. 대안적인 방법으로서, 마이크로 유체 모두를 구동하기 위해 압력 제어 시스템을 사용한다. </li><li> 고속 카메라와 μPIV 시스템에 연결 거꾸로 현미경 무대에서 마이크로 놓습니다. 프로그램 (PBS에 대한 Q = 8 μL / hr의 유량을 야기되었다 피를 예를 들어, Q는 = 2 μL / 시간) 원하는 유량에 주사기 펌프. 주 : 하나의 주사기 펌프를 사용한다. 두 개의 다른 내부 직경이 서로 다른 두 개의 유리 주사기를 사용하면, Y-마이크로 각 분기 유입 유량에 따라 달라질 수있다. </li><li> 도시 된 바와 같이 다른 항목과 다른 지점에서 유량에서 이중 Y-마이크로 유체 모두를 각각 삽입 <strong&gt;도 1. 펌프 유량을, 다른 전단 속도 변경을 테스트하기 위해. 이는 (도 2 및 3) ​​두 지점 (19) 사이 (여기서는 4) 같은 적절한 비율을 유지한다. 측정 값을 취득하기 전에, 정상 상태에 도달하는 흐름 기다리 : 육안 원활한 흐름을 위해 고속 카메라 이미지를 검사한다. 주 : 비 혈액 층 내에 선형 속도 프로파일을 얻는 데 중요하다. </li><li> 고속 카메라를 사용하여 적혈구를 시각화. 유체 흐름의 이미지를 제어, 기록 및 저장 카메라를 컴퓨터에 연결합니다. 두 유체 흐름이 정상 상태에 도달하면, 기록을 시작. <ol><li> 더 나은 처리 결과에 대한 여러 이미지를 획득. 골재의 명확한 이미지에 대한 최적의 카메라 노출 시간을 결정합니다. 참고 :이 경우 카메라의 노출 시간은 0.5 밀리 초였다. 각 프레임 사이의 시간 간격의 선택은 카메라 프레임 레이트 및 t의 유량에 기초그는 마이크로. 이 절차에서 처리 된 각 프레임 사이의 시간은 60 밀리 초이다. 따라서 초 당 18 프레임을 기록 할 수있는 카메라가 충분하다. 참고 : 잘못된 측정으로 이어질 수있는 튜브와 주사기, 혈액 정착을 피하십시오. </li></ol></li><li> 이미지 프로세싱 기술 (이 경우 MATLAB 프로그램)을 사용하여 다음과 같이 (도 4에 도시 된) 픽셀 강도에 기초하여 상기 이미지들의 각각에서 응집체를 검출, 이미지 품질을 개선한다 : <ol><li> 이미지가 각 프레임에 대해 더 나은 이미지 품질을 획득하기 위해 히스토그램 등화 방법을 사용하여 콘트라스트 향상. </li><li> 이진 이미지로 그레이 스케일 이미지를 변환 할 수 있습니다. 이를 위해, 각 화소의 변환을 지시하는 0에서 1까지의 임계 값을 설정. 임계 값보다 큰 값을 갖는 화소가 백 화소로 감지하는 동안 상기 임계 값 이하의 모든 이미지 픽셀은 흑 화소로서 검출한다. </li><li> 작성더 나은 결과를 하나의 집합 내에서의 갭에 해당하는 구멍 (현재 및 필요한 경우). </li><li> 인접 셀이 응집체로서 연관된되도록 이진 영상에 인접 백 화소를 판별하여 세포를 감지. </li><li> 검출 된 다른 집계 레이블과 더 나은 시각화를위한 빨강, 녹색, 파랑 (RGB) 이미지로 바이너리 이미지를 변환 할 수 있습니다. 화상 처리 기술의 효율을 확인하고,도 5에 도시 된 바와 같이, 모든 셀이 고려되는 것을 보장하기 위해 대응하는 처리 된 이미지들의 각각에 오리지널 프레임 수확기. 수행 단계 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 캡처 한 모든 프레임에 대해, 4.5.4과 4.5.5. </li><li> 검출 된 픽셀의 수에 기초하여 상기 프레임 내에서 검출 된 각각의 집합체의 면적을 계산한다. 사용되는 렌즈의 배율에 기초하여, 교정 레티클을 사용하여 변환 계수를 계산하고, 2 ㎛의 결과를 변환한다. 각 검출 골재 크기를 평균다음은 프레임 - RBC 현탁액 각각의 기록에 대한 평균 응집체 크기를 얻기 위해 모든 프레임들에 대한 결과를 평균. </li><li> 각 감지 집계 내에서 적혈구의 대표 추정 수를 결정하는 하나의 RBC의 면적을 계산합니다. 도 6에 도시 된 바와 같이, 이러한 결과를 이용하여, (각 집합 내의 셀들의 예상 숫자로 표시됨) 골재 크기의 함수로서 각 집합 내의 적혈구의 비율의 분포를 계산한다. 주 : RBC 응집체를 측정하기는 ImageJ에 소프트웨어는 각각의 프레임에서 동일한 작업을 수행하기 위해 (MATLAB 대신으로) 사용될 수있다. </li></ol></li></ol> 5. 유체 속도와 전단 속도 측정 유속 및 μPIV 시스템을 사용하여, 따라서 전단 속도를 결정한다. <ol><li> 데이터는 고속 카메라를 사용하여 획득되면, μPIV 시스템에 사용 더블 펄스 카메라로 전환. 화상 AC 용 영상 소프트웨어를 사용하여속도 필드 검지 흐름 및 화상 처리 quisition. </li><li> 레이저를 켜기 전에, 레이저의 종류에 따라, 모든 예방 조치가 필요 가져 가라. 그런 다음 시스템, 카메라와 레이저를 켭니다. </li><li> 사용되는 렌즈의 배율에 기초하여 카메라의 교정. 이를 위해, 현미경으로 10 ㎛의 정밀도 마이크로을 사용하여 이미지에 1 화소의 사이즈를 설정한다. </li><li> 레이저를 시작하고 두 유체의 입자를 시각화. 흐름에서 가장 빠른 입자에 초점을 맞춤으로써 마이크로의 중간 평면을 찾기 (즉, 가장 빠른 입자는 밝은해야한다). </li><li> 입자의 적절한 변위를 보장하기 위해 DT (두 개의 연속적인 프레임 사이의 시간 간격)을 설정한다. 가장 빠른 입자는 두 이미지 사이에 약 5 ~ 10 픽셀을 이동해야합니다. </li><li> 흐름을 기록 시작합니다. 이미지 백쌍, 떨어져 5 밀리 초를 취득 할 수있는 소프트웨어를 설정합니다. 모든 DIF에 대한 단계 5.4, 5.5 및 5.6를 수행ferent RBC-현탁액과 다른 전단 속도에 대한. 참고 : 방법의 자세한 내용은 피츠와 페 네치 (20)의 연구에 제시되어있다. </li><li> 이미징 소프트웨어와 상호 상관 방법을 사용하여 획득 된 기록을 처리. 주 :이 소정 크기의 작은 윈도우로 이미지 쌍 이산화 이루어져라는 상관 윈도우 및 각 윈도우에서 입자의 변위를 따르고 (유체의 흐름 및 사용자에 의해 선택된 시간 간격에 기초하여). <ol><li> 취득한 화상 데이터는 더 프로세싱 (배경 차감 &quot;베이스 - 클리핑&quot;21 또는 이미지 22,23 중첩 포함) 프리 - 프로세싱을 필요로하는 경우, 최초로 결정한다. </li><li> 이어서, 상관 윈도우 사이즈 및 형상뿐 아니라 이미지의 중첩의 퍼센티지를 선택한다. 상세한 연구 피츠 등에 의해 실시 하였다. (24)를 혈액에 대한 최적의 파라미터 및 영상 전처리 기술을 결정하는데상이한 채널 구성으로 흐른다. 100 이미지 쌍과 속도의 제곱 평균 (RMS) 오류에서 계산 된 평균 속도 필드와 결과를 표현한다. </li></ol></li><li> 도 7에 도시 된 바와 같이. 처리 된 데이터로부터, 상기 채널의 출구 속도 프로파일을 추출 나은 프로파일, 공간 속도 장 평균. 주 : 속도 프로파일을 구성하는 바는, 채널 폭에 대하여 선택된 상관 윈도우 사이즈에 대응한다. 속도의 RMS 에러는 또한 실험 속도 추정에 오류를 나타내는,도 7에 도시된다. </li><li> 모든 측정 및 처리가 수행되면 레이저를 끄고 ,. 소프트웨어, 카메라, 이동 무대, 컴퓨터와 레이저 : 모든 시스템의 구성 요소를 종료합니다. </li><li> 전단 속도를 계산하기 위해, 먼저 검출하고 고속 카메라 촬영에 기초한 마이크로 채널에서 혈액 두께를 추정한다. 이를 위해, 모든 평균특정 녹화 비디오 프레임의 배경 이미지를 얻었다. (5 %, 10 % 및 15 % 적혈구 용적률에서 정지 할 때 10 μL / 시간 흐르는 RBC-현탁액도 8에 도시 된 바와 같이) 피 층을 구분합니다. 대응 혈액 층 두께에 대한 속도 값을 구하여 혈액 층 두께에 의해 속도 값을 나누어 전단 속도를 계산한다. </li></ol>

<ol>
	<li>Perkkio, J., Keskinen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematocrit+reduction+in+bifurcations+due+to+plasma+skimming.">Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming.</a> Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).</li><li>Chien, S., Jan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+basis+of+the+mechanism+of+rouleaux+formation.">Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation.</a> Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).</li><li>Neu, B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion-mediated+red+blood+cell+aggregation+in+polymer+solutions.">Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions.</a> Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).</li><li>Schmid-Sch&#246;nbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+shear+rate+dependence+of+red+cell+aggregation+in+vitro.">On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro.</a> J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).</li><li>Pries, A. R., Secomb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+the+microcirculation.">Rheology of the microcirculation.</a> Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).</li><li>Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Red Blood Cell Aggregation. , (2011).</li><li>Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemorheological+disorders+in+diabetes+mellitus.">Hemorheological disorders in diabetes mellitus.</a> J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).</li><li>Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. , (2007).</li><li>Lindqvist, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viscosity+of+the+blood+in+narrow+capillary+tubes.">The viscosity of the blood in narrow capillary tubes.</a> Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).</li><li>Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#229;hraeus:+Evolution+of+his+concepts+in+cardiovascular+physiology.">F&#229;hraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology.</a> Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).</li><li>F&#229;hraeus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suspension+stability+of+the+blood.">The suspension stability of the blood.</a> Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).</li><li>Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+specific+red+blood+cell+aggregation+indices+via+an+automated+system.">Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system.</a> Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).</li><li>Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laser-assisted+optical+rotational+cell+analyzer+(lorca)+as+red+blood+cell+aggregometer.">The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer.</a> Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).</li><li>Rampling, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+cell+aggregation+and+yield+stress.">Red cell aggregation and yield stress.</a> Clinical Blood Rheology. , (1988).</li><li>Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+human+erythrocyte+velocity+field+and+aggregation+measurements+at+physiological+haematocrit+levels.">Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels.</a> J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).</li><li>Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+variation+of+blood+viscosity:+modelling+using+shear+fields+measured+by+a+&#181;PIV+based+technique.">Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a &#181;PIV based technique.</a> Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).</li><li>Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+variation+of+blood+viscosity+and+velocity+distributions+of+aggregating+and+non-aggregating+blood+in+a+bifurcating+microchannel.">Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel.</a> Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).</li><li>Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+red+blood+cell+aggregability+in+a+flow+chamber+by+computerized+image+analysis.">Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis.</a> Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).</li><li>Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+microfluidic+system+for+red+blood+cell+aggregation+investigation.">Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation.</a> J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).</li><li>Pitts, K. L., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-particle+image+velocimetry+for+velocity+profile+measurements+of+micro+blood+flows.">Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows.</a> J. Vis. Exp. (74), e50314 (2013).</li><li>Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+particle-image+velocimetry+of+bead+suspensions+and+blood+flows.">Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows.</a> Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).</li><li>Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+algorithms+for+microscale+particle+image+velocimetry.">Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry.</a> AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).</li><li>Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+measurement+accuracy+in+micro+PIV+by+image+overlapping.">Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping.</a> Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).</li><li>Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-particle+image+velocimetry+measurement+of+blood+flow:+validation+and+analysis+of+data+pre-processing+and+processing+methods.">Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods.</a> Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).</li><li>Bhamare, M. G., Patil, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+blood+cell+analysis+by+using+digital+image+processing:+a+preliminary+study.">Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study.</a> Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).</li><li>Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+counting+of+red+blood+cells+in+blood+cell+images+using+hough+transform.">Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform.</a> Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).</li><li>Jambhekar, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cells+classification+using+image+processing.">Red blood cells classification using image processing.</a> Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">A threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

본 방법을 이용하여, 정량적으로 분석 할 수있다 정량적 RBC 다른 유동 조건 하에서 헤마토크릿 집계. 성공적인 시험 및 골재 검출 들어, 마이크로 엔트리에서 두 유체 사이에 적절한 속도 비를 결정하는 데 중요하다. 이 비율은 속도 프로파일 19 준 선형 최적 혈중 층 두께를 얻기 위해 매우 중요하다. 성공적인 테스트를위한 또 다른 중요한 요소는 좋은 이미지 품질입...

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

적혈구 세포 (적혈구)는 혈액의 유동 학적 거동을 결정하는데 중요한 역할을한다. 그들은 거의 유일하게 생체 외 및 생체 내에서 혈액의 특정 속성에 대한 책임이 있습니다. 생리 학적 조건 하에서, 적혈구는 혈액 부피의 40 % 내지 45 %를 차지한다. 미세에서는 적혈구에만 의한 작은 혈관의 직경과 효과 1 감추고 플라즈마 혈액 부피의 20 %까지 차지한다. 미세 플라즈마 감소의 이러한 현상은 Fåhræus 효과로 알려져있다. 저 전단 속도에서, 적혈구, 따라서 혈액의 비 뉴톤 거동에 기여 함께 메우고 &quot;연전 현상&quot;또는 응집체라는 차원 1 인 또는 3 차원 구조를 형성 할 수있다. 그러나, 적혈구 응집 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 두 이론은 적혈구의 응집을 모델링 존재 : 세포 이론 브리징 인해 거대 분자 (2)의 가교 및 힘에 attrac기 이론 인해 삼투압 구배 3 분자의 고갈에 의해 발생. 일반적으로, 인간의 피를, 단위는 1에서 10 초 -1에 이르기까지 매우 낮은 전단 속도 4에 형성한다. 이 범위보다, 적혈구는 해리하는과 용기 내에서 개별적으로 흘러 경향이있다. 골재 형성의 조건을 이해하면 혈액의 유동 학적 거동을 정의의 관점에서 혈액 류 분야에 매우 중요하다. 이 집계는 종종 macrocirculation 레벨 (&gt; 300 μm의 직경) (5)에서 볼 수 있습니다. 이 규모에서, 혈액은 뉴턴 유체 및 균일 한 혼합물로 간주됩니다. 그러나, 이러한 응집체는 거의 모세관 레벨 (4-10 μm의 직경)에 보지되고 일반적으로 당뇨병 및 비만과 같은 6 병리 적 상태의 표시이다. 적혈구 응집 염증 또는 감염 조건을 포함 변경할 수있는 다른 병적 인 조건,고혈압이나 동맥 경화, 유전 질환 및 만성 질환 (7)과 같은 심혈관 질환. 따라서, RBC의 응집 메카니즘을 이해하고 (이들 골재와 유동 조건의 크기 간의 관계를 정의함으로써) 이러한 엔티티를 분석하는 혈액 microrheological 동작의 이해로 이어질 수 있으며, 이에 따라 임상 적 적용에 관한 것이다. RBC 응집체는 이러한 헤마토크릿 (혈액 내의 적혈구 용적), 전단 속도, 혈관 직경, RBC 막 강성과 현탁 매질 조성물 8-10와 같은 여러 요인들에 의해 변경 될 수있다. 따라서, 제어 된 조건을 효과적으로 RBC 응집체를 분석하기 위해 요구된다. 몇몇 방법들은 혈액 동작에 대한 관련 정보를 제공하는 정전기 응집 측량 (응집 지수)를 제공함으로써 골재 형성을 분석 할 수있다. 이들 방법은, 특히 적혈구 침강 속도를 포함방법 (11), 광 전송 방식 (12), 광 반사 방법 (13) 및 저 전단 점도 제 14. 몇몇 연구는 적혈구 응집을 연구하고 제어 흐름 조건 15-17에서 집계 된 정도를 확인하려고했습니다. 그러나, 이들 연구는 간접적 응집의 정도뿐만 아니라 로컬 점도에 대한 정보를 제공하는 미세한 혈액 화상에 기초하여 측정 전단 시스템에서 차지하는 공간의 비율을 결정함으로써 RBC에게 골재 크기를 조사. 따라서 우리는 직접 적혈구가 통제되고 일정한 전단 속도에 따라, 동적, 미세에 집계 정량화 할 수있는 새로운 방법을 제시한다. 인산 완충 식염수 (PBS) 용액이 때문에 혈액 층 전단 유동을 생성하여, (도 1에 도시 된 바와 같이) RBC 현탁액-Y-마이크로 이중에서 비말 동반된다. 이 혈액 내에서 일정한 시어 레이어R 율을 얻을 수있다. RBC-현탁액은 다른 헤마토크릿 (H) 레벨 (5 %, 10 % 및 15 %)에서와 상이한 전단 속도 (초 -1 2-11)에 따라 시험한다. 혈액의 속도와 전단 속도는 흐름이 고속 카메라를 사용하여 시각 동안 마이크로 입자 화상 유속계 (μPIV) 시스템을 사용하여 결정된다. 얻어진 결과는 다음 적혈구를 검출 골재 크기를 결정하기 위해 이미지 강도에 기초 MATLAB 코드로 처리된다.

<table><tbody><tr><td>SU8-50 epoxy based negative Photo-resist</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU8-50 developer</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184</td><td>Dow-Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 series Plasma system&amp;nbsp;</td><td>Plasma Etch</td><td>PE-50 series</td><td></td></tr><tr><td>Blood collection tubes with K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td><td>FisherSci</td><td>B367861</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, &lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt; Thermo Scientific CL2</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>Poshpate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Tracer fluorescent particles solution (15 ml)</td><td>FisherSci</td><td>R800</td><td></td></tr><tr><td>Aggregometer</td><td>RheoMeditech</td><td>Rheo Scan AnD300</td><td></td></tr><tr><td>Glass syringes (50 &amp;micro;l)</td><td>Hamilton</td><td>80965</td><td></td></tr><tr><td>Tubing (Tygon)</td><td>FisherSci</td><td>AAA00001</td><td></td></tr><tr><td>High speed camera (Basler)</td><td>Graftek Imaging Inc.</td><td>basler acA2000-340km</td><td>A camera capable of recording 18 frames per second could be used.</td></tr><tr><td>Double pulsed camera&amp;nbsp;</td><td>LaVision</td><td>Imager Intense</td><td></td></tr><tr><td>Microscope MITAS</td><td>LaVision</td><td>MITAS</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG laser</td><td>New Wave Research</td><td>Solo-II</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)</td><td>Chemyx Inc. and Harvard Apparatus</td><td>Nexus3000 and PicoPlus</td><td></td></tr><tr><td>DaVis software</td><td>LaVision</td><td>Davis</td><td></td></tr></tbody></table>

controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation

혈액은 비 뉴톤 biofluid로서, 혈액 류 분야에서 많은 연구의 초점을 나타낸다. 혈액 성분은 적혈구, 혈장에 현탁 백혈구 및 혈소판을 포함한다. 인해 적혈구 풍부 (혈액량의 40 % 내지 45 %)로, 그들의 동작은 특히 미세 혈액의 유동 학적 거동을 지시한다. 매우 낮은 전단 속도로, 적혈구는 조립 볼 수 있습니다 및 양식 개체는 혈액의 비 뉴턴 동작이 발생하는 집계를했다. 그것은 미세에서 혈액 유 동학을 이해하는 골재 형성의 조건을 이해하는 것이 중요하다. 여기에 설명 된 프로토콜은 화상 처리에 기초하여, 일정한 전단 속도하에 정량적 미세에서 RBC 응집체를 결정하기 위해 실험적인 방법에 대해 설명. 이를 위해, RBC-현탁액 시험 120 X 60 ㎛의 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 마이크로 분석. RBC-현탁액은 천만에 있습니다혈액 층 내의 선형 속도 프로파일을 구함으로써 일정한 전단 속도의 넓은 범위를 달성하기 위해 제 2 유체를 이용한 비가. RBC 응집체가 고속 카메라를 사용하여 시각화하는 동안 전단 속도는 마이크로 입자 화상 유속계 (μPIV) 시스템을 사용하여 결정된다. RBC 집합체 캡쳐 영상은 이미지 강도에 기초하여 상기 골재 크기를 결정하기 위해 화상 처리 기술을 이용하여 분석한다.

이중 Y-마이크로 채널에서 2 유체 흐름의 예는, 5 %, 10 % 및 15 % 적혈구 용적률에서 현탁하고, 10 μL / 시간 흐르는 인간 적혈구에 대한도 2에 도시되어있다.도 3으로 골재 크기 때의 차이를 나타내고 채널의 유동은 10 % 적혈구 용적률 5 μL / hr로 10 μL / 시간으로 감소된다. 헤마토크릿 및 전단 속도를 변화 할 때 응집체의 크기의 질적 개념을 제공한다. 세 개의 연속적인 프레임들에 대해, <s...

Watch this Scientific Journal Video about Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation at JoVE.com

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

프로토콜은 화상 처리 기술에 기초하여 상세를 제어하고 일정한 전단 속도 하에서 적혈구 (RBC) 응집체 정량화 실험 방법을 설명했다. 이 프로토콜의 목적은 제어 된 미세 환경에서 대응하는 전단 속도로 RBC 집합체 크기를 관련시키는 것이다.

적혈구 집계 동적 조사를위한 미세 유체 제어 환경

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

controlled-microfluidic-environment-for-dynamic-investigation-red

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K 조회수.  University of Ottawa.  프로토콜은 화상 처리 기술에 기초하여 상세를 제어하고 일정한 전단 속도 하에서 적혈구 (RBC) 응집체 정량화 실험 방법을 설명했다. 이 프로토콜의 목적은 제어 된 미세 환경에서 대응하는 전단 속도로 RBC 집합체 크기를 관련시키는 것이다. 

비디오: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Hematologic 질환의 Microvascular 상호 작용 유학을위한 Endothelialized Microfluidics

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

연구

생체공학

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

마이크로 혈액 흐름의 속도 분포 측정을위한 마이크로 입자 이미지 유속계

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 주 화성을 측정하기위한 미세 유체 플랫폼

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Microfluidic 흐름 전지를 사용하여 흐름에서 혈소판 접착 및 집계

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

생물학

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

미세 유체 흐름 챔버 지혈 및 혈소판 수혈을 모델링하기 위해 재구성 된 혈액을 사용하여<em&gt; 체외</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

혈소판 수혈 및 지혈을위한 미세 유체 유량 용기 모델은 실시간으로 혈소판 증착 및 섬유소 형성을 측정합니다

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

화학적 집단 이동을 위한 미세 유체와 통합된 견인 현미경 검사법

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

고처리량 미세 유체 장치를 사용하여 동적 환경 조건의 생성

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Single-Cell Mechanobiology Using Fluorescence Micropipette 흡인(Aspiration)

Fluorescence Micropipette Aspiration Assay to Investigate Red Blood Cell Mechanosensing

Micropipette aspiration assays have long been a cornerstone for the investigation of live-cell mechanics, offering insights into cellular responses to mechanical stress. This paper details an innovative adaptation of the fluorescence-coupled micropipette aspiration (fMPA) assay. The fMPA assay introduces the capability to administer precise mechanical forces while concurrently monitoring the live-cell mechanotransduction processes mediated by ion channels. The sophisticated setup incorporates a precision-engineered borosilicate glass micropipette connected to a finely regulated water reservoir and pneumatic aspiration system, facilitating controlled pressure application with increments as refined as &#177; 1 mmHg. A significant enhancement is the integration of epi-fluorescence imaging, allowing for the simultaneous observation and quantification of cell morphological changes and intracellular calcium fluxes during aspiration. The fMPA assay, through its synergistic combination of epi-fluorescence imaging with micropipette aspiration, sets a new standard for the study of cell mechanosensing within mechanically challenging environments. This multifaceted approach is adaptable to various experimental setups, providing critical insights into the single-cell mechanosensing mechanisms.

저자 스포트라이트: Advancing live-cell mechanobiology Through Fluorescence Microaspiration (형광 미세흡인을 통한 살아있는 세포 기계생물학의 발전)

The exploration of cellular behavior under mechanical stress is pivotal for advances in cellular mechanics and mechanobiology. We introduce the Fluorescence Micropipette Aspiration (fMPA) technique, a novel method combining controlled mechanical stimulation with comprehensive analysis of intracellular signaling in single cells. This technique investigates new in-depth studies of live-cell mechanobiology.

적혈구 메카노센싱을 조사하기 위한 형광 마이크로피펫 흡인 분석

Micropipette aspiration assays have long been a cornerstone for the investigation of live-cell mechanics, offering insights into cellular responses to ...